Abstract

heterogeneidade celular é uma parte integrante do desenvolvimento e progressão do câncer. Progressão podem ser associados ao aparecimento de células que exibem uma elevada plasticidade fenotípica (incluindo “desdiferenciação” para os estados de desenvolvimento primitivas), e propriedades de comportamento agressivo (incluindo altos potenciais tumorigénicas). Observamos que muitos biomarcadores que são utilizados para identificar células-tronco cancerosas (CSC) pode rotular subpopulações de células em um estágio clínico avançado de câncer de pulmão (derrames pleurais malignos, ou MPE). Assim, CSC-biomarcadores podem ser úteis para viver triagem subpopulações de células funcionalmente distintos de tumores individuais, que podem permitir que os investigadores a aprimorar em a base molecular para a heterogeneidade funcional. Nós demonstramos que o CD44

oi subpopulações de células do cancro (CD44-alta) exibir maior clonal, formando colónia potencial do que CD44

células lo (n = 3) e também são tumorigênico (n = 2/2), quando transplantadas em modelo de xenoenxerto mouse. Os CD44

subconjuntos HI Express diferentes níveis de desenvolvimento embrionário (desdiferenciação) marcadores ou reguladores de cromatina. Em tecidos de câncer de pulmão arquivados, marcadores de ALDH co-localizar mais com CD44 no carcinoma espinocelular (n = 07/05) do que adeno Carcinoma (n = 1/12). MPE células cancerosas e uma linha de células do cancro do pulmão (NCI-H-2122) apresentam anormalidades cromossômicas e 1p36 eliminação (n = 3/3). Uma vez que o miR-34a mapeia para o local de eliminação 1p36, baixos níveis de expressão de miR-34a foram detectados nestas células. A eficiência de formação de colónias de CD44

células de hi, propriedade característica de CSC, pode ser inibida por substituição de miR-34a nestas amostras. Além disso, o CD44 altamente tumorigênico

células hi são enriquecidas para células na fase G2 do ciclo celular

Citation:. Basak SK, Veena MS, Oh S, Lai C, Vangala S, Elashoff D, et ai. (2013) O CD44

altos Subconjuntos tumorigénico em Lung Cancer Biospecimens são enriquecidos para baixo miR-34a Expression. PLoS ONE 8 (9): e73195. doi: 10.1371 /journal.pone.0073195

editor: Mauricio Rojas, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de maio de 2013; Aceito: 16 de julho de 2013; Publicação: 03 de setembro de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Medicina da UCLA e da Robert W. Green, Chefe e do Programa de Oncologia Cirúrgica Neck na UCLA. Os fundos de doações foram utilizados para reagentes e apoio salarial dos pesquisadores envolvidos no estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

heterogeneidade do tumor pode ser. caracterizado por a expressão diferencial de marcadores de superfície celular, as diferenças genéticas e epi, e /ou diferenças em moléculas de sinalização importantes ou efectores da função das células. heterogeneidade celular pode ser caracterizado por diferenças nas propriedades funcionais (comportamentais) de células (clonogenicidade, capacidade de formação de colónias em agar mole, tumorigénese, etc.). Considerando que muitas investigações optou por associar marcadores da superfície celular nas células tumorais encontradas no local do tumor primário, com CSC-comportamental propriedades, observou-se que as fases clinicamente avançados são particularmente enriquecido para subpopulações de células que carregam CSC-biomarcadores. Assim, postulamos que a doença fase avançada não proíbe (e pode ser vantajosa) para a associação de biomarcadores específicos com fenótipos funcionais. Por conseguinte, a nossa abordagem para a descoberta biológica enfatiza a concepção bioensaios funcionais apropriados para caracterizar ambos os fenótipos biologia celular e molecular iniciação do tumor subjacente, bem como a progressão do tumor.

O cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade por câncer em homens e mulheres; com cancro de não pequenas células do pulmão (NSCLC), que representa 80-85% dos casos [1]. Para compreender a biologia subjacente a esta elevada mortalidade, nós selecionamos um modelo de doença em estágio avançado (MPE). pacientes com câncer de pulmão que se apresentam com MPE tem mortalidade significativamente maior do que aqueles sem MPE, ou aqueles que têm derrames citologia negativos [2] – [4]. Assim, a carga MPE-tumor está imbuída de propriedades biológicas que diminuem a sobrevida de pacientes com câncer. Importante, a população tumoral MPE grandes quantidades é composta de subpopulações heterogéneas [5]. Em parte, essa heterogeneidade pode ser caracterizado por biomarcadores tipicamente associados a características de CSC (CD44, ALDH, cMET, CD166, MDR-1, uPAR, PTEN, OCT-4, o IMC-1, hTERT, SUZ12, EZH2).

um dos objectivos do presente estudo foi determinar se pudéssemos identificar um subconjunto de células tumorais que exibia um aumento da competência para a propagação do tumor e manutenção, e para começar a caracterizar as bases moleculares para essas propriedades. O primeiro estudado CD44 como um marcador de selecção para células previsto para ter um elevado potencial tumorigénico porque tem anteriormente identificados CSC em vários cancros epiteliais, incluindo cancro da mama [6], cabeça e pescoço, [7], [8], pancreático [9], [10], e da próstata malignas [11] – [15]. CD44 é altamente expressa em diferentes subtipos de câncer de pulmão, [16], e sua expressão está relacionada com pior prognóstico em pacientes [17]. Estudos recentes em linhas celulares de NSCLC também caracterizam CD44

células hi como CSC [16].

culturas MPE-primários contêm uma subpopulação de células que altamente expressa CD44 (CD44

oi). Quando estas células são classificadas a partir das culturas MPE-primárias, eles apresentam alto potencial tumorigénico, incluindo o enxerto de tumores em NOD /SCID IL2γR

camundongos nulos em diluições limitantes de transplantes de células. Estas propriedades são características de CSC. As fracções de CD44

hi células estão associadas com uma expressão elevada de outra CSC-marcador associado ao metabolismo xenobiótico, ALDH. O CD44

oi /ALDH

fenótipo oi é evidente em ambos espinocelular (CEC) e adenocarcinoma (AC) do pulmão, sugerindo que os perfis de marcadores semelhantes podem rotular frações celulares comportamentalmente agressivos (altamente tumorigénicas) em toda a vários ” linhagens “(subtipos histopatológicos) de cancros do pulmão [18].

MPE tumores geralmente apresentam anormalidades hyperploidy e cromossômicas. análise FISH detectou uma anomalia específica comum em 1p36 região, sugerindo que esta região pode desempenhar um papel importante em contribuir para propriedades comportamentais agressivas. A região 1p36 foi previamente identificado para conter o locus que codifica supressor de tumor microARN (miR-34a). A perda da expressão de miR-34a está implicada na progressão do cancro [15], [19]; Este estudo contribui para essa prova. Altamente CD44

células hi tumorigênicos expressar baixo miR-34a, e substituição miR-34a inibe a formação de colónia de CD44

células hi em agar mole. A análise do ciclo celular de CD44

células hi indicaram que estas células altamente tumorigénicas residem na fase G2 do ciclo celular.

Materiais e Métodos

maligno Derrame pleural (MPE) Recolha, Processamento e Cultura celular

Todos os indivíduos do estudo foram submetidos a consentimento informado escrito por um processo aprovado pela revisão institucional bordo (IRB) para os Assuntos de Veteranos-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS) eo estudo foi aprovado pelo IRB -VAGLAHS. MPE espécimes (M-1, M-2 e M-3) foram coletadas de pacientes de Assuntos de Veteranos-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS). As células são cultivadas em presença de 20-30% de MPE (meio de cultura primária ou PCM) como descrito anteriormente [5]. (Informações de Apoio S1 e S2).

