Abstract

Fundo

Apesar de intensa investigação na detecção precoce do câncer, há uma falta de biomarcadores para a confiança a detecção de tumores malignos, incluindo o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). mudanças de metilação do DNA são comuns e relativamente estável em vários tipos de câncer, e podem ser usados ​​como biomarcadores de diagnóstico ou prognóstico.

Métodos

Foi realizada de metilação do DNA profiling de amostras de 48 pacientes com estágio I NSCLC e 18 amostras de pulmão livres de câncer correspondente usando microarrays que cobrem as regiões promotoras de mais de 14.500 genes. Nós correlacionados mudanças de metilação de DNA com os níveis de expressão do gene e realizada análise de sobrevivência.

Resultados

Observamos hipermetilação de 496 CpGs em 379 genes e hipometilação de 373 CpGs em 335 genes em NSCLC. Em comparação com amostras de adenocarcinoma, amostras de carcinoma espinocelular tinha 263 CpGs em 223 genes hypermethylated e 513 CpGs em 436 genes hypomethylated. 378 de 869 (43,5%) sites de CpG discriminar as amostras de NSCLC e de controlo mostrou uma correlação inversa entre CpG site de metilação e os níveis de expressão do gene. Como resultado de uma análise de sobrevivência, encontramos 10 CpGs em 10 genes, em que o nível de metilação difere em diferentes grupos de sobrevivência.

Conclusões

Nós identificamos um conjunto de genes com metilação alterada em NSCLC e descobriu que uma minoria deles mostraram uma correlação inversa com os níveis de expressão do gene. Encontramos também um conjunto de genes que associados à sobrevida dos pacientes. Estes candidatos marcador recém-identificadas para a triagem molecular de NSCLC terá uma análise mais aprofundada, a fim de determinar a sua utilidade clínica

Citation:. Lokk K, Vooder T, Kolde R, Valk K, VOSA U, Roosipuu R, et ai. (2012) metilação Marcadores de Early-Stage Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (6): e39813. doi: 10.1371 /journal.pone.0039813

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 06 de novembro de 2011; Aceito: 28 de maio de 2012; Publicado: 29 Junho 2012 |

Direitos de autor: © 2012 lokk et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado pela União Europeia através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional, Centro de Excelência em Genomics e projetar 245536 OpenGene. Apoio adicional foi obtida a partir da Estónia Ministério da Educação e Ciência SF0180142s08 núcleo concessão, concessões Estonian Science Foundation 7473, 9293 e Universidade de Tartu Projeto Fundo de Desenvolvimento do Translational Genomics. LM tem sido apoiado pela União Europeia através do Fundo Social Europeu, a comunhão MJD71. NT tem sido apoiado pela bolsa da Fundação Alexander von Humboldt. KL, MK e NT receberam estipêndios de viagem de Kristjan-Jaak Foundation. Site do projeto OpenGene: www.geenivaramu.ee/opengene/. Site da Estónia Science Foundation: www.etf.ee. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. eventos epigenéticos são precoces e frequentes na carcinogênese [1], [2], [3], o que faz de metilação do DNA de um biomarcador atraente para o câncer. eventos epigenéticos também poderia fornecer um link tratável entre o genoma e ao meio ambiente, com o epigenoma servir como um registro bioquímica de eventos de vida relevantes, por exemplo, o consumo de cigarros [4].

O cancro do pulmão é morfologicamente dividido em não-pequenas células e cancro do pulmão de pequenas células (NSCLC e SCLC). NSCLC é responsável por cerca de 80% dos cancros do pulmão e é uma entidade clínica heterogénea com os principais subtipos histológicos, tais como carcinoma de células escamosas (SCC), adenocarcinoma (AC) e carcinoma de grandes células [5]. Uma característica comum dos diferentes subtipos de NSCLC é o crescimento um pouco mais lento e se espalhar em comparação com SCLC, permitindo a erradicação cirúrgica em seus estágios iniciais. Apenas uma pequena fração dos casos de NSCLC estão actualmente diagnosticada em estágios clínicos I a IIb, em que a remoção cirúrgica é o tratamento de escolha.

