Abstract
Fundo
A proteína Ergp55 pertence à família Ets do fator de transcrição. As proteínas ETs são altamente conservadas em seu domínio de ligação ao DNA e envolvido em vários processos de desenvolvimento e regulação do metabolismo do câncer. Para estudar a estrutura e DNA de ligação mecanismo autoinibição de proteína Ergp55, temos produzido corpo inteiro e polipeptídeos menores de proteína Ergp55 em
E. coli
e caracterizada utilizando várias técnicas biofísicas.
Resultados
Os polipeptídeos Ergp55 contêm grande quantidade de estruturas de hélice e bobina aleatória, tal como medido por espectroscopia dichorism circular. O comprimento total Ergp55 forma uma molécula flexível e alongado como revelado por modelagem molecular, simulação de dinâmica e algoritmos de previsão estrutural. As análises de ligação dos polipeptídeos Ergp55 com sequências de DNA alvo de E74 e CFOs promotores indicam que mais fragmentos de Ergp55 (além do domínio ETS) mostrou a evidência de auto-inibição. Este estudo também revelou as partes proteicas Ergp55 que medeiam a auto-inibição.
Significância
O presente estudo vai ajudar na concepção dos compostos que estabilizam a forma inibida de Ergp55 e inibir a sua ligação ao promotor ADN. Ela irá contribuir para o desenvolvimento de drogas que alvejam Ergp55 para o tratamento de câncer de próstata
Citation:. Gangwar SP, Dey S, Saxena AK (2012) Estrutural Modelagem e DNA Binding Análise autoinibição de Ergp55, um fator crítico Transcrição em Câncer de próstata. PLoS ONE 7 (6): e39850. doi: 10.1371 /journal.pone.0039850
editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 05 de maio de 2012; Aceito: 31 de maio de 2012; Publicado: 28 Junho 2012 |
Direitos de autor: © 2012 Gangwar et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O trabalho foi apoiado pela concessão do Departamento de Ciência e Tecnologia (DST) Nova Deli, Índia (no-SR /SO /HS-05/2009). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
As proteínas da família Ets compartilhar altamente conservada domínio de ligação ao DNA hélice-volta-hélice alado e se ligam a DNA consenso sequência de núcleo 5′-GGA (a /T) -3 ‘[1]. As proteínas Erg pertencem à família Ets do fator de transcrição. gene Erg é rearranjado na leucemia mielóide humana [2] e, em 5-10% dos pacientes com o sarcoma de Ewing [3]. Em ambos os casos, as translocações cromossómicas resulta na expressão de proteínas de fusão compostas oncogénicas de ERG e membro de Tet subfamília de proteínas de ligação de ARN. proteína Erg é essencial para a hematopoiese definitiva, a função das células-tronco hematopoiéticas adulto e manutenção de números periféricos normais de plaquetas no sangue [4]. As transcrições de oncogenes de fusão TMPRSS2-ERG observadas em células de cancro da próstata estão significativamente associados com câncer agressivo, propagação metastática e aumento da probabilidade de morte [5].
O gene codifica Erg cinco proteínas, ERG-1, Erg-2 , Ergp55, Ergp49 Ergp38 e como um resultado de splicing diferentes, de poliadenilação ou codão de iniciação. A isoforma Ergp55 contém quatro domínios funcionais, que estão envolvidos na ligação de DNA, activação da transcrição e regulação negativa de transactivação [6]. As formas de proteína Ergp55 dímeros consigo próprio e com duas outras isoformas Ergp49 e Ergp38, através PNT e domínio Ets [7]. O domínio central de Ergp55 comporta-se como domínio inibidor sobre a dimerização e a sua remoção reforça a propriedade de transactivação (7). Os resíduos críticos de domínio de Ets Ergp55, que medeiam Ergp55-Jun /Fos-ADN a formação do complexo ternário, foram identificados e caracterizados [8].
