Abstract

Fundo

Embora a expressão Sox2 foi encontrado em vários tipos de câncer, ainda não tem sido usada para identificar ou isolar CSCs no carcinoma somática.

Métodos

SiHa e C33A células transfectadas estavelmente com um plasmídeo contendo Sox2 humana elementos de transcrição de condução a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) repórter foram classificadas na expressão Sox2-positivas e as populações Sox2-negativos por FACS, e Sox2 foi detectada por western blot e imunohistoquímica. As capacidades de diferenciação, auto-renovação e formação do tumor, bem como a expressão da stemness e os genes relacionados EMT do que as células cancerosas cervicais Sox2 negativo Sox2-positivos e foram caracterizados

in vitro Comprar e

in vivo

.

resultados

Um sistema /EGFP pSox2 foi usada para separar o que as células Sox2 negativo de linhas celulares de cancro do colo do útero, SiHa e células C33A Sox2-positivas e. Em comparação com as células Sox2-negativo, as células Sox2-positivo SiHa e C33A exibiram uma maior capacidade para a auto-renovação, a diferenciação e a formação do tumor. Além disso, as células SiHa e C33A Sox2-positivos expressaram níveis mais elevados de genes stemness-relacionadas, tais como Sox2 /Bmi-1 /Oct4 /ALDH1 e genes relacionados com o EMT, como vimentina /caracol /β-catenina. Tomados em conjunto, todos estes resultados indicaram que as células que expressam Sox2 endógena são CSCs em carcinomas do colo do útero.

Conclusão

Este estudo é o primeiro a estabelecer uma ligação funcional entre a expressão Sox2 endógeno e CSCs em carcinomas do colo do útero . Além disso, este estudo demonstrou que é possível desenvolver uma ferramenta para isolar CSCs de tumores somáticas com base na expressão da proteína nuclear Sox2 endógeno, em vez de marcadores de superfície celular

citação:. Liu XF, Yang WT, Xu R, Liu JT, Zheng PS (2014) células de câncer do colo do útero com Sox2 positiva Expressão apresentam as propriedades de células-tronco cancerosas. PLoS ONE 9 (1): e87092. doi: 10.1371 /journal.pone.0087092

editor: Eric Asselin, Universidade de Quebec em Trois-Rivieres, Canadá |

Recebido: 23 de julho de 2013; Aceito: 18 de dezembro de 2013; Publicação: 28 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão geral do National Natural Science Foundation da China ao Prof. Peng-Zheng Sheng (No. 30571951), uma científica subvenção do Fundo de jovens cientistas Distinguished especial (No. 30.725.043). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A célula-tronco cancerosas (CSC) hipótese sugere que as massas tumorais podem surgir a partir de uma única célula cancerosa com propriedades tronco-like. Estes CSCs são postulados para terem a capacidade de auto-renovação e diferenciação, e que pode regenerar a massa de tumor e todos os tipos de células tumorais encontradas dentro. A evidência experimental suportando a hipótese foi gerado pela primeira vez em 1997 pelo grupo de Dick, que demonstraram que a leucemia humana é impulsionado por uma pequena população de células estaminais leucémicas capazes de transferir a doença a ratinhos NOD /SCID [1]. Este conceito foi estendido para tumores sólidos por Clarke e Wicha, que demonstraram que o cancro da mama humano contém uma subpopulação de células com propriedades estaminais-como tendo a marcadores de superfície CD44

+ /CD24

– /lin

– [ ,,,0],2]. Subsequentemente, CSCs foram identificados e prospectivamente isolado a partir de uma variedade de doenças malignas, incluindo os cancros do cérebro [3], o cancro da próstata [4], o melanoma [5], mieloma múltiplo [6], o cancro do cólon [7], [8], pancreático cancerosas [9] e de cabeça e pescoço cancros [10]. No entanto, os CSCs não tenham sido identificados nos carcinomas cervicais.