A abordagem orientada para o biomarcador em fases pré-invasivas poderia auxiliar no diagnóstico ou exclusão de câncer de pulmão. marcadores atuais, incluindo antígeno carcinoma epidermóide, antígeno carcinoembrionário, citoqueratina 19 antigénio fragmento de 21-1 e enolase específica dos neurónios foram mostradas a falta de poder diagnóstico satisfatório. Em um estudo recente, apenas 37,3% dos cancros do pulmão em estágio inicial pode ser diagnosticado utilizando os ensaios combinação dos marcadores tumorais acima mencionados [6].

O nosso estudo teve como objetivo a identificação de todo o genoma de DNA candidatos biomarcadores à base de metilação em início de carreira NSCLC. A metilação do DNA ocorre substancialmente no contexto de dinucleótidos de citosina-guanina (CpG) [7]. Ricos em CpG trechos curtos (ilhas CpG) são geralmente localizado na região promotora de genes e são normalmente mantidas no estado desmetilado [8]. No cancro, ilhas CpG localizadas na região promotora dos genes supressores tumorais e genes de manutenção da “casa” tornam-se hipermetilado, o que pode levar a uma diminuição da expressão destes genes. Ao mesmo tempo, o genoma é globalmente desmetilado, que por sua vez pode conduzir à activação de oncogenes [9], [10]. Metilação de margens ilha CpG – regiões com menor densidade CpG dentro de aproximadamente 2 kb de ilhas CpG – também está intimamente associada com a inactivação da transcrição [11]

Recentemente, um progresso significativo tem sido feito na metilação do DNA do genoma. análise. Os métodos incluem a conversão de bissulfito de ADN, imunoprecipitação ou purificação por afinidade de ADN desnaturado, seguido por análise de microarray ou sequenciação de elevado rendimento [12]. Tem sido demonstrado que, em termos de precisão, os métodos baseados em bissulfito desempenho ligeiramente melhor do que os métodos à base de enriquecimento e não requerem uma correcção estatística para a polarização CpG [13].

ter realizado um ADN do genoma estudo de metilação de fase I NSCLC para obter uma visão sobre alterações epigenéticas em estágio inicial no cancro do pulmão e identificar biomarcadores de diagnóstico ou prognóstico potenciais. Em nosso estudo utilizamos os HumanMethylation27 BeadChips (Illumina, Inc), que permitem comparações quantitativas rentáveis ​​em muitas amostras.

Resultados

CpG análise de metilação

No geral, nós detectamos 496 379 CpG em genes hipermetilado e 373 336 genes em CpGs hypomethylated em NSCLC (Figura S1, S1 Tabela). Um mapa de calor dos 100 genes mais metilados de forma diferente em NSCLC em comparação com amostras de controlo é mostrado na Figura 1.

os níveis de metilação do DNA são mostrados para os melhores 100 locais CpG com os maiores valores de delta beta (FDR corrigido) do DNA metilação entre tecido canceroso e do tecido de pulmão normal. Os beta-valores de metilação são representados como Z-scores de linha. A heatmap foi gerado usando análise de agrupamento hierárquico 2D sem supervisão. O vermelho indica alta metilação e azul indica baixa metilação em relação à linha média.

Em comparação com amostras AC, amostras de CEC teve 263 CpGs em 223 genes hypermethylated e 513 CpGs em 436 genes hypomethylated (Figura S2, Tabela S2).

Duas amostras de DNA (IDs 33 e 107) foram processados ​​em duplicado como um controlo interno da reprodutibilidade do ensaio. coeficiente de correlação de Pearson para ambas as duplicatas era 0,998. níveis de metilação determinado pelo ensaio Infinium foram validados utilizando Sanger de sequenciação de ADN-bissulfito convertido para 11 (seis CpGs CpGs de NSCLC versus análise de amostras de controlo e cinco CpGs de análise de sobrevivência). A correlação média entre dois métodos foi de 83% (intervalo de 48,9%; 97,4%). (Figura S3)

Os locais CpG analisados ​​por ensaio HumanMethylation27 estão localizados dentro de 1,5 kb a montante a 1 kb a jusante do TSS do seu respectivos genes. Nós encontramos uma diferença significativa na localização das hypermethylated vs. hypomethylated CpGs relação ao TSS mais próximo (p = 0,0001, Welch Dois t-teste da amostra). CpGs hypermethylated foram preferencialmente localizado na TSSs, 3 ‘a jusante do TSS ou em ilhas CpG. Em contraste, hypomethylated CpGs foram frequentemente encontrados 5 ‘a montante do respectivo TSSs ou na costa da ilha de CpG [11] (Tabela 1, Figura 2).