Até agora, a estrutura terciária da proteína de qualquer tipo Ets comprimento completo está não determinado. No entanto, as estruturas de domínios de ligação de ADN de várias proteínas Ets tenham sido determinadas utilizando cristalografia de raios-X e técnicas de ressonância magnética nuclear [9] – [16]. A análise geral do gonome de Ets familiar ligação de DNA-
in vitro
e
in vivo
foi estudado recentemente [17].
O mecanismo preciso pelo qual, Ergp55 proteína actua sobre a transcrição não é compreendido. Para entender a estrutura e ligação mecanismo autoinibição DNA de Ergp55, realizamos dichorism circular, modelagem molecular e análise de previsão estrutural teórico sobre polipeptídeos Ergp55. Para compreender o mecanismo autoinibição de ligação ao ADN, os estudos de ligação de polipéptidos Ergp55 com sequências de ADN de E74 e cfos promotores foram realizadas. Os nossos resultados indicaram que os polipéptidos (i) Ergp55 contém elevada percentagem de α-hélice e estruturas helicoidais aleatórios (II) de comprimento completo Ergp55 é uma molécula flexível e alongado (iii) mais longos fragmentos além do domínio Ets canónica de Ergp55 demonstraram a evidência de autoinibição.
Materiais e Métodos
Construção de plasmídeos Ergp55
O comprimento total Erg
1-479 e Erg
112-399 genes foram clonados em pET28a (+ ) vector. O Erg
1-399 e Erg
307-399 genes foram clonados em pRSETA e pET21a (+) vetor de expressão. Todos os genes mutantes de eliminação foram amplificados a partir de full-length Erg
1-479 plasmídeo utilizando a reação em cadeia da polimerase.
(A) Mostrado aqui o aminoácido sequências de comprimento completo Ergp55 sem 6xHis tag e local de clivagem. Os resíduos foram destacados de acordo com o tamanho dos domínios Ergp55, NTD (amarelo), PNT (verde), CAE /CD (azul /ciano), Ets (vermelho) e CTD (preto). (B) mostrado aqui as construções Ergp55 utilizadas nas experiências (esquema de coloração mesmos, como na Fig. 1A). Os resíduos marcados que define a sequência de início e de fim de construções.
Aestericks
denotam a posição de 6xHis tag em várias construções Ergp55.
Purificação de polipeptídeos Ergp55
O Erg
1-479, Erg
1-399, Erg
112-399 e Erg
307-399 plasmídeos foram transformados em
e.
coli. BL21 (DE3) células. As células foram cultivadas em 3 litros Luria Bertani media contendo os antibióticos adequados a 37 ° C, até um valor OD
600 atingiu a 0,6. O IPTG 0,125 mM foi induzida a 37 ° C e agitar a cultura adicional durante 4 h a 220 rpm. As células foram colhidas por centrifugação a 6000X
g
durante 10 min a 4 ° C °. As células foram suspensas em 50 ml de tampão de lise contendo (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, benzamidina-HCl 1 M, 0,1% de Triton X-100, 5% de glicerol, 3 mM de 2-mercaptoetanol, de fenilmetilsulfonilo 1 mM fluoreto e 0,5 mg /ml de lisozima) e rompidas por ultra-sons a 4 ° C. O lisado em bruto foi centrifugada a 25000 ×
g
durante 20 min a 4 ° C. O sobrenadante foi carregado na coluna de Ni-NTA, pré-equilibrada com tampão de ligação (Tris-HCl a 25 pH 8,0, NaCl 300 mM, benzamidina-HCl a 1, 5% de glicerol, 2 mM de 2-mercaptoetanol, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM e imidazole a 10 mM). As proteínas foram eluídas da coluna com tampão de eluição (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, benzamidina-HCl 1 M, glicerol a 5%, 3 mM de 2-mercaptoetanol, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM e imidazole 250 mM). As fracções eluídas foram reunidas, concentradas e carregado em Sephacryl S-200 HR coluna de filtração em gel previamente equilibrada com tampão (Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 3 mM de 2-mercaptoetanol e 5% de glicerol). As proteínas purificadas foram concentradas para 10 mg /ml utilizando Amicon dispositivo de filtro de ultra-centrífuga (Mw de corte de 10 kD). A concentração de proteína foi medida por radiação UV a 280 nm utilizando um coeficiente de extinção calculado com o software ExPasy (https://us.expasy.org/tools/protparam.html).