Controle de linhas celulares estabelecidas

Duas linhas celulares estabelecidas GM 05399 (fibroblasto normal) e H2122 (cancro do pulmão) foram utilizados no estudo. A linha celular de fibroblastos GM 05399 foi obtido a partir do Instituto Coriell for Medical Research (Camden, NJ). A linha celular foi derivada de um homem caucasiano de 1 ano de idade. A linha de células é mantida no nosso laboratório em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) na presença de 10% de soro fetal de bovino (FBS) [20]. A linha celular de adenocarcinoma de pulmão H2122 foi gerado por Adi Gazdar de um derrame pleural maligno, e adquiridos de Ilona Linnoila e Herb Oie do NCI. Posteriormente, foi depositado na ATCC (NCI-H2122 [H2122] ATCC CRL-5985 ™) [21]. A linha de células é mantida no nosso laboratório em meio RPMI-1640 na presença de FBS a 10% [22], [23]. Ambas as linhas celulares estão disponíveis ao público

Os anticorpos

Os anticorpos seguintes foram usados ​​para citometria de fluxo FACS /Ordenar:. Rato anti-humano IgG2b CD44-FITC, (BD Biosciences # 555478); FITC do rato IgG2b controle κ Isotype, BD Biosciences # 555742); rato CD44 anti-humano marcado com PE (BD Pharmingen # 555479); PE Mouse Mouse IgG2b controle κ Isotype, BD Biosciences 555743. Anti-CD166-FITC (monoclonal de rato; IgG1 Setrotech # MCA 1926F, não marcado anti-cMET (IgG2a principal do mouse, Abcam # 49210), uPAR anti-(IgG de rato, Santa Cruz Biotech # 13522), o anticorpo secundário utilizado para o estudo foram utilizados: cabra (Fab ‘) 2 de anti-IgG de ratinho (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratórios # M35018)

a imuno-histoquímica (. IHC)

tecido de câncer de pulmão humano primário (carcinoma de células escamosas: SCC e adenocarcinoma:. AC) ou tecido controle de pulmão humano (alveolar normal humana e tecidos bronquiais) foram obtidos a partir da instalação do núcleo Departamento UCLA de Patologia tumores de xenoenxerto derivada de CD44

células hi injetados no NOD /SCID (IL2rγ

nulos) ratos foram removidos cirurgicamente, cortado em pedaços 0,3-0,5 mm e fixadas em etanol (Fisher Scientific) ou Z-fix (Anatech, MI). para IHC, seções 3-5 μ seções foram cortadas e desparafinados e processadas para recuperação antigênica [5] e coradas para expressão do marcador. Inicialmente secções de tecido foram corados com coloração de anticorpos marcador único (CD44 ou ALDH). Uma vez que as condições foram optimizadas para a coloração de antigénio único, em seguida, a coloração de antigénio duplo (CD44 e de ALDH) de secções de tecido foi alcançado. cortes de tecido embebidos em parafina foram desparafinados e reidratadas. Após a recuperação de antigénios (tampão de citrato de sódio 10 mM, pH 6,0 por vapor de 25 minutos) e o bloqueio, as peroxidases endógenas foram temperadas (3% H

2O

2 em 1% de azida de sódio com PBS, 30 minutos em temperatura ambiente) . As lâminas foram incubadas com anticorpo policlonal primário de coelho para ALDH1A1 (Abcom Inc. Cat # ab51028), durante a noite a 4 ° C. As lâminas foram lavadas com PBS e incubadas com EnVision + System-HRP etiquetado Polímero Anti-coelho (Dako Cat # K4003) durante 30 minutos. As lâminas foram incubadas em DAB (Vector Peroxidase Substrate Kit # SK-4100 com níquel Sol) durante 10-20 minutos e, em seguida, as lâminas foram lavadas 5 minutos 3 vezes com PBS. Para a coloração dupla com CD44 (R D Systems, monoclonal de ratinho IgG, Cat # BBA 10), as lâminas foram também incubadas no anti-soro primário à temperatura ambiente durante 1 hora, seguido pelo anticorpo secundário, biotinilado anti-IgG de ratinho ( Vector Cat # 9200) e, em seguida, ABC kit (Cat Vector # AK-5000) e kit Vector Red fosfatase alcalina do substrato I (Vector Cat # SK-5100), desenvolvido por 20 minutos. Os cortes foram contra-coradas com hematoxilina de Harris, desidratados em álcool graduado, apuradas em xileno e montadas em lâminas de vidro com tampa de deslizamento. Os cortes corados foram examinados sob um microscópio (Leica-Leitz DMRBE ou Olympus 1 × 71) e áreas positivas ou dupla antígeno expressar determinadas por patologistas na UCLA.