Nós medimos CpGs’ distância do local de início da transcrição (TSS) . a) Distância a partir do TSS de todos os CpGs na matriz de metilação. b) Distância do TSS de CpGs hypermethylated (linha pontilhada) e distância da TSS de CpGs hypomethylated (linha contínua). No eixo-x, a distancia do TSS é medido em BP-s, e sobre o eixo dos y representa o número N de CpGs.

Diferentes CpGs de

,

PABPC5

e

TP73

eram ou hiper ou hypomethylated em NSCLC.

gene TP73

, o sítio CpG hipermetilado na amostra de tumor estava localizado a montante do TSS da isoforma ARNm de comprimento completo. Hypomethylated

TP73

CpGs foram localizados perto do TSSs das isoformas mais curtas. Hypermethylated CpGs do

HSPA12B

e

PABPC5

foram localizados em seus 5 ‘ilhas CpG, enquanto CpGs hypomethylated foram localizados a montante, fora das ilhas CpG.

Gene Expression Microarray Validação por qRT-PCR

Gene expressão configuração de matriz e os resultados são relatados no estudo recente [14]. 10 genes e oito pares de amostras foram usadas para validar os resultados de microarray, usando tecnologia de qRT-PCR. Todos os genes apresentaram o mesmo sentido de sobre- ou subexpressão nas amostras de cancro do pulmão, utilizando ambas as tecnologias (Figura 3). Sete genes mostrou uma correlação significativa entre a expressão dobrável mudanças determinadas por qRT-PCR e microarray (p 0,05, R 0,7). (Figura S4)

No eixo y é mostrado log2fold- média alterar determinada pela matriz Ilumina e qRT-PCR (8 pares de amostras). As barras de erro indicam o erro padrão da média (SEM).

A metilação relacionadas com Gene Expression Altera

Usando a análise de correlação de Pearson, fomos capazes de determinar a correlação inversa esperada entre o diferencial de níveis de metilação e os valores de expressão de genes para 378 (43,5%) dos 869 CpG metiladas diferencialmente entre NSCLC e amostras de controlo. Em diferentes grupos histológicos, fomos capazes de encontrar 337 de 780 CpGs (43,2%), os níveis de metilação dos quais foram inversamente correlacionada com os níveis de expressão do gene.

Foi realizada uma análise qPCR dos diferentes

TP73

isoformas para testar se a metilação diferencial ao lado do TSSs de diferentes isoformas afecta o seu nível de expressão. A análise qPCR não revelou uma diferença estatisticamente significativa (p 0,36, teste t pareado) entre os níveis das duas isoformas de expressão em nossas amostras de tumor.

Ingenuity Pathway Analysis

realizada

in silico

e interacção funcionais análises dos genes diferencialmente metilados usando software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA), e encontraram 78 genes de rede elegíveis e 451 Funções /Pathways genes elegíveis. Ao incluir as interacções directas e indirectas conhecidos, a rede gene mais proeminentemente representado estava relacionado com o factor de necrose tumoral (TNF, Figura S5). A maioria dos genes (n = 22) na rede foram hypomethylated, mas alguns genes (n = 7) também foram hipermetilado.

DNA metilação relacionada com o comportamento de fumar

Com base em tabaco pacote de fumar dados -years, pedimos se o fumo afeta os padrões de metilação do DNA em um tumor. Um paciente que não dispunham de dados fumadores foi excluída. análise de regressão linear foi realizada utilizando o pacote Bioconductor Limma. Análise dentro de amostras tumorais não mostraram quaisquer genes diferencialmente metilados relacionado com a extensão de fumo de tabaco. Comparando o número limitado de não-fumantes (n = 3, 6,4%) com fumantes (n = 44, 93,6%) encontramos quatro diferencialmente metilados CpG-sites em três genes (p 0,05, FDR ajustado), que são todos hypomethylated no grupo fumantes:.