O cromatograma de (A) completo comprimento Erg
1-479 (B) Erg
1-399 (C) Erg
112-399 e (D) Erg
307-399 polipeptídeos são mostrados. A análise de SDS-PAGE e de peso molecular calculado de cada proteína são indicados em cada cromatograma.
sequenciação de proteínas no terminal N e de pulverização iónica espectrometria de massa confirmaram a identidade e pureza de polipéptidos Ergp55. A concentração de proteína foi determinada utilizando a absorvância a 280 nm. Coomassie análise de SDS-PAGE corado com azul brilhante indicaram que todos os polipéptidos foram purificados Ergp55 maior do que 95% de pureza. Todas as proteínas foram armazenadas a -20 ° C.
ressonância de plasma de superfície da experiência
estudos
Biosensor foram realizadas usando (Biacore Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweeden) equipamento BIAcore 2000 [18]. Todas as experiências foram realizadas a 25 ° C em HBS-tampão contendo [10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 50 mM de EDTA, 0,005% de P20 como surfactante). Uma vez que todos os polipéptidos Ergp55 conter 6xHis tag quer por N ou C-terminal, o chip sensor de alta densidade contendo imobilizada de Ni-NTA é uma marca ideal para imobilizar essas proteínas. Inicialmente, as células de fluxo do chip foram activadas por passagem de solução de cloreto de níquel sobre ele. 40 ul de cada polipeptídeo Ergp55
por exemplo
., Erg
1-479 (0,14 ug /ul), Erg
1-399 (0,19 ug /ul), Erg
112-399 (0,92 ug /ul) e Erg
307-399 (0,17 ug /ul) foram injectados em células de fluxo diferentes de chip de Ni-NTA a um caudal de 10 ul /min.
nas figuras (a ) Erg
1-479 (B) Erg
1-399 (C) Erg
112-399 e (D) Erg
307-399 polipeptídeos foram imobilizadas em chips Ni-NTA. Três concentração (1, 2, 3 ^ M) da sequência de ADN do promotor E74 injectado em cada polipéptido Ergp55 imobilizada.
Em células de fluxo diferentes de chip de Ni-NTA, a seguir unidade de RU de cada polipéptido foi Ergp55 imobilizado
por exemplo
., Erg
1-479 (2904 RU), Erg
1-399 (2848 RU), Erg
112-399 (2825 RU) e Erg
307-399 (RU 247), onde um RU corresponde à proteína imobilizada de concentração ~ 1 pg /mm. As experiências de ligação foram realizadas com três diferentes concentrações de [1, 2, 3 ^ M) da sequência de ADN do promotor E74 (5 ‘TACCGGAAGT 3’) em HBS-tampão e injectado sobre Ergp55 polipéptidos imobilizados a uma taxa de fluxo de 10 ul /min. experiência semelhante foi realizada utilizando uma sequência de ADN de SEQUÊNCIA cfos promotor (5 ‘GACAGGATGTG 3’). O Sensograma autorizados a concorrer a outro 4 min. A regeneração da superfície do biossensor foi feito usando pulso de NaOH 1 mM de 30 s a um caudal de 10 ul /min. Associados e dissociação constantes cinéticas foram calculados pelo software BIAeveluation 3.0 usando simples 1:01 modelo de Langmuir com o pressuposto, que a densidade de polipeptídeos Ergp55 no chip sensor não eram altas o suficiente para suportar bivalente de ligação DNA.