Citologia e citometria de fluxo (FACS)

Fotomicrografias foram tiradas usando o microscópio Leica- Leitz DMRBE equipado com uma câmera CCD e análise FACS foi feito usando o Becton Dickinson FACSCalibur Analytic Citómetro de fluxo [5]. Separação de células foi realizada utilizando o Becton Dickinson FACSVantage SE Sorting Citómetro de fluxo na instalação do núcleo citometria de fluxo UCLA-CMCA.

Inverter Transcriptase- PCR (RT-PCR) Análise de Expressão Gênica

A amostras primárias foram os primeiros classificados em CD44

CD44

populações lo oi e. As células foram colhidas e o ARN foi extraído utilizando Trizol e estojo de isolamento de ARNm Fast Track 2.0 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) e foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de RT [5]. As amostras foram utilizadas para PCR para a amplificação de Bmi1, hTERT, SUZ12, EZH2, e genes de Oct4. Foram utilizados os seguintes iniciadores:

Bmi1

Adiante – 5 ‘AATCTAAGGAGGAGGTGA 3’, Reverse-5 ‘CAAACAAGAAGAGGTGGA 3’,

hTERT

Adiante -5 ‘GGAATTCTGGAGCTGCTTGGGAACCA 3’, e Reverse-5 ‘CGTCTAGAGCCGGACACTCAGCCT -TCA 3 ‘,

SUZ12

Atacante -5′ GATAAAAACAGGCGCTTA-CAGCTT 3 ‘, e Reverse-5’ AGGTCCCT-GAGAAAATGTTTCGA 3 ‘,

EZH2

Encaminhar 5′ TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC 3 ‘, e reverso -5 ‘TCCCTAGTCCCGCGC-AATGAGC -3’, e ‘CAACTCCGATGGGGCCCT 3’ Oct4 Forward-5, e reverso -5 ‘CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG 3’. As condições para as amplificações de genes diferentes foram descritos anteriormente [5]. Os produtos de PCR foram separados por 8% de gel de TBE (Tris, 50 mM de borato, pH 8,0, EDTA 1 mM) seguido por coloração com brometo de etídio. Os géis foram analisados ​​utilizando o software Kodak 1D.

Colony Eficiência Formação Ensaio

In vitro

ensaios de colónia-formação foram realizadas como descrito [12]. Ordenada CD44

e CD44

células Lo hi foram plaqueadas a uma densidade clonal (100-500 células /poço) em placas de cultura de tecidos de seis poços em triplicado. Holoclones com 20 culas foram contadas ao fim de 10 dias de cultura. Os resultados são expressos como percentual de eficiência de clonagem.

Formação Spheroid em Agar Ensaio macio

Ordenado CD44

células lo hi e CD44 foram semeadas a 1000 células /poço em triplicados em placas de cultura de seis poços contendo 0,35% de agar superior em camadas sobre 0,5% agar base (DNA Grade) contendo PCM. As colónias foram contadas em 3 semanas após o plaqueamento, os resultados representam a média de três experiências independentes.

tumorigenicidade em NOD /SCID (IL2rγ

nulos) Ratos

Todos os ratos trabalhar protocolo relacionado para o estudo foi aprovado pela Comissão Cuidado e Uso Institucional animal na UCLA /VAGLAHS. CD44

oi e CD44

células lo foram classificadas por FACS e injetado em doses diferentes de células (300 /rato, 3000 /mouse e 30000 /mouse) à direita e esquerda, respectivamente, em NOD /SCID (IL2γ

nulo) ratos em 100 ul de solução salina. Os ratinhos foram monitorizados para o crescimento de tumores em ambos os flancos. Os resultados são representados como médias de grupo de volume de tumor, como descrito [24].