CXorf38

,

MTHFD2

e

TLL2

Altered metilação e longo prazo Survival

Realizamos dois tipos de análise de sobrevivência para encontrar potenciais marcadores de metilação prognósticos. Os doentes com cirurgia só até um mês após a sobrevida (n = 2) foram excluídos para evitar qualquer influência confusão potencial de complicações pós-operatórias.

Em primeiro lugar, foi realizada uma análise de sobrevivência de Kaplan-Meier em cada um dos locais de CpG dividindo-se os valores em grupos beta baixas, médias e elevadas de metilação. Nós só relatam resultados onde todos os grupos eram maiores que cinco pacientes. Como resultado, encontramos 10 CpGs em 10 genes, com diferenças de nível de metilação em diferentes grupos de sobrevivência (Figura 4). Os pacientes com um nível de metilação média de

UGT1A7, GPR171, P2RY12, FLJ35784

e

C20orf185

tiveram melhor sobrevida do que pacientes com metilação de alto nível. Os pacientes com um nível de metilação média de

CLEC11A

e

GRIK3

tiveram melhor sobrevida em comparação com a metilação de baixo nível. Os pacientes com um nível de metilação baixo de

CYP1A1

e

INGX

tiveram melhor sobrevida do que aqueles com a metilação de nível médio. Os pacientes com um alto nível de metilação para

PIK3R5

tiveram melhor sobrevida do que aqueles com a metilação de nível médio.

Foi realizado um teste de sobrevivência em cada um dos locais de CpG. Os valores de metilação são divididos em 3 grupos: baixo (0-0,25), médio (0,25-0,75) e alta (0,75-1). Como resultado, encontramos 10 sites CpG cujo nível de metilação difere em diferentes grupos de sobrevivência. O eixo x mostra a sobrevivência em anos, e o eixo y mostra a sobrevida global.

Em segundo lugar, foi realizada a análise de metilação diferencial através da combinação de Cox análise de risco proporcional e Wilcoxon teste da soma de classificação. Encontrámos 18 CpGs em 15 genes em pacientes com 1 a 24 meses de sobrevida (n = 12) vs. pacientes com 60 meses e maior sobrevida (n = 15), p 0,05, ea diferença de metilação de corte aplicado. A partir dos genes diferencialmente metilados,

DXS9879E

(

LAGE3

),

RTEL1

e

MTM1

foram hipermetilado, e

SCUBE3

,

SYT2

,

KCNC3

,

KCNC4

,

GRIK3

,

CRB1

,

SOCS2

,

ACTA1

,

ZNF660

,

MDFI

,

ALDH1A3

e

SRD5A2

foram hypomethylated no grupo com pior sobrevida (Figura S6).

Discussão

Temos realizado um estudo de metilação do DNA do genoma em 48 estágios I NSCLC pacientes e 18 amostras de controlo sem câncer macroscopicamente por meio de análise de cluster para procurar genes que distinguem entre o cancerígeno e tecido pulmonar normal e comparados os níveis de metilação desses genes com os seus níveis de expressão. Além disso, foi realizada

in silico

análise funcional e interação de genes metilados de forma diferente usando software IPA. regressão linear foi utilizada para encontrar genes relacionados ao tabagismo, e análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada para identificar a metilação diferencial de genes relacionados à sobrevida do paciente

.

Como resultado, foram detectados 496 CpGs em 379 genes hypermethylated e 373 336 CpG em genes que foram hypomethylated em NSCLC. Uma separação perfeita das amostras de tecido de pulmão de controlo a partir de amostras de NSCLC não foi obtido, como uma amostra normal pulmão agrupado em conjunto com as amostras de cancro e seis amostras de cancro (um em cada repetição) mostraram padrões de metilação que se assemelha o tecido pulmonar livre de tumor. Uma vez que foram utilizadas amostras tumorais não-dissecado, esta descoberta pode ser pelo menos parcialmente causada pelo efeito de tecido não neoplásico presente nestas amostras. O exame patológico das amostras NSCLC com perfis de metilação do DNA semelhantes às amostras normais de pulmão revelou qualquer baixo teor de tumor (10-30%) ou uma composição muito heterogénea de células tumorais nas amostras. Estas amostras de câncer de co-agrupamento e amostras de pulmão sem câncer foram excluídas do análises posteriores.