Em números ( A) ERG
1-479 (B) ERG
1-399 (C) ERG
112-399 e (D) ERG
307-399 polipéptidos são imobilizados num chip de Ni-NTA. Três diferentes concentrações (1, 2, 3 M) de sequência de DNA do promotor cfos injetado em cada polipeptídeo Ergp55 imobilizado.
dichorism Circular
medições de CD foram gravadas usando Chirascan
TM CD espectropolarímetro (Fotofísica Aplicada) com um banho de água para manter a temperatura constante. Os polipéptidos Ergp55 foram diluídas a 0,2 mg /ml em tampão de fosfato de sódio 10 mM, pH 8,0 e carregado em 0,1 centímetros cuvete de quartzo. A peça em bruto de todas as experiências foi tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 8,0. O espectro final foi de uma média de três varredura seqüencial.
(A) CD espectros de Erg
1-479, Erg
1-399, Erg
112-399 e Erg
307-399 polipéptidos gravado a partir de 200 nm a 260 nm. (B) Temperatura induzida desdobramento da proteína Ergp55 comprimento total. A trama (interior) contendo elipticidade média resíduo em função da temperatura indica a desnaturação de hélices de dobrado comprimento total Ergp55.
Para o estudo desnaturação térmica de comprimento total Ergp55, o CD espectros foram registados a 10 ° incremento C começando a partir de 10 ° C a 90 ° C. Antes da medição, a célula de amostra foi equilibrada a cada temperatura. leituras de temperatura foram tomadas dentro do porta cuvette concordou com a temperatura do banho de água. Todos os dados do CD foram convertidos para significar ellipticidade de resíduos (deg. Cm
2 /dmol). O servidor Dichroweb [19] foi utilizado para estimar a quantidade de estrutura secundária em polipeptídeos Ergp55 de espectros de CD.
A estrutura secundária previsão
O SOPMA [20], GOR [21] e PSIPRED [ ,,,0],22] algoritmos foram utilizados para prever o conteúdo de estrutura secundária de comprimento completo Ergp55, que mostrou ~21% α-hélice, 12-15% β folhas e 65-69% estruturas espiral aleatória.
(a) análise programa PSIPRED de comprimento total Ergp55. (B) modelo estrutural de comprimento completo Ergp55 após análise molecular modelagem e simulação de dinâmica usando o programa GROMACS (C) A previsão desordenada feita por DISOPRED para (a), NTD (b), PNT (c), CAE /CD (d), ETS e (e), as regiões CTD de Ergp55.
Modelagem de polipeptídeos Ergp55
servidor Phyre [23] foi usado para obter a estrutura da proteína Ergp55 comprimento total (1-479 resíduos). O servidor produziu a estrutura de domínio PNT (95-221 resíduos) de Ergp55 usando o modelo de APO-2YTU (estrutura solução de domínio SAM-PNT do factor de transcrição humano amigo integração leucemia factor-1, ainda não publicado). A estrutura de RMN da solução PNT domínio (resíduos 108-201) foi obtido a partir do banco de dados de proteínas (APO-1SVO) [24]. O servidor Phyre também originou a estrutura de domínio Ets (284-412 resíduos) de Ergp55 usando o modelo APO-2NNY (Regulamento do factor de transcrição Ets-1 por ADN mediada homodimerização) [13]. A estrutura de RMN do domínio de Ets FLI1 (306-403 resíduos) foi obtido a partir do banco de dados de proteínas (APO-1FliA) [25]. A modelagem estrutural do terminal de N- (1-94 resíduos), domínio central (222-283 resíduos) e do terminal C- (413-479 resíduos) de Ergp55 não foram tentadas devido à falta de modelo de entrada.
o Modeler [26] e LOMETS enfiar [27] programas foram usados para construir a estrutura de corpo inteiro Ergp55 utilizando os seguintes entradas: (i) modelo estrutural do domínio PNT (95-221 resíduos) de Ergp55 (ii) o modelo estrutural do domínio Ets ( 284-412) resíduos de Ergp55 (iii) a estrutura de RMN do domínio PNT (108-201 resíduos) de Ergp55 e (iv) a estrutura de RMN do domínio Ets (306-403 resíduos) de FLI1. minimização de energia foi realizada em Ergp55 modelado usando Gromacs programa versão 4.0.5 [28]. 100 passos de mais íngreme decente e 500 passos de algoritmos de gradiente conjugados foram usados no cálculo de minimização de energia.