A maioria dos ensaios de células estaminais do cancro têm, até agora dependeu de uma variedade de diferentes marcadores de superfície celular, incluindo CD133, CD44, CD166 e CD24. Utilizando estes marcadores de superfície, CSCs de tecidos tumorais primários podem ser enriquecidas utilizando tecnologia de FACS, e a sua propagação pode ser testada em ratinhos imunodeficientes. No entanto, os marcadores de superfície só pode ser utilizado para isolar os CSCs mais comuns, e estes marcadores são frequentemente instáveis ​​em muitos cancros somáticas [11]. CSCs enriquecido a partir de culturas primárias com base na passagem de xenotransplante de série

in vivo

foram relatados para conter uma subpopulação inconsistente após o isolamento usando os marcadores de superfície CD133 e CD44 [12]. Além disso, os resultados obtidos com os CSCs isolados usando o mesmo marcador de superfície não são consistentes entre laboratórios. Assim, torna-se necessário para procurar fabricantes citoplásmicos ou nucleares que podem ser usados ​​para o isolamento das CSCs [13].

Num estudo anterior, identificou-se a expressão do factor de transcrição embrionário haste específico de células Sox2 em tecidos de câncer cervical primário e tumorspheres formados por células de carcinoma cervical primária, e descobrimos que as funções Sox2 como um oncogene na carcinogênese cervical, promovendo o crescimento celular e tumorigenicidade [14], [15]. Os nossos resultados sugerem que Sox2 pode ser um marcador potencial para os CSCs cervicais. Além disso, Sox2 controla a pluripotência, auto-renovação e proliferação de células estaminais embrionárias. Tem sido demonstrado que as células de murino e em células estaminais embrionárias humanas e estaminais neurais têm elevada actividade Sox2 [16], [17], [18], e aumento da expressão Sox2 também foi encontrada no cancro da mama e de glioblastoma populações CSC [19], [ ,,,0],20]. Tomados em conjunto, estes dados significam que Sox2 é um marcador nuclear candidato para CSCs.

No presente estudo, estavelmente transfectadas duas linhas celulares de cancro do colo do útero, SiHa e C33A, com um plasmídeo contendo os elementos de transcrição Sox2 humana de condução expressão EGFP. Nós demonstramos que as células cancerosas cervicais Sox2-positivas compartilhadas todas as características de CSCs.

Materiais e Métodos

linhas de células e condições de cultura

As linhas celulares de cancro do colo do útero humanas SiHa, HeLa, C33A, e CaSki foram todos adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). SiHa, HeLa, e C33A células foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA). células CaSki foram cultivadas em meio de McCoy 5A (Sigma-Aldrich) com 10% de FBS.

Construção de pSox2 /EGFP

O promotor Sox2 ~11.5 kb humano foi amplificado por reacção em cadeia da polimerase (PCR ) a partir de ADN genómico SiHa com os seguintes iniciadores: para a frente, 5′-gctagcgaccacatctggctgcttgtatatttaac-‘3 e reverso, 5’-catgcggggcgctgtgcgcg-‘3. Além disso, ‘a região não traduzida (3’UTR), poli (A) da cauda, ​​e 3′ do intensificador de 3 Sox2 também foram amplificados por PCR com os seguintes iniciadores: para a frente, 5’-tgagggccggacagcgaac-‘3 e reverso, 5’- gtcgacatgagaggtgagtgcagtgcaattac-‘3. A sequência do vector de interesse, incluindo a cassete de resistência a neomicina conduzido pelo promotor de SV40 independente, e a sequência de EGFP também foram amplificadas a partir do vector pIRES2-EGFP (Invitrogen). Subsequentemente, estes fragmentos foram clonados em vectores de TOPO (Invitrogen), e a exactidão da sequência de ADN foi confirmada por sequenciação. O promotor correcta Sox2 humano, UTR /potenciador, EGFP, e o vector foram subsequentemente clonado usando um In-Fusion Kit de PCR de clonagem, e o vector resultante foi designado phSox2 /EGFP (Takara Bio Inc., Dalian, China).

a imuno-histoquímica e imunocitoquímica

a imuno-histoquímica foi realizada em secções de 4 ^ m de tecidos embebidos em parafina. secções de tecido de tumor foram sucessivamente desparafinizadas e reidratadas antes do pré-tratamento com citrato de tampão de recuperação de antigénio de sódio 10 mM (pH 6,0) numa panela de pressão a vapor. Após o tratamento com 3% H