Nosso primeiro objetivo foi identificar os genes envolvidos em eventos precoces na metilação específicas do tumor. Como resultado, a nossa triagem descoberto alguns marcadores de metilação bem conhecidos, alguns dos quais têm actividade supressora de tumores:

CDKN2A

,

MGMT

,

GATA4

,

HOXA7

,

HOXA9

,

RUNX3

,

SFRP1

. A maioria dos genes identificados são novos marcadores de metilação para NSCLC, embora algumas delas têm sido descritos como metilado em outros cancros.

LGALS12

é um supressor de tumor que é candidato capaz de prender o ciclo celular e inibem a proliferação de várias linhas celulares de cancro [15]. No cancro da mama,

LGALS12

foi encontrado reprimidos no tecido maligno [16].

O segundo objetivo do nosso estudo foi correlacionar as alterações de nível de metilação com os dados de expressão de genes. Usando a análise de Pearson, fomos capazes de encontrar a correlação inversa esperada entre os níveis de metilação e valores de expressão gênica para 378 de 869 locais CpG (43,5%). Os maiores valores de correlação inversa entre CpGs hypermethylated e valores de expressão foi encontrado com o

AGER

(-0,78),

R-EPO

(-0,65) e

AQP1

(-0,63) genes. A distância média de TSS de genes correlação inversa foi -65 pb (intervalo -1498; 917 bp) em comparação com -158 pb (intervalo -1474; 818 pb) de CpGs positivamente correlacionadas (p-valor de 0,02, estudantes t-teste). A gama de CpGs provavelmente é afectada pelo facto de Infinium HumanMethylation27 micromatriz de cobre Ilumina CpGs que estão localizadas predominantemente na vizinhança das regiões promotoras e não no corpo ou 3’UTR do gene. Aquaporin 1 (

AQP1

) tem sido relatado para ser hipermetilado e regulados negativamente em NSCLC [17].

AGER

, que codifica um receptor da superfamília das imunoglobulinas, tem sido relatada a ser regulada negativamente em NSCLC [18]. Os maiores valores de correlação inversa para os locais CpG hypomethylated e valores de expressão foi encontrado com

MB

(-0,63),

ADA

(-0,60) e

MAGEA6

(-0,60) genes. Mioglobina (

MB

) está associada com a progressão do tumor e ajuda a superar hipóxia em células de câncer [19]. Hipermetilação e /ou a regulação negativa de alguns dos genes identificados em nosso estudo (por exemplo,

ALDH1A2

,

HOXA5

,

MT1E

,

Sox17

) têm foram relatados em outros tipos de câncer [20], [21], [22], [23], mas ainda não em câncer de pulmão. hipótese-se que

RASSF1

actua como um supressor de tumores em progressão de cancro do pulmão [24]. Entre os genes hypomethylated e regulados positivamente, o gene mais frequência foi a

SERPINB5

(Maspin). Superexpressão de

SERPINB5

tem sido associada com a progressão do câncer e um mau prognóstico no câncer de pulmão [25].

Podemos assumir que os genes com uma correlação inversa têm uma probabilidade maior de ser regulada por metilação . No entanto, muitos genes provavelmente tornar-se metilado aleatoriamente durante a carcinogênese, e isso não tem necessariamente um efeito de estado estacionário sobre os níveis de expressão de genes.

No caso de diferentes grupos de histologia, fomos capazes de encontrar uma correlação inversa entre a diferencialmente locais CpG metilados e valores de expressão de genes para 337 de 780 locais CpG (43,2%). Os valores de correlação inversa maiores eram para

ACOX2

(-0,75),

CU

(-0,70) e

SLC39A4

(-0,68), que não têm sido associados com NSCLC subtipos histológicos antes. Dos genes inversamente correlacionados, foi relatado que

plgR

,

MUC1

e

FOLR1 Quais são reprimidos em SCC em relação ao AC [26], [27], [ ,,,0],28], o que é consistente com os nossos resultados.