Simulações de dinâmica molecular
A 10 ns dinâmica molecular (MD) de simulação foi realizada no modelo Ergp55 minimizados usando programa GROMACS (versão 4.0.5) com campo de força Gromacs43a2 [28]. O modelo Ergp55 foi imerso em uma caixa cúbica que se estende de 0,5 nm a partir da superfície da proteína e solvatados com moléculas de água explícitas SPC. Cloreto e iões de sódio foram adicionados para neutralizar os sistemas, os quais foram então simulados com condições de contorno periódicas. O modelo Ergp55 solvatado é composto por 4832 átomos de proteína cercadas por ~390, 000 moléculas de água. Antes de executar a simulação, todo o sistema foi minimizado de energia para 200 iterações de mais íngremes descidas e depois equilibrada para átomos de proteína mantendo 20 ps contido. Todas as restrições foram removidos a partir da proteína e a temperatura foi gradualmente aumentada em passos de 10 distintos de 5 ps simulações cada.
Berendsen de acoplamento foi utilizado para manter uma temperatura constante de 300 K com uma τ constante de acoplamento de 0,1 ps. Van der Waals foram modeladas utilizando 6-12 potenciais de Lennard-Jones com cutoff 1 nm. O coulomb cortado foi de 1,0. O passo de tempo utilizado foi de 2 fs e as coordenadas foram salvas a cada 5 ps para análise de trajetórias MD.
A estereoquímica do modelo de Ergp55 simulado foi verificada por programa PROCHECK da suíte CCP4 [29]. composição estrutura secundária foi medida pelo programa DSSP [30] e visualização estrutura pelo programa de PyMOL [31].
Resultados
Purificação de polipeptídeos Ergp55 recombinantes
Produzimos corpo inteiro e polipéptidos menores (contendo subconjunto de domínios previstos) de Ergp55 em
E. coli
e purificado usando técnicas cromatográficas padrão (Fig. 1A-B). Durante a cromatografia de exclusão de tamanho, o ERG purificada
1-479, ERG
1-399, ERG
112-399 e Erg
307-399 polipéptidos eluídos em volumes correspondendo aos seus pesos moleculares (Fig. 2A-D). O comprimento total Erg
1-479 eluída com o tamanho de 53,8 kD, Erg
1-399 polipeptídeo eluída a 51,1 kD, Erg
112-399 eluída a 44,9 kD e Erg
112-399 eluiu a 15,1 kD. O Erg
1-479 e Erg
1-399 polipeptídeos têm tendência para se degradar, se manteve durante 7 dias a 4 ° C. O Erg
112-399 e Erg
307-399 polipeptídeos não se degradam ao longo do tempo e mais estável do que Erg
1-479 e Erg
1-399 polipeptídeos.
DNA os estudos de ligação que utilizam sequências promotoras e E74 cfos
A funcionalidade dos polipéptidos Ergp55 purificadas foi avaliada por ensaio de ligação do ADN utilizando a técnica de ressonância de plasmon de superfície. O observada
K
D
valor de polipeptídeos Ergp55 com a sequência de DNA do promotor de E74 foram
por exemplo
., Erg
1-479 ~ 704 nM, Erg
1- 399 ~ 217 nM, ERG
112-399 ~ 115 nM e Erg
307-399 ~ 65 nM (Fig. 3A-D). Estes resultados indicaram que o domínio de Ets Ergp55 (ERG
307-399) tem a afinidade mais elevada para a sequência de ADN do promotor E74. A afinidade de ligação DNA diminui ~ 2 vezes para Erg
112-399 polipeptídeo, ~ 3 vezes para Erg
1-399 polipeptídeo e ~ 10 vezes para full-length Erg
1-479, quando comparado com o Erg
307-399 polipeptídeo (domínio Ets). Estes resultados indicam que a N-, bem como domínios de terminal C- com respeito ao domínio Ets estão envolvidos na auto-inibição da ligação de ADN de proteína Ergp55.