2O

2, os seguintes anticorpos foram incubados com as secções durante a noite a 4 ° C: anti-Sox2 (1:100), anti-Ki67 (1:500), anti-ALDH1 (BD Biosciences, 01:50), anti-Bmi1 (1:100), anti-Oct4 (1:100), anti-Nanog (1:100), anti-Ki67 (1:80), anti-vimentina (1 :200), anti-caracol (1:150), anti-β-catenina (1:250), e anti-e-caderina (1:200). Todos os anticorpos foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), a menos que especificado de outra forma. As secções de tecido foram então incubadas com imunoglobulina biotinilada G (IgG) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem, as secções foram incubadas em complexo de estreptavidina-peroxidase durante 30 minutos, e a imunocoloração foi realizada usando 0,05% 3′-diaminobenzidina seguido de contracoloração com hematoxilina. Os soros de cabras ou ratinhos não imunizados foram utilizados como controlos negativos.

Além disso, as células foram cultivadas em lamelas de vidro de 48 horas, fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 minutos, e permeabilizadas com 0,3% de Triton X-100 durante 20 minutos à temperatura ambiente. Os níveis das diferentes proteínas nessas células de expressão foram determinados por imunocitoquímica, tal como descrito acima.

lâminas de tecido de TUNEL Ensaio

incluídos em parafina foram preparados a partir dos tumores de xenoenxerto. TUNEL foi detectado pelo kit de ensaio de TUNEL (Roche) segundo as instruções do fabricante. núcleos apoptóticos foram analisados ​​pela contagem do número total de núcleos TUNEL positivos, excluindo células que sofrem mitose em 10 campos aleatórios.

Western Blotting

Os lisados ​​celulares foram separados por sulfato de dodecilo de sódio a 10% (SDS ) electroforese em gel de poliacrilamida e transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno) (PVDF. Após bloqueio com 5% de leite livre de gordura em solução salina tamponada com Tris, foram usados ​​os seguintes anticorpos para a transferência de Western: anti-Sox2 (1:500), anti-ALDH1 (BD Biosciences, 1:500), anti-Bmi1 (1 :500), anti-Oct4 (1:500), anti-Nanog (1:500), anti-vimentina (1:500), anti-caracol (1:500), anti-β-catenina (1:500) , anti-caderina-e (1:500), e anti-β-actina (1:1000) durante a noite a 4 ° C. Todos os anticorpos foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology, a menos que especificado de outra forma. Após lavagem, os anticorpos ligados foram visualizados utilizando rábano anti-cabra conjugado com peroxidase, formiga-coelho ou anti-IgG de ratinho (Thermo Fisher Scientific Inc., New York, NY) e o HRP Immobilon Ocidental quimioluminescente Substrato (Millipore, Billerica, MA) e, posteriormente visualizadas em filmes de raios-X [21]

citometria de fluxo e separação de EGFP

+ e EGFP

-. Populações por FACS

linhas celulares de cancro do colo do útero foram cultivadas durante 48 horas após a transfecção com pSox2 /EGFP. As células foram digeridos e ressuspenso em PBS suplementado com 2% de FBS, e a percentagem de EGFP

+ células foi determinada utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

análise do ciclo celular foi realizada utilizando FACS de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram colhidas e fixadas em etanol a 70% durante a noite a 4 ° C. Trinta minutos antes da análise FACS, as células foram tratadas com ARNase e, subsequentemente, corados com iodeto de propídio (PI, Sigma-Aldrich). distribuição do ciclo celular foi analisada com um citômetro de fluxo FACSCalibur utilizando software LT Mod-Fit

Para obter o EGFP

+ e EGFP

-. populações, as células SiHa e C33A foram transfectadas com pSox2 /plasmídeo EGFP usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). A selecção foi realizada utilizando um meio de cultura padrão com 1 mg /ml de G418. A geração de culturas derivadas de uma única célula foi realizada utilizando um FACSAria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Os portões de classificação foram estabelecidas como a mais alta e mais baixa de 10% das células que expressam EGFP. As células foram cultivadas em DMEM /F12 com suplemento B-27 1x isento de soro (Invitrogen), 20 ng /mL de factor de crescimento epidérmico [22], e o factor de crescimento de fibroblastos básico (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ).