Análise usando software IPA revelou que as funções dominantes dos genes diferencialmente metilados foram sinalização célula-a-célula e interacção, replicação e reparação do ADN, crescimento e proliferação celular, morte celular, cancro, resposta inflamatória, etc. um número de funções de genes, tais como o crescimento celular, a proliferação e a morte celular, estão directamente envolvidos na progressão do cancro, mas também o sistema imunitário desempenha um papel importante no combate a células cancerosas. também é amplamente conhecido que as deficiências nas vias de reparo de DNA e controle de danos são responsáveis ​​pela maioria ou mesmo todos os cânceres humanos. Depois de incluir as relações indiretas conhecidos, a rede gene mais proeminente revelou foi relacionada com a

TNF

(Figura S5).

TNF

tem um duplo papel na biologia do tumor. É uma citocina com propriedades anti-cancro bem conhecidos, mas pode também promover o desenvolvimento e progressão de cancro [29]. genes Hypomethylated no

TNF

rede foram citocinas (

CCL3, CCL4, CCL7, CCL8, CCL22, IL21, IL17A, EBI3

) que pode estimular ou inibir o crescimento tumoral e progressão. O

TNF

rede também inclui o gene anti-apoptótica potente bem conhecido

BCL2

, que também foi principalmente hypomethylated em nossas amostras de NSCLC.

ALDH1A3

(aldeído desidrogenase família 1, os A3) indirectamente regulamentada pela

TNF

desempenha um papel na desintoxicação de aldeídos gerados pelo metabolismo do álcool e da peroxidação lipídica. A hipometilação deste gene estava relacionada com um pior prognóstico em nossa coorte de estudo (Figura S6).

Nós descobrimos que

TP73

tinha três CpGs diferencialmente metilados, dois dos quais foram hypomethylated nos tecidos tumorais e localizado perto da TSS de suas isoformas mais curtas. O CpG hipermetilado estava localizado a montante do TSS da isoforma ARNm de comprimento completo. Nós medimos a expressão de diferentes isoformas utilizando análise de qPCR, mas não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes (p-valor de 0,36, teste t pareado) nas amostras de tumor, embora a isoforma longa foi expressa em um nível ligeiramente inferior à isoforma curta . Foi realizado um teste de Kaplan-Meier sobrevivência para locais de CpG, para o qual dividimos os seus valores de metilação em 3 grupos: baixo (0-0,25), médio (0,25-0,75) e alta (0,75-1). Como resultado, encontramos 10 CpGs em 10 genes cujo nível de metilação difere em diferentes grupos de sobrevivência (Figura 4).

UGT1A7

é uma enzima envolvida no metabolismo de (pré) agentes cancerígenos presentes na fumaça do tabaco. Precarcinogens e os seus metabolitos são considerados para desempenhar um papel importante na carcinogénese do tabaco em cancros relacionados com o fumo [30]. Tem sido demonstrado que os polimorfismos no gene UGT1A7 estão associados com o cancro do pulmão, o que sugere que estes polimorfismos reduzir a actividade enzimática [31]. Um nível de metilação alta podem afetar

UGT1A7

atividade e causar um mau prognóstico para pacientes com NSCLC.

CYP1A1

(pertencente ao citocromo P450 superfamília) catalisa muitas reações envolvidas no metabolismo de drogas, também a conversão de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos em metabólitos reativos e detoxifications de agentes cancerígenos ambientais. Tem sido demonstrado que

CYP1A1

é hipermetilado em amostras de cancro do pulmão em comparação com amostras de pulmão normais, e isto foi associado com os níveis de ARNm reduzidas [32]. Em nosso estudo, os níveis de metilação mais elevados foram associados com pior sobrevida de pacientes com câncer de pulmão que suporta a hipótese de que

CYP1A1

pode ter papel protetor na progressão do cancro. Outros genes encontrados na análise de sobrevivência não foram repórter de estar envolvido na sobrevivência dos pacientes com câncer de pulmão.

Usando um tipo diferente de análise de sobrevivência, onde a análise de metilação diferencial foi realizada através da combinação de Cox análise de risco proporcional eo Wilcoxon teste rank-sum, nós fomos capazes de analisar 12 pacientes com uma sobrevivência de menos de 24 meses e 15 pacientes que sobreviveram 60 meses ou mais após a cirurgia. Esta análise dos diferentes grupos de sobrevivência revelou 15 genes diferencialmente metilados.