O observada
K
D
valor de polipeptídeos Ergp55 com sequência de cfos promotor estavam
por exemplo
., ERG
1-479 ~ 232 mm, Erg
1-399 ~ 196 mm, Erg
112-399 ~ 38 mM e Erg
307-399 ~ 0,45 uM (Fig. 4A-D). Estes resultados também indicam que o domínio Ets tem a afinidade mais elevada para as sequências de ADN do promotor cfos. Ambos os domínios terminais N e C no que diz respeito ao domínio Ets estão envolvidos na inibição da cfos de ligação de DNA para proteínas Ergp55.
medições CD de polipeptídeos Ergp55
para identificar o conteúdo de estrutura secundária em Ergp55 polipéptidos, foi usada a espectroscopia de CD de UV distante (Fig. 5A). Os dados de CD foram de-convoluto utilizando um servidor Web DICHROWEB [19] e a percentagem de α-hélice, β folhas e estruturas helicoidais aleatórios foram estimados. Os espectros de CD de comprimento completo Erg
1-479 (Fig. 5A) mostrou dois mínimos em torno de 208 nm e 222 nm, característicos de uma estrutura α-helicoidal. Deconvolution dos dados prevê ~ 35% α-hélice, 15% β-sheet e 49% estruturas helicoidais aleatória no comprimento total Ergp55. Os dados CD de Erg
1-399 polipeptídeo prevê estruturas helicoidais aleatórios -25% α-hélice, 17% β-folha e 57%, o que mostra menos α-hélice e da estrutura β-folha de comparar com comprimento total Erg
1-479 estrutura.
Em caso de Erg
112-399 polipeptídeo, os dados do CD estima ~29% α-hélice, 15% β-sheet e 55% estruturas helicoidais aleatória. Este polipéptido contém menos α-hélice, estrutura β-folha semelhante em relação ao comprimento total Erg
1-479. Para Erg
307-399 polipeptídeo, os dados do CD estima ~31% α-hélice, 10% de β-sheet e 59% estruturas helicoidais aleatório, que tem menos α-hélice e da estrutura β-folha de comparar com comprimento total Erg
1-479 estrutura. No entanto, estes valores encontram-se perto de conteúdo de estrutura secundária da estrutura cristalina do domínio de Ets Fli-1 (35,7% α-hélice, 4,1% β-folha, 60,2% espiral aleatória). O domínio Ets de Fli-1 é o homóloga mais próximo de domínio Ets de Ergp55 [32].
termoestabilidade de comprimento total Ergp55
Para avaliar a estabilidade térmica de comprimento total Ergp55, um muito UV espectro de CD de proteína foi medida entre 10 e 90 ° C (Fig. 5B). É evidente a partir de espectros que a estrutura secundária de Ergp55 desnatura o aumento da temperatura. Quando elipticidade média resíduo em 222 nm é representada em função da temperatura, o ponto de inflexão da curva sigmoidal indica o T
m de 45 ± 2 ° C de comprimento total Ergp55.
A modelagem molecular e simulação dinâmica de corpo inteiro Ergp55
A previsão da estrutura secundária no comprimento cheio Ergp55 usando PSIPRED programa é mostrado na (Fig. 6A). Os programas Modeler e de encadeamento automática LOMETS foram utilizados para a construção de comprimento total Ergp55 modelo utilizando (i) a estrutura de 95-221 resíduos de Ergp55 usando o modelo APO-2YTU (não publicado), que tem 57% de identidade de sequência (ii) a estrutura de 284- 412 resíduos de Ergp55 usando o modelo de APO-2NNY [13] tendo 40% de identidade de sequência e (iii) a estrutura de RMN de 108-201 resíduos de Ergp55 e (iv) a estrutura de RMN de 306-403 resíduos de domínio de Ets Fli-1 que tem 90 % de identidade de sequência. minimização de energia e análise dinâmica de simulações foram feitas no modelo Ergp55 construídas, o que produziu uma estrutura flexível e alongada (Fig. 6B). A estrutura Ergp55 permaneceu muito estável durante o tempo de simulação de todo, como foi confirmado por todos os indicadores comumente utilizados para analisar a simulação MD.