Formação Tumorsphere Ensaio

As células separadas foram mantidas em meio de células-tronco que consiste de meio DMEM /F12 basal, N2 e suplementos B27 (Invitrogen), 20 ng /de factor de crescimento epidérmico humano recombinante mL (EGF) e 20 ng /de factor de crescimento fibroblástico básico mL (bFGF; Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ):

Para o ensaio de formação de tumorsphere, as células foram plaqueadas a uma densidade de 200 células /cavidade em 24 cavidades de ultra. placas de fixação -Baixa ou a uma densidade de 1 célula placas /poço em 96 poços e mantidas em meio de células estaminais. Tumorspheres que surgiram dentro de 2 semanas foram registrados. Para ensaios de formação de tumorsphere série, as esferas foram colhidas, desagregada, com 0,25% de tripsina /EDTA, filtrada através de uma malha de 40 um e re-plaqueadas como descrito acima.

-PCR em tempo real

total o ARN foi extraído a partir da menor e maior de 10% das células expressando EGFP-com reagente TRIzol (Invitrogen). A concentração de ARN foi determinada, e o ADNc total era usado como um modelo para a amplificação por PCR. PCR em tempo real quantitativo foi realizado em triplicado para cada conjunto de iniciadores utilizando um sistema em tempo real IQ5 multicolorido Detecção de PCR (Bio-Rad, Hercules, CA). O protocolo de PCR em tempo real foi de 1 ciclo de 95 ° C durante 30 segundos, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos e 60 ° C durante 30 segundos, com uma fase de dissociação subsequente. O valor limite ciclo foi determinado como o ponto em que a fluorescência excedeu um limite pré-estabelecido determinado pelo software do instrumento.

Tumor Xenoenxerto Ensaio

NOD fêmea /Foram utilizados seis semanas de idade SCID para avaliar as propriedades de células-tronco

in vivo

. As células foram injectadas no tecido subcutâneo do dorso com uma mistura de 01:01 de Matrigel. O volume do tumor (V) foi determinada pelo comprimento (a) e a largura (b), como V = AB

2/2. Os protocolos experimentais foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Xi’an Jiaotong.

crescimento celular e viabilidade celular Assays

As células (2 x 10

4) foram cultivadas em triplicado em placas de cultura de 35 mm, durante 7 dias. As células foram colhidas e contadas longitudinalmente usando um hemocitómetro e um microscópio de luz. A viabilidade celular foi avaliada utilizando-se 3- (4,5-dimetiltiazol-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT, Sigma-Aldrich) corante de acordo com um protocolo padrão. O número de células viáveis ​​foi determinado medindo a absorvância a 490 nm.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o programa SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). O teste de duas caudas de qui-quadrado foi utilizado para determinar a significância das diferenças entre covariáveis. O teste t de Student foi utilizado para determinar a significância estatística quando dois grupos foram comparados. Para examinar a relação entre duas variáveis ​​quantitativas, foi realizada a análise de regressão linear de Pearson. Em todos os testes, p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Desenvolvimento do plasmídeo expressando EGFP Impulsionada por Sox2 transcricional elementos humanos

Para isolar o Sox2 endógena distinta. -expressing subpopulação e determinar se ele tem as características de CSCs, nós construímos o plasmídeo pSox2 /EGFP, que contém 11,5 kb da sequência do promotor humano Sox2 posicionado a montante do repórter EGFP. Este plasmídeo também contém o humano Sox2 3’UTR, 3 ‘poli (A) da cauda, ​​e 3’ potenciador posicionado a jusante do repórter EGFP. Além disso, uma cassete de resistência à neomicina conduzida promotor de SV40-independente foi utilizado para permitir a selecção positiva de células que adquiriram o plasmídeo independentemente da sua capacidade para activar o promotor Sox2 (Fig. 1).

esquemática do pSox2 /sistema repórter EGFP. O promotor hSox2 e elementos de transcrição, incluindo a 3’UTR, poli (A) da cauda, ​​e 3 ‘potenciador foram clonados no vector pEGFP.