RTEL1

, o regulador de alongamento dos telómeros helicase 1, parece ser o mais interessante funcionalmente um destes. Esta é uma helicase de ADN dependente de ATP requerido para suprimir inadequado recombinação homóloga, desempenhando assim um papel central na reparação do DNA e na manutenção da estabilidade do genoma.

RTEL1

foi encontrado para ser hipermetilado em nosso grupo sobrevida.

Comparando não-fumantes (n = 3, 6,4%) com fumantes (n = 44, 93,6%), quatro diferencialmente metilado CpG-sites relacionados a três genes, hypermethylated no grupo de não-fumantes foram encontrados:

CXorf38, MTHFD2

e

TLL2

. Faltando diferença estatisticamente significativa nos níveis de metilação entre os diferentes níveis de fumo de tabaco poderia indicar uma baixa confiabilidade dos dados das embalagens de anos-«obtido.

MTHFD2

foi mostrado para ter uma expressão maior em fumantes, favorecendo o crescimento celular rápido. [33].

TLL2

é uma metaloprotease dependente de zinco. Expressão de metaloproteinases é necessária para a transformação celular, e isso se correlaciona com a progressão do tumor [34].

Ao comparar as alterações do genoma na metilação do DNA de células normais e cancerosas do pulmão, fomos capazes de obter insights sobre o complexidade do programa metilação necessária para que as células se tornam completamente maligno. Como resultado, verificou-se um painel de genes que distinguem as células NSCLC de células pulmonares normais adjacentes e também carcinoma de células escamosas de adenocarcinoma. A análise revelou um conjunto de locais CpG diferencialmente metilados que aparecem para regular a expressão do gene e outro conjunto que tinha afetado a sobrevivência dos pacientes. Estes marcadores de metilação recém-identificados são candidatos para o rastreio suplementar molecular de NSCLC. Para confirmar estes marcadores de NSCLC carcinogênese, são necessários estudos e validações adicionais. A partir dos resultados do nosso trabalho e de descobertas anteriores, podemos supor que a metilação do DNA alterado é um evento precoce na NSCLC.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

A Ética Comissão de Estudos Humanos da Universidade de Tartu, aprovou o estudo e consentimento escrito foi obtido a partir dos sujeitos do estudo.

Amostras

foram analisados ​​União para o Controle Internacional de Câncer (UICC) a fase I NSCLC amostras [35] de 48 pacientes e amostras macroscopicamente sem câncer “normais” pulmão de controle de 18 pacientes. Todos os espécimes foram isolados durante a cirurgia de pulmão no Hospital Universitário de Tartu, Estónia. Os pacientes com adenocarcinoma (n = 6, 12,5%) e o seu subtipo carcinoma broncoalveolar (n = 10, 20,8%) foram analisados ​​como um grupo (n = 16, 33,3%). Os restantes 32 (66,7%) dos pacientes analisados ​​tinham carcinoma de células escamosas. A faixa etária no grupo de estudo foi 41-80 anos (Tabela S3) (idade em homens n = 40, 66,2 anos e em mulheres n = 8, 65,5 anos). Os pacientes não foram submetidos a qualquer quimioterapia pré ou radioterapia.

No momento da cirurgia, amostras de tecido de tamanho apropriado (1-2 cm

3) foram cortados de tecido pulmonar tumoral e morfologicamente livre de tumor. Metade de cada amostra foi fixada em formalina e utilizado para o exame patológico. A outra metade de cada amostra foi congelado rapidamente e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. As amostras de controlo foram obtidos a um local distante do tumor removido e confirmado para ser livre de tumor pelo mesmo patologista.

Extracção de DNA e bissulfito Modificação

O DNA foi extraído a partir de 50 mg de tumor e combinando tecido pulmonar livre de tumor com o Dneasy® Blood Tissue kit (Qiagen GmbH., Hilden, Alemanha) e com o kit de tecido NucleoSpin® (Macherey-Nagel GmbH., Düren, Alemanha). rendimento e a pureza do ADN foram determinadas utilizando o espectrofotómetro NanoDrop® ND1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). A partir de cada amostra, 500 ng de ADN genómico foi modificado com bissulfito utilizando o Kit de DNA Metilação EZ ™ (Zymo Research, Orange, CA) de acordo com as recomendações do fabricante.