As% de resíduos de Egp55 mentira modelo na região mais favorecida de Ramachandran enredo e um Z- Prosa 93 pontuação de -4,87. DISOPRED [33] A análise do modelo Ergp55 indicou que o N-terminal (resíduos 1-118) e C-terminal (resíduos 397-479) são em grande medida desordenado (a excepção da N-terminal de resíduos 4-23) e o restante da estrutura Ergp55 (119-396 resíduos) foram ordenados (Fig. 6C). O domínio PNT estruturado contém arranjo terciário de quatro hélices a, características de grande grupo de domínio SAM [34]. O domínio Ets consiste em quatro hélices e fourβ folhas, uma característica de proteínas da família Ets. Em N-terminal de domínio, 15 estiramento resíduo previsto para formar α-hélice e 3 resíduos de longa hélice (219-221 resíduos) são observadas em no CAE domínio /CD de Ergp55. As extensões de resíduos no domínio C-terminal de Ergp55 previsível que tenha uma estrutura em espiral única aleatória.
A N-terminal e o domínio C-terminal de Ergp55 está posicionado longe do domínio Ets. O sulco de ligação ao ADN de domínio ETS é exposta ao solvente e livre para se ligar sequências de ADN promotor. O domínio CAE /CD está posicionado entre PNT e domínio Ets para regular a atividade de Ergp55. Os domínios de terminal N e C-terminais de Ergp55 estão posicionados numa região que não impeçam a actividade de ligação do ADN de domínio Ets e desempenhar um papel na activação da transcrição e localização de Ergp55.
Discussão
no estudo atual, temos manifestado corpo inteiro e polipeptídeos menores de Ergp55 em
e.
coli. As combinações de dois passos de cromatografia em Ni-NTA (de afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho) produziram mais do que 95% puros Ergp55 polipéptidos baseados em espectrometria de massa e análise de SDS-PAGE. Antes de estudos estruturais, a actividade dos polipéptidos Ergp55 purificados foram verificados por estudos realizados com sequências de ADN de E74 e cfos promotores de ligação. A técnica de ressonância de plasma de superfície foi utilizado para análise de ligação. Estes resultados indicaram que polipeptídeos Ergp55 produzido em
E. coli
estavam em boa conformação e se ligam especificamente sequências de DNA de E74 e CFOs promotores com diferentes afinidades.
autoinibição de Ergp55 ligação ao DNA.
Em caso de E74 sequência do promotor, seguindo
K
D foram observados
valores para Ergp55 polipeptídeos (i) Erg
307-399, de 65 nm (ii) Erg
112-399, 115 nM (iii) Erg
1-399, 217 nM e (iv) comprimento total Erg
1-479, 704 nM. Comparação de (i) e (ii) indicaram que a região N-terminal (PNT domínios + CAE /CD) anterior ao domínio Ets inibir a ligação a DNA E74 domínio Ets. Comparação de (ii) e (iii) mostrou a evidência de aumento da inibição de ligação a ADN por ter domínio NTD no ERG
1-399 polipéptido. Comparação de (III) e (IV) indicam que a inibição adicionando domínio CTD no ERG
polipéptido 1-399 observado aumento na ligação de ADN para o domínio Ets. Estes resultados indicam que a ligação a ADN E74 Ergp55 é influenciada negativamente pela CAE /CD, PNT e domínios NTD localizado no N-terminal e um domínio localizado CTD região C-terminal em Ergp55.
com a sequência de ADN cfos promotor, sequência
K
D
valores foram obtidos para Ergp55 polipeptídeos (i) Erg
307-399, 0,4 mM (ii) Erg
112-399, 37 mM (iii) Erg
1-399, 196? M e (iv) comprimento total Erg
1-479, 232? M. Estes resultados indicam que se ligam cfos sequência promotora com afinidade diferente para os polipéptidos que Ergp55 sequência promotora E74, no entanto mecanismo de inibição de ligação ao ADN foi semelhante como observado no caso da sequência de ADN do promotor E74.