Triagem estar endógena Sox2 células que expressam cancro do colo do Usando o pSox2 /EGFP sistema

expressão Sox2 foi caracterizado em quatro linhas celulares de cancro do colo do útero humano (HeLa, SiHa, CaSki, e C33A) utilizando o sistema pSox /EGFP, bem como transferência de western e análise imunocitoquímica (Fig. 2A). Sox2 era visível como coloração nuclear por imunoquímica em células individuais ou agrupados SiHa e C33A (Fig. 2B). No entanto, Sox2 não foi detectável em células HeLa ou CaSki por western blot ou análise imunoquímica (Fig. 2A e 2B). Quando pSox2 /EGFP foi transientemente transfectada em quatro linhas celulares de cancro humano do colo do útero, 6,31% e 4,10% de células positivas para EGFP-eram detectáveis ​​por FACS em células SiHa e C33A transfectadas, respectivamente (Fig. 2C). Contudo, apenas 0,84% e 0,69% de células positivas para EGFP-eram observáveis ​​nas células HeLa transfectadas e CaSki, respectivamente (Fig. 2C). EGFP positivas células compreendida menos do que 0,2% de cada linha de controlo não transfectadas de células de cancro do colo do útero (Fig. 2C), o que implica que a maioria das células positivas para EGFP-em células cancerosas pSox2 /transfectadas com EGFP cervicais foram Sox-expressando células endógenas. No geral, os resultados obtidos utilizando o sistema de /EGFP pSox2 foram consistentes com os resultados de expressão Sox2 de transferência de Western e análise imunocitoquímica em todas as quatro linhas celulares de cancro do colo do útero. Estes resultados sugerem que o sistema de plasmídeo /EGFP pSox2 é adequado para o isolamento de células de cancro do colo do útero que expressam Sox2 endógenos. Além disso, porque mais células SiHa e C33A expresso endogenamente Sox2 em comparação com células HeLa e CaSki, foram escolhidas as linhas de células SiHa e C33A para avaliar se células que expressam Sox2 endógenos são CSCs em carcinomas cervicais.

a expressão da proteína foi Sox2 detectado por western blot (a) e imuno-histoquímica (B) em linhas celulares de cancro cervical HeLa, SiHa, CaSki, e C33A. (C) A abundância de células tumorais positivas para EGFP-em linhas celulares de cancro do colo do útero transfectadas com o repórter pSox2 /EGFP. (D) a análise imuno-histoquímica de EGFP

+ e EGFP

– células. a expressão da proteína Sox2 (E) em uma monocamada, as células tumorsphere, e classificado EGFP

+ e EGFP

– células

Para obter células que expressam Sox2 vivo, células SiHa e C33A foram. transfectada com o plasmídeo pSox2 /EGFP. Após a selecção em cultura com 1,000 ug /ml de G418 durante duas semanas, todas as células resistentes a G418 foram recolhidos e classificados usando um FACSAria I; as células que caíram no 10

th e 90

th percentis de expressão EGFP foram separados e recolhidos em dois tubos separados. O primeiro tubo, que continha as células com a expressão mais elevada de EGFP, foi encontrado para conter mais do que 90% de todas as células que expressam EGFP e foi referida como a população de EGFP-positiva. O segundo tubo, que continha as células em 10% o mais baixo de expressão EGFP, só continha células EGFP-não-expressar e foi referida como a população de EGFP-negativa (Fig. 2D). Além disso, western blot e análise imunocitoquímica revelou que apenas EGFP

+ SiHa e EGFP

+ células C33A expressas proteína Sox2; EGFP

– SiHa e EGFP

– Células C33A não continha proteína Sox2 detectável (Fig 2E.). Estes resultados indicam que o sistema pSox2 /EGFP pode ser usado para células que expressam endogenamente Sox2 de linhas celulares de cancro do colo do útero com sucesso espécie viva.

As células EGFP-positivas têm uma maior capacidade de tumorigenicidade de EGFP-negativas células

Uma das características mais importantes de CSCs é a sua poderosa capacidade de formar tumores. Para testar a capacidade de formação de tumor a EGFP + células de cancro do colo do útero, as populações de células positivas a EGFP-EGFP- e ordenadas de ambas as linhas de células SiHa e C33A foram injectados subcutaneamente em ratinhos NOD /SCID. Quando 10

5 células foram inoculadas em camundongos NOD /SCID, tanto EGFP + e populações EGFP- de SiHa e células C33A tumores formados. No entanto, os tumores formados pela SiHa-EGFP

+ células cresceram muito mais rápido (Fig. 3A) e foram muito maiores (Fig 3B e 3C.) Do que os formados pelo SiHa-EGFP