A metilação de validação por Sanger Sequenciação

para a validação chip de metilação 11 genes foram escolhidos, cinco delas foram genes de análise de sobrevivência e os restantes seis genes eram que distinguiram entre o câncer eo tecido normal (Primers utilizados no estudo mostrou na Tabela S4). Os iniciadores de PCR para ADN tratado com bissulfito foram concebidos utilizando MethPrimer [36]. A 20 ul de PCR foi efectuada em Tris-HCl 80 (pH 9,4-9,5), 20 mM de (NH4) 2SO4, 0,02% de tampão de PCR de Tween-20, MgCl 2 3 mM, 1X betaína, 0,25 mM de mistura de dNTP, 2 unidades de Taq Hot-começar a polimerase, 50 pmol do iniciador de sentido directo, 50 pmol do iniciador de sentido reverso, e 20 ng de ADN genómico tratado com bissulfito. condições dos ciclos de PCR foram 95 ° C durante 15 minutos de activação de enzimas, 95 ° C 30 seg, 62 ° C 45 seg, 72 ° C 120 s durante 17 ciclos, Touchdown por -0,5 ° C durante cada ciclo e 95 ° C 30 seg, 52 ° C 30 seg, 72 ° C 120 s durante 21 ciclos. Seqüenciamento foi feito como um serviço pela Facilidade Núcleo da Estónia Biocenter. Foram analisados ​​os vestígios de sequenciamento com software Mutation Surveyor (Softgenetics, State College, PA, EUA) e software de computação estatística R (https://www.r-project.org/).

Extração de RNA e expressão gênica Análise

Descrição detalhada do processo de extracção de ARN e a análise da expressão do gene é dada no artigo recente [14].

foram usadas 10 genes e oito pares de amostras (amostras de tumor e normal adjacente) para validar os dados de microarray. Para RT-PCR quantitativa (qPCR), os ADNc foram sintetizados a partir de 700 ng de ARN total utilizando o kit de primeira cadeia de cDNA Synthesis (Fermentas, Vilnius) e iniciadores oligo dT de acordo com o protocolo do fabricante. reacções triplicado qPCR foram realizadas em placas de 384 pos utilizando SYBR Green ROX Mix (ABgene, Epsom, Reino Unido ou Fermentas, Vilnius) e ABI Sequence Detection System 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os dados foram analisados ​​usando o SDS 2.2.2 (Applied Biosystems) e software de computação estatística R (https://www.r-project.org/).

A média de expressão geométrica de dois genes de referência (

ESD

e

S18RNA

) foi utilizado como referência. mudança dobra expressão entre a amostra normal e tumor foram calculados usando 2

-ΔΔCt método. análises de correlação de Pearson foram usadas para avaliar a conformidade entre as mudanças de dobragem identificados por experiências de matriz de qRT-PCR e.

Além disso, qRT-PCR foi utilizada para determinar o

TP73

nível de expressão. Os iniciadores utilizados para a

TP73

qPCR amplificações estão listadas na Tabela S5.

DNA metilação Análise

análise de metilação foi realizada utilizando Infinium® HumanMethylation27 RevB BeadChips (Illumina Inc.). O ensaio abrange 27,578 CpGs em 14.495 genes localizados predominantemente nas ilhas CpG dentro de regiões promotoras proximais, entre 1,5 kb a montante e a 1 kb a jusante dos locais de início da transcrição (SST). Uma ilha CpG neste ensaio é definida como uma sequência de nucleótidos de (1) 200 pb ou maior em comprimento, (2) 50% ou superior em GC-por cento, e (3) 0,60 ou superior numa proporção de locais de CpG observados sobre locais CpG esperado nessa região [10]. O HumanMethylation27 beadchips também abrangem locais de CpG nas regiões reguladoras de 1.000 genes do cancro bem conhecidos, 150 genes diferencialmente metilados em vários tipos de câncer e 110 genes de miRNA.