Um ADN cooperativamente na qualidade inibir região ( 468-510 resíduos) foi identificado em C-terminal do factor de transcrição Ets-1 [34]. No caso dos factores de transcrição do MTC e PEA3, dois domínios principais localizados em N- e C-terminal em relação ao seu domínio ETS- inibir a afinidade de ligação de ADN [35] – [38]. Um domínio corresponde ao resíduo resíduos 280-360 do factor de transcrição, MTC envolvidos na inibição da capacidade de ligação ao ADN do MTC. Estes domínios são ricos em resíduos de prolina em geral estruturas a-helicoidal desprovidos. O mecanismo pelo qual os dois domínios de ligação ao ADN inibem cooperativamente MTC é diferente do que o observado no caso do factor de transcrição Ets-1. A actividade de ligação do ADN de domínio Ets é dependente módulo autoinhibitory [39]. A afinidade de ligação do domínio Ets Ergp55 para E74 e cfos promotor de ADN foi consistente com a observação obtida no caso de factores de transcrição acima.
análise dichorism circular de polipéptidos Ergp55.
A técnica foi dichorism circular utilizado para identificar as estruturas secundárias e terciárias de polipéptidos Ergp55. O comprimento total e polipéptidos Ergp55 menores conter alta α-helicoidal e estruturas helicoidais aleatórios. Os dados CD estima 35% α-hélice e 49% estruturas helicoidais aleatória em proteínas Ergp55 comprimento total. Exames de estabilidade térmica e efeito da temperatura sobre a proteína Ergp55 comprimento completo indicaram que a proteína foi submetido a uma alteração da estrutura secundária após o aquecimento. A estrutura secundária é recuperada após arrefecimento da proteína de 80 ° C a 20 ° C. mudança curta da temperatura é improvável que tenha qualquer efeito sobre a estrutura secundária da proteína Ergp55.
Modelagem e Simulação computacional de corpo inteiro Ergp55.
A análise modelagem e simulação de dinâmica molecular indicou que comprimento total Ergp55 adquire uma estrutura flexível e altamente alongada. Somente os domínios PNT e ETs estão estruturados em proteínas e regiões flexíveis longas são observados em N- e C- terminal de Ergp55. A estrutura do domínio de PNT Ergp55 consiste de quatro hélices feixe Sam como a estrutura (34). O domínio Ets de Ergp55 está estruturado de uma hélice-volta-hélice voado com α esquema
1β
1β
2α
2α
3β
3β
4α
4 [40] – [41]. Os domínios /CD centrais CAE conter uma pequena hélice na posição 220. A análise de previsão secundário e desordenada em Ergp55 também apoiou a constatação observada em modelagem e simulação dinâmica de estudos de Ergp55. Todas estas observações apoiou a, não-globularity flexível e estrutura altamente alongada de proteína Ergp55.
Em conclusão, caracterizamos o comprimento total recombinante e polipeptídeos menores de Ergp55 produzido em
E.
coli. Os polipeptídeos foram purificados Ergp55 maior do que 95% de pureza tal como determinado por espectrometria de massa e análise de SDS-PAGE. Os dados estruturais aqui apresentadas demonstraram a evidência de estrutura flexíveis e altamente alongada de proteína Ergp55 comprimento completo. A análise de ligação utilizando sequências de ADN de E74 e CFOs promotores indicam que mais fragmentos de Ergp55 (além do domínio Ets canônica) mostrou a evidência de autoinibição.
Reconhecimentos
Os autores agradecem Sita R. Meena e Pratibha por suas sugestões em projeto atual. Reconhecemos a ajuda de instalação de instrumentação avançada de pesquisa (AIRF) e facilidade de instrumentação central (CIF) da Universidade de Jawaharlal Nehru por nos permitir conduzir o experimento CD. Os autores agradecem a instalação de equipamentos de SPR de AIIMS, Delhi por nos permitir conduzir a experiências de ligação DNA.