– células (Fig. 3A, B e C; p 0,05). Da mesma forma, o C33A-EGFP

+ células de tumores que cresceram muito mais rapidamente e eram muito maiores do que aqueles formados por C33A-EGFP formado

– células (Fig 3D, E e F;. P 0,05). a formação de tumores em função da inoculação de diferentes diluições de EGFP

+ e EGFP

– SiHa e células C33A está resumida na Tabela 1. A frequência de iniciação de tumor da SiHa-EGFP

+ células foi 1/402 , que era 17,7 vezes mais elevada do que a dos SiHa-EGFP

– células (1/7114; p 0,001). A frequência de iniciação do tumor do C33A-EGFP

+ células foi 1/3058, que era 23,8 vezes mais elevada do que a dos C33A-EFGP

– células (1 /72,860; p 0,001), o que sugere que EGFP-positivo SiHa e da população C33A continha mais CSCs que a população EGFP-negativo. Além disso, a taxa de apoptose de células /proliferação foi avaliada em xenoenxerto (TUNEL /Ki67) para excluir a possibilidade de que a diminuição do crescimento do tumor por EGFP- células é devido a uma viabilidade celular menos, Os TUNEL e Ki67 resultados de coloração nos tecidos de xenoenxerto de células SiHa e C33A foi mostrado na Figura 3G e resumidos na Fig. 3H. Não há qualquer diferença na taxa de células positivas TUNEL e Ki67 em tecidos de xenoenxerto formadas pelas células Sox2-positiva e negativa e SiHa C33A, sugerindo que o crescimento do tumor diminuiu célula EGFP- não foi devido à viabilidade celular menos. Tomados em conjunto, todos estes resultados indicam que as células cancerosas cervicais expressando Sox2 endógenos têm melhorado significativamente a capacidade de formação de tumores porque a EGFP + SiHa e células C33A continha mais do que CSCs EGFP- células.

curvas de crescimento do tumor (a) e tumor pesos (B, C) de NOD /SCID inoculados com SiHa-EGFP

+ e SiHa-EGFP

– células (1 × 10

5 células). curvas de crescimento tumoral (D) e pesos tumorais (E, F) de NOD /SCID inoculados com C33A-EGFP

+ e C33A-EGFP

– células (1 × 10

5 células). A taxa de célula apoptose /proliferação foi avaliada por ensaios de Tunel e coloração Ki67 em xenotransplante (G e H) de EGFP + e as células EGFP-. Bares = SE. *, P 0,05. ns, p . 0,05

As células EGFP positivos Anexo uma maior capacidade de auto-renovação e diferenciação de EGFP-negativas células

Além da capacidade de formação de tumores, CSCs compartilham duas propriedades críticas com células-tronco: a auto-renovação e diferenciação. O ensaio de formação de tumorsphere é reconhecido como um ensaio clássico de auto-renovação. células SiHa e do cancro cervical C33A EGFP-positivos e EGFP-negativo foram cultivadas em meio isento de soro, em condições que foram óptimos para tumorspheres crescentes. Como mostrado na Fig. 4A, as células EGFP-positivos isolados a partir das linhas de células SiHa e C33A gerado tumorspheres clássicos, ao passo que as células EGFP-negativo formado alguns agregados de células, mas não formam tumorspheres. Para excluir os efeitos de agregação celular, que pode ocorrer em culturas de baixa densidade, as células foram cultivadas a uma densidade de 1 célula /poço após uma única célula de triagem por FACS para testar a sua capacidade de formação tumorsphere em placas de 96 poços. Cerca de 6% das células SiHa EGFP-positiva tumorspheres formados, o que foi significativamente mais elevado do que a percentagem de células SiHa EGFP-negativo que se formou tumorspheres (cerca de 1,6% tumorsphere formação; p 0,05). tumorspheres Da mesma forma, mais células C33A EGFP-positivo formado (aproximadamente 12%) em comparação com células EGFP-C33A negativo (cerca de 3%) (Figura 4B;. p 0,05). Além disso, ambas as células SiHa e C33A EGFP-positivos foram capazes de formar tumorspheres em três passagens consecutivas de tumorsphere culturas, e estas células formadas muito mais tumorspheres do que as células de EGFP-negativos em cada passagem de cultura (Figura 4C;. P 0,05). Além disso, a taxa de apoptose de células /proliferação foi avaliada em tumorsphere (TUNEL /Ki67) para excluir a possibilidade de que a diminuição do crescimento do tumor por EGFP- células é devido à menor viabilidade celular. TUNEL e Ki67 de coloração resulta em tumorspheres por SiHa e células C33A foi mostrado na Figura 4D e resumidos na Fig. 4E, em que não há quaisquer diferenças na taxa de células positivas TUNEL e Ki67 nas tumorspheres entre o Sox2-positiva e negativa SiHa e células C33A, o que sugere que a diminuição da capacidade de formação por tumorsphere EGFP- células não foi devido à viabilidade celular menos . Tomados em conjunto, estes resultados indicam que as células SiHa e C33A-expressando Sox2 endógenos possivelmente conter mais células que possuem a capacidade de auto-renovação.