miR-34a transfecção Estudos

Para analisar os efeitos que o miR-34a tem na eficiência a formação de colónias no ensaio de agar mole os CD44

células hi foram transitoriamente transfectadas com miR-34a (AM17100, Applied Biosystem /Ambion) ou o controle negativo (mexidos) oligonucleotídeo. Da mesma forma CD44

células lo foram transitoriamente transfectadas com inibidor anti-miR-34a (# AM17000, Applied Biosystem /Ambion) ou controle negativo anti-miR oligonucleotídeo (# AM17010, Biosystem Aplicada /Ambion). A transfecção foi realizada com CD44

CD44

células Lo usando Lipofectamin 2000 (Invitrogen) em placas de 6 cavidades, com 50000 células /poço com 100 pmol de miR, anti-miR e controlo mexidos /oligonucleótidos ou oi. Após 2 dias de transfecção as células foram recolhidas e ensaiadas quanto à eficiência colónia de agar macio formar, conforme descrito acima.

fluorescente in situ fluorescente (FISH) Análise do MPE Amostras

estudos de FISH foram realizados de acordo com protocolo estabelecido [25]. LSI 1p36 sonda foi marcada com laranja espectro e LSI 1q25 sonda foi marcada com espectro verde e hibridado com metáfase barrar tal como descrito anteriormente [25], [26]. Resumidamente, metáfase foram preparados por procedimentos citogenéticas convencionais. As sondas marcadas foram hibridados e lavagens foram realizadas em condições idênticas de rigor. As lâminas foram hibridadas a 37 ° C durante a noite com 1-4 ng de sonda, 50% de formamida, 10% de dextrano, SSC 2 ×, e 50 ng de ADN Cot 1 para suprimir sequências repetitivas. cromossomas em metafase foram contra-coradas com 4,6-diamidino-2 fenilindol (DAPI) em solução Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Cariotipagem de cromossomas foram realizadas de acordo com protocolos estabelecidos.

Inverter Transcriptase- quantitativa PCR (RT-qPCR) Detecção de miR-34a em MPE amostras

O ARN total foi isolado a partir de amostras utilizando TRIzol. miR-34a foi medido pelo sistema de PCR em tempo real (Applied Biosystems, CA) Passo Um Plus usando Taq-Man MicroRNA Ensaios (Applied Biosystems, Foster City, CA) e normalizado por níveis RNU48. 3 ul de 20 ng /ul de ARN total foi utilizado para realizar transcriptase reversa de reacção (RT) (30 min a 16 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 min a 85 °), utilizando dNTPs 10 mM, enzima MultiscribeRT, 10 × RT tampão, inibidor de RNase, iniciadores Taqman RT e água num volume total de reacção de 15 ul. Para qPCR, 10 ul de 2 × Taqman Universal PCR Master Mix (n AmpErase UNG da ABI), 7 ul de água, 1 ul de Taqman iniciador (miR-34a e RNU48) e 2 ul de cDNA para cada reacção foi utilizado, na sequência protocolo de amplificação (10 min a 95 graus, 15 seg para 95 graus, 60 seg a 60deg para 40 ciclos) utilizando o sistema de PCR em tempo real Step One Plus (Applied Biosystems, CA).

Superfície marcador Labeling e celular análise do ciclo de

As células foram coradas com CD44-FITC e PI (iodeto de propídio) para análise do ciclo celular (modificado de UCLA /citometria de fluxo protocolo de instalação de núcleo). Resumidamente, 1 x 10

6 única suspensão de células foi lavada com PBS /2% de PCM, sedimentadas e marcadas com rato anticorpo anti-CD44 humano IgG2b-FITC (BD Biosciences # 555478) durante 45 min. à temperatura ambiente no escuro, o anticorpo de controlo foi utilizado como controlo negativo. As amostras foram re-suspensas em 1 ml de tampão contendo 10 microgramas /ml de PI e 11.25 unidades Kunitz de RNase e incubar durante pelo menos 30 min a 4 ° C no escuro e analisadas sobre o citómetro de fluxo dentro de 30 min de coloração PI .

