Sumário
células-tronco cancerosas (CSCs) são considerados responsáveis pelo mau prognóstico de pacientes com câncer. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares subjacentes à aquisição e manutenção de propriedades CSC em células de câncer por causa de sua raridade em amostras clínicas. Nós aqui induzida propriedades CSC em células cancerosas usam fatores definidos. Nós retrovirally introduziu um conjunto de fatores definidos (
OCT3 /4
,
SOX2
e
KLF4
) em células cancerígenas do cólon humano, seguido de cultura com meio com soro convencional , meio de células-tronco embrionárias não humana. Em seguida, avaliou as propriedades CSC nas células. As células de cancro do cólon transduzidas com os três factores observado aumento significativamente as propriedades CSC em termos da expressão de gene marcador, a formação de esfera, quimiorresistência e tumorigenicidade. Nós designado as células com propriedades CSC induzidas pelos factores, um subconjunto de células transduzidas, como CSCs induzidas (iCSCs). Além disso, foi estabelecida uma nova tecnologia para isolar e recolher os iCSCs com base nas diferenças no grau de aumento da actividade de corante-effluxing. Os xenotransplantes derivados de nossos iCSCs não foram teratoma. Notavelmente, em contraste com os tumores a partir de células cancerosas parentais, os tumores baseados no ICSC imitou tecidos de cancro do cólon humano em termos reais dos seus achados imuno-histológicos, que mostraram a diferenciação da linhagem do cólon. Além disso, constatou-se que os fenótipos dos nossos iCSCs foram reprodutíveis em experiências de transplante de série. Com a introdução de fatores definidos, geramos iCSCs com linhagem especificidade diretamente de células cancerosas, não
via
um estado de células-tronco pluripotentes induzidas. O novo método permite obter materiais abundantes de CSCs que não só têm melhorado a tumorigenicidade, mas também a capacidade de diferenciar para recapitular um tipo específico de tecidos de cancro. Nosso método pode ser de grande valor para compreender plenamente CSCs e desenvolver novas terapias enfocadas CSCs
Citation:. Oshima N, Yamada Y, Nagayama S, Kawada K, Hasegawa S, Okabe H, et al. (2014) Induction of Cancer Stem Cell Properties em células cancerígenas do cólon por fatores definidos. PLoS ONE 9 (7): e101735. doi: 10.1371 /journal.pone.0101735
editor: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de fevereiro de 2014; Aceito: 10 de junho de 2014; Publicação: 09 de julho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Oshima et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo tinha sido possível graças ao Prêmio Balzan para Shinya Yamanaka (https://www.balzan.org/en/about-us/balzan-prize-milan), e apoiado por fundos assistência de pesquisa de Shinryokukai Geral Incorporated Association (https: //www.shinryokukai.com/) (a TA), que é um não para alunos de lucro associação de Kobe University school of Medicine, e Grants-in-Aid para a Investigação científica da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS; http: //www.jsps.go.jp/english/index.html): 10J06242 (para NO), e NÃO foi bolseiros de investigação JSPs. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito, e isso não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.
Competindo interesses: nÃO e TA são membros sem salário de Shinryoku-Kai Geral Incorporated Association, que é um não para alunos de lucro associação de escola Universidade de Kobe da medicina. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
células-tronco cancerosas (CSCs) têm sido sugeridos para ser responsável pelo mau prognóstico de pacientes com vários tipos de câncer, devido às suas características e comportamento, tais como taxas mais elevadas de resistência terapêutica e recorrência [1] – [3]. Portanto, CSCs são considerados como um potencial alvo terapêutico. Para estabelecer novos tratamentos visando CSCs, é importante para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à aquisição de stemness em CSCs. No entanto, estes ainda não são claras, porque CSCs são uma população rara de células no tecido canceroso, e à raridade da CSCs torna difícil identificar e recolhê-los.
Assim CSCs gerando
in vitro
a partir de células cancerosas e a investigar as suas características é considerada como sendo um método útil para ultrapassar este problema. Vários estudos [4] – [6] relataram que as células com algumas propriedades tais como CSC tumorigenicidade aumentada eram indutível. No entanto, eles não se referiu ao facto de as células têm a capacidade de diferenciação de recapitular tipos específicos de tecidos de câncer. Por conseguinte, ainda não é claro se é possível gerar CSCs que correspondem precisamente ao cancro de células estaminais primárias.
No que se refere à aquisição de stemness, na geração de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs), verificou-se que a expressão ectópica de apenas três ou quatro fatores de transcrição (
OCT3 /4
,
SOX2 Comprar e
KLF4
com ou sem
C-MYC
) pode induzir propriedades de células estaminais embrionárias em células somáticas, quando são utilizadas condições de cultura ESC [7], [8]. Estes genes podem também induzir diretamente propriedades de células-tronco neurais (NSC) em células somáticas usando condições neuro-esfera de cultura [9]. Assim, estes genes têm a capacidade de induzir vários tipos de stemness em células somáticas, dependendo das condições de cultura. Portanto, a hipótese de que esses genes podem também induzir propriedades CSC em células cancerosas.