(A, B) ensaio de formação de fotografias Tumorsphere e o número de tumorspheres formado por SiHa e células C33A em culturas de baixa densidade. ensaio de formação (C) Tumorsphere de EGFP

+ células durante a cultura passadas após a separação de uma única célula por FACS. A taxa de célula apoptose /proliferação foi avaliada por ensaios de Tunel e coloração Ki67 em xenotransplante (D e E) de EGFP + e as células EGFP-. Bares = SE. *, P 0,05. ns, p 0,05

A fim de identificar a capacidade de auto-renovação

in vivo

, o ensaio de transplante de série foram realizados com 10

2 do Sox2 positivo e. células SiHa e C33A negativos, respectivamente. As células SiHa e C33A Sox2-positiva poderia formar os tumores em série três passagens de experiências de transplantação. No entanto, 10

2 das células negativas Sox2 não conseguia formar qualquer tumor no primeiro experimento transplante. Portanto, o positivo SiHa Sox2 e células C33A têm mais capacidade de auto-renovação do que as células negativas

in vivo

. Além disso, a proteína foi detectada por Sox2 coloração imuno-histoquímica em tecidos de xenoenxertos tumorais formados por células de EGFP-positivas e negativas para EGFP-SiHa e C33A (Fig 5A). Tanto as células Sox2-positiva e Sox2-negativas foram encontrados nos xenoenxertos de tumores formados por células EGFP-positiva. No entanto, apenas as células Sox2-negativo pode ser detectado nos tecidos de tumores formados por células de cancro cervical Sox2-negativo. Estes resultados ainda apoiada que as células SiHa e C33A Sox2-positivo não só tem a capacidade de auto-renovação de reproduzir as células Sox2-positivo, mas também têm a capacidade de diferenciação para produzir as células Sox2 negativo

in vivo

.

(a) expressão Sox2 foi detectado pela IHQ em tecidos de xenotransplante formadas por SiHa-EGFP +, SiHa-EGFP-, C33A-EGFP + e as células C33A-EGFP-. (B) As percentagens de células EGFP + no primeiro, segundo e terceiro passagens em meio de diferenciação. Bares = SE. *, P . 0,05

Quando as células SiHa e C33A EGFP-positivas foram cultivadas em DMEM contendo FBS a 10%, a percentagem de células SiHa EGFP-positivas diminuiu de 95,78% na primeira passagem de 77,16% na segunda passagem e 34,82% na terceira passagem. Do mesmo modo, a percentagem de células C33A EGFP-positiva diminuiu de 90,32% na primeira passagem de 44,56% e 12,01% nas segunda e terceira passagens em meios de diferenciação, respectivamente (Fig. 5B). Além disso, EGFP-negativo SiHa e células C33A só poderia gerar células EGFP-negativo e não poderia produzir quaisquer células EGFP-positiva (Fig. 5b). Estes resultados indicam que apenas as células cancerosas cervicais expressando Sox2 endógenos têm capacidade de diferenciação in vitro.