análise estatística

Os dados são representados como média ± SD e foram analisados ​​com dois lados

t

foi utilizado o teste pelo Excel e análise de medidas repetidas de variância (ANOVA) para comparação entre os grupos de SAS 9.3. A

P

valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

CD44 Expressão perfil de MPE Derivado Células Tumorais

células MPE-tumorais pode ser isolado. e expandido em culturas primárias de curta duração na presença de MPE células do líquido e não tumorais autólogas [5]. populações heterogéneas, incluindo candidato CSC, estão presentes na população tumor MPE-, tal como reflectido pela expressão variável do CSC-biomarcadores: c-MET, uPAR, MDR1, CD166, CD44, e ALDH. Assim, para além de

intra heterogeneidade morfológica tumoral

, existem diferenças nas intensidades de rotulagem superfície CD44, e essas diferenças podem ser explorada para separar subconjuntos de células [5].

As culturas primárias a partir de MPE-três amostras diferentes (M-1, M-2 e M-3), incluir variantes morfológicas (plana, oval e formas arredondadas) por microscopia de luz (Figura 1A, B). Até o 4

th semana de cultura, as células tumorais aderentes exibir um padrão de morfologia mais homogênea em cultura (Figura 1C). células cultivadas uniformemente CD44 expressa em todas as três amostras de tumor (Figura 1D), mas a intensidade de marcação é altamente variável entre e dentro da mesma amostra. Assim, comparado com as células marcadas com o anticorpo secundário sozinho, as amostras são 96%, 99% e 98% positiva para CD44; no entanto, a fluorescência intensidade média (IFM) de rotulagem CD44 são 10861, 5295 e 2120, respectivamente. Assim, a intensidade de marcação de superfície de expressão de CD44 podem variar de 2 a 5 vezes entre as amostras de tumor, e normalmente há uma grande variação na rotulagem média CD44 superfície

dentro

amostras individuais.

O tumor células de M-1, M-2 e M-3. (A) 100 × (2-3 semanas). (B) 400 × (2-3 semanas). (C) Os estágios posteriores da cultura 100 × (6-10 semanas). (D) CD44- FACS padrão de expressão e MFI. (E) Triagem de CD44

oi e CD44

células lo (5-10%). As células classificadas CD44

oi e CD44

lo foram lavadas e semeadas no PCM por 2-3 dias para avaliar suas diferenças morfológicas. (F) Morfologia do CD44 classificadas

células oi e (G) CD44

células lo ordenados foram semelhantes (100 ×). A pureza dos CD44

células lo hi e CD44

foram ≥98%, como revelado pela análise pós sort (dados não mostrados).

A ausência de diferenças morfológicas entre CD44

hi e CD44

células lo

culturas MPE-primárias adquirir um padrão morfológico mais homogêneo do crescimento ao longo do tempo. Para determinar se as diferenças sutis na morfologia cultura poderia distinguir o CD44

oi de CD44

culturas lo, o M-1, M-2 e M-3 amostras foram marcadas com anticorpo anti-CD44 e ordenados por FACS, com portões fixado em 5% das células no marcador CD44 alta e baixa expressão de CD44 marcador (Fig. 1E). A pureza dos CD44

células lo hi e CD44

foram ≥98%, como revelado pela análise pós sort (dados não mostrados). As células classificadas CD44

oi (Figura 1F) e CD44

lo (Figura 1G) foram lavadas e semeadas no PCM por 2-3 dias para avaliar suas diferenças morfológicas. Estes estudos sugerem que não há diferença distintiva na morfologia cultura associada com a expressão de CD44 de superfície.