No estudo atual, nós transduzidas
OCT3 /4
,
SOX2
e
KLF4
em células cancerígenas do cólon humano nas condições de cultura de células parentais e analisou as células transduzidas em termos de suas propriedades CSC
in vitro
e
in vivo
. Consequentemente, o conjunto de três genes poderia induzir propriedades CSC em um subconjunto de células cancerígenas do cólon, e fomos capazes de recolher as células com propriedades CSC induzidas com base na sua diferença na actividade corante de efluxo. As células coletadas mostrou especificidade do cólon linhagem
in vitro
e
in vivo
. Os CSCs induzidos gerados usando esse método pode ajudar a investigar os mecanismos moleculares subjacentes à aquisição e manutenção de propriedades CSC em células cancerosas e para desenvolver a terapia CSC-alvo.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e Cultura celular
linhas celulares de cancro colorrectal Humanos (SW480 e DLD-1) foram fornecidos a partir do celular Resource Center for Biomedical Research, Universidade de Tohoku. As células foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) (Nacalai Tesque, Quioto, Japão) contendo soro de bovino fetal a 10% (FBS) (Life Technologies, Carlsbad CA, EUA) e penicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 ug /ml) (Life Technologies), e usado em passagem precoce para as experiências.
isolamento de ARN e quantitativa da transcriptase reversa-reacção em cadeia da polimerase
o ARN total foi isolado utilizando RNeasy Mini Kit Além disso ( QIAGEN, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. Uma alíquota de 1 ug de ARN total foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit High Fidelity transcriptor de síntese de ADNc (Roche, Basileia, Suíça), de acordo com os protocolos do fabricante. Quantitativa da transcriptase reversa-reacção em cadeia da polimerase (qRT-PCR) foi realizada com o FastStart Universal SYBR Verde Mistura Mestre (Roche) e foi analisado com o Passo-Um sistema de PCR em tempo real (Life Technologies). As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela S1
Citometria de Fluxo
Uma suspensão de células individuais a partir de células cultivadas foi imunocoradas com um anticorpo de ratinho anti-humano CD133 (Clone:. AC133, Miltenyi Biotec, Auburn CA , EUA), anticorpo anti-CD44 humano de murganho (clone: G44-26, Becton, Dickinson and Company [BD], Franklin Lakes NJ, EUA) ou anticorpo anti-humano ABCG2 rato (clone 5D3, BioLegend, San Diego CA, EUA). Depois de ser lavado, as células foram re-suspensas com PBS contendo FBS a 2%, e as células mortas foram marcadas por 2 ug /mL de iodeto de propídio (PI, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As suspensões de células únicas de células fixadas com paraformaldeído foram permeabilizadas com 0,2% de Triton-X (Sigma), e foram imunocoradas com um anticorpo de ratinho anti-humano CD26 (clone: M-A261, BD) e de coelho LGR5 anti-humano (Clone: EPR3065Y , Abcam, Cambridge, MA, EUA). Em todas as experiências de citometria de fluxo (FCM), anticorpos de isotipo correspondentes a cada um dos anticorpos foram utilizados como controlos. As amostras foram analisadas por um instrumento FACS Aria II (BD).
Western blot
As células foram lisadas com a proteínas de mamíferos M-PER Reagente de Extracção (Thermo Fisher Scientific, Rockford IL, EUA ). Os lisados celulares foram sujeitos a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Após a transferência electroforética das proteínas, immunoblotting com um anticorpo anti-humano de ALDH do rato (Clone: 44 /ALDH, BD), seguido por um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano, foi realizada. A fim de determinar a quimioluminescência, o sistema LAS 4000 (filme Fuji, Tóquio, Japão) foi usado.
Análise do Ciclo Celular
As células foram fixadas com etanol a 70% em PBS a 4 ° C durante a noite. As células foram tratadas com ribonuclease para digerir o ARN e coradas com 50 ug /ml de PI. As células foram analisadas por citometria de fluxo (FACS Aria II).
5-FU-quimiorresistência análise
A viabilidade das células após o 5-fluorouracilo (5-FU, a Kyowa KIRIN, Tóquio, Japão) exposição foi medido pelo ensaio colorimétrico de WST-8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo, Kumamoto, Japão). Um total de 5 × 10
3 células foram semeadas em placas de 96 poços no dia 10, e o meio foi substituído com DMEM contendo 1 ou 50 ug /mL de 5-FU 24 horas após a sementeira. Após incubação durante 48 h, a absorvância a 450 nm foi medida utilizando um leitor de placas de microtitulação. A viabilidade celular foi calculada como a razão dos valores de absorvância para a mesma amostra incubadas em DMEM, sem 5-FU durante 48 horas.
Formação Esfera Ensaio
As células foram transferidas para placas Ultra Low anexos (Corning Incorporated, Corning, Nova Iorque, EUA) em DMEM isento de soro contendo 10 ng /ml de bFGF (Wako, Osaka, Japão), 10 ug /insulina humana ml (CSTI, Miyagi, no Japão), 100 ug /transferrina humana ml (Roche) e 100 ug /ml de BSA (Nacalai Tesque), e incubou-se a 37 ° C em 5% de CO
2 incubadora durante 10 dias.
corante efluxo Análise Actividade
Uma análise de actividade de efluxo de corante foi realizada de acordo com métodos previamente descritos [10] – [12], com algumas modificações. As células foram recolhidas em DMEM contendo FBS a 2% e HEPES 1 mM (Sigma-Aldrich). As células foram incubadas em DMEM contendo FBS a 2% e HEPES 1 mM com Hoechst33342 (Life Technologies) a 5 ug /ml com ou sem a co-administração de verapamil (Sigma-Aldrich) a 50 ou 250