Células cancro do colo EGFP-positivo expresso Mais Stem proteínas relacionadas com celular do que EGFP-negativas células

Sox2, OCT4, Bmi1 e Nanog são reconhecidos como fatores de transcrição nuclear relacionadas com a auto-renovação das células-tronco. Comparou-se a expressão destes factores de transcrição em células de EGFP-positivas, células EGFP-negativo, e xenoenxertos de tumor. Como mostrado na Figura 6, PCR em tempo real (Fig. 6A), a análise de Western blot (Fig. 6B e C), e a análise imuno-histoquímica (Fig. 6D) revelou que as células SiHa EGFP-positivos e os tumores formados por estas células expressaram níveis mais elevados das proteínas Bmi1, Oct4, Sox2 e do que as células SiHa EGFP-negativas, tanto ao nível da transcrição (Fig. 6A) e o nível de translação (Fig. 6B, C e D). No entanto, a expressão da proteína Nanog não foi alterada

(A) A expressão diferencial de vários genes relacionados com células-tronco em SiHa-EGFP

+ e SiHa-EGFP

-. Frações validados por qPCR. (B) A detecção de factores relacionados com células-tronco em ordenados SiHa-EGFP

+ e SiHa-EGFP

– células por western blot. (C) A análise semi-quantitativa de fatores relacionados com células-tronco em relação ao beta-actina. (D) Stem expressão de genes relacionados com a célula em xenoenxertos de tumor foi detectado por imuno-histoquímica. ALDH1 foi detectado por imuno-histoquímica (E), western blot (F), e a análise semi-quantitativa (G) em SiHa-EGFP

+ e SiHa-EGFP

– tumores. β-actina foi utilizado como controlo de carga para RT-PCR e transferência de Western. As barras de erro representam S.D. (N = 3). * P . 0,05

Além disso, nos últimos anos, um número crescente de estudos têm indicado que as células ALDH-positivo representam CSCs em muitos tumores somáticas [23]. No presente estudo, a coloração imunoquímico (Fig. 6E, esquerda) e Western blot ensaios (Fig. 6F e G) demonstraram que as células positivas a EGFP-expresso de ALDH, enquanto que as células de EGFP-negativas não o fizeram. A análise imunohistoquímica revelou também que os tecidos tumorais formados por células SiHa EGFP-positivo, não aqueles que são formados por células SiHa EGFP-negativo, foram coradas pelo anticorpo ALDH1 (Fig. 6E, direita). Em células C33A, os genes relacionados com células estaminais Bmi1, Oct4 e nanog também foram detectadas por Western Blot. O resultado mostrou que as células C33A subpopulação-EGFP expressa + muito mais forte do que as células C33A-EGFP-, esperar Nanog, o que foi semelhante para as células SiHa (Figura S1, A e B). Além disso, ALDH1 foi detectável em células EGFP + mas não em células EGFP- por Western blot e IHC (Figura S1, A-C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que as células cancerosas cervicais EGFP-positivos também expressam alguns factores relacionados com células-tronco, como OCT4, Bmi1 e ALDH1.

Cervical células cancerosas EGFP-positivo apresentou mais características de EMT que EGFP- As células negativas

indução EMT tem sido relatada para gerar células-tronco com-like propriedades [24], e CCC compartilhar algumas propriedades com células submetidos a EMT [25], [26]. Aqui, avaliou-se o estado de marcadores de células de EMT em Sox2-positivas, células Sox2-negativo, e tecidos tumorais formados por estas células (Fig. 7). Em SiHa-EGFP

+ células e tecidos tumorais, PCR em tempo real demonstrou que as proteínas do mesênquima tais como vimentina, caracol, e β-catenina foram marcadamente regulada positivamente ao nível do mRNA (Fig. 7A). Da mesma forma, Western blot (Fig. 7B), imunocitoquímicos (Fig. 7C), e análises de imuno-histoquímica (Fig. 7D) demonstrou que eles também foram regulados positivamente ao nível da proteína. Em contraste, a E-caderina, um marcador epitelial bem conhecido, foi regulada negativamente em células SiHa EGFP-positiva e regulada positivamente em células EGFP-negativo e xenoenxertos de tumor (Fig. 7A-D). Nós também descobrimos que os genes relacionados com a EMT, vimentina e β-catenina, foram expressas a um nível superior em células C33A EGFP-positivas do que em células EGFP-negativos por Western blot e coloração imuno-histoquímico. O marcador de E-caderina epitelial foi detectável em células C33A-EGFP-, mas não as células em C33A-EGFP +. No entanto, a proteína Snail não foi expressa em ambas as células de EGFP-positivos e EGFP-negativo. (Figura S2).