CD44

Células hi mostram alta Formadoras de Colônias Capacidade

Para investigar se a CD44

oi as células são funcionalmente diferentes das CD44

lo em células de colónias formando eficiência, que classificados e culturas destes subconjuntos das três amostras (M-1, M-2 e M-3). 100-500 células de CD44

ou CD44

células Lo hi foram plaqueadas em poços individuais de placas de 12 poços. Embora não somos capazes de detectar diferenças significativas na eficiência inicial em placas, mas nós observamos que CD44

células hi são mais competentes na formação de holoclones do que os CD44

células lo (

t

de teste e ANOVA: P 0,05) (Figura 2A). Assim, uma diferença biológica intrínseca entre CD44

oi e CD44

células lo parece uma competência diferencial inerente holoclones formando.

As células classificadas CD44

oi e CD44

lo a partir MPE amostras foram analisadas em triplicado para a sua (a) a eficiência clonal (amostra M-1: colônias CD44

oi = 35,8 (DP = 5,04) vs CD44

lo = 21,7 (DP = 6,2) (P = 0,03) ; Amostra M-2 colônias CD44

oi = 59,8 (DP = 3,2) vs CD44

lo = 40,6 (DP = 4,1) (P = 0,003); Amostra M-3 colónias CD44

oi = 53,4 ( DP = 5,3) vs CD44

lo = 33,9 (DP = 3,6) (P = 0,006)); O efeito médio de CD44

oi contra CD44

lo é (IC 95%: 8,31, 26,89: p = 0,015) 17.6. (B) formadoras de colônia capacidade em agar mole. (Amostra M-1: colônias CD44

oi = 16,6 (DP = 1,1) vs CD44

lo = 8 (DP = 1,1) (P = 0,0006); Amostra M-2: colônias CD44

oi = 27 (DP = 7) vs CD44

lo = 12 (DP = 3) (P = 0,02); Amostra M-3: colônias CD44

oi = 24,3 (DP = 6,1) vs CD44

lo = 12,6 (DP = 2,5) (P = 0,03)). O efeito médio de CD44

oi contra CD44

lo é (IC 95%: 3,41, 20,14; P = 0,026) 11.8. Colunas, média de três experiência independente; SD, *,

P Art 0,001, em comparação com os CD44

grupos eis que (estudante

t

teste). (C) colónias em agar mole derivados de CD44

células hi (100 ×) e (D) CD44

Células lo (100 ×). (E) perfil de expressão de IMC-1, hTERT, SUZ12, EZH2 e OCT-4 em ordenadas CD44

e CD44

células lo hi foram analisados ​​por transcriptase reversa-qPCR. Na amostra M-3 apenas o IMC-1 é expresso em alto nível em CD44

oi população do que o CD44

população de células lo. Na amostra M-2 ligeira maior expressão de hTERT em CD44

células hi do que CD44

células lo. O CD44

população oi da amostra M-1 expressa nível elevado de IMC-1, hTERT, SUZ12, EZH2 e OCT-4, que CD44

população lo.

CD44

células hi mostram alta Spheroid capacidade de formação em agar mole culturas

Outra medida substituta comumente usado para caracterizar CSC é uma competência diferencial na formação de colônias “de ancoragem independentes” em agar mole [12]. CD44

células lo hi e CD44

a partir de amostras (M-A-1, M-10-26 e M-8-15) foram avaliados por plaqueamento das células classificadas em agarose suplementado com PCM. Os CD44

células hi de todas as três amostras apresentam uniformemente maior eficiência formação esferóide que os CD44

células Lô (

t

de teste e ANOVA: P 0,05) (Figura 2B). Os mais robustos CD44

colônias hi também são qualitativamente distinguível de colônias vestigiais formadas por CD44

células Lô (Figura 2C em relação 2D). Assim, CD44

células hi possuem maior competência na formação de colónias em ágar mole do que os CD44

células lo derivadas da mesma biospecimen câncer de pulmão.

CD44

Células hi Variably Mostrar características moleculares que caracterizar CSC

marcadores que identificam

candidato

CSC (hTERT, SUZ12, OCT-4 expressão etc.) são evidentes em pellets de células isoladas das MPE amostras [5]; Assim, CSC são um componente susceptível de a mistura de MPE-tumoral. Tais marcadores CSC são variavelmente composta por componentes protéicos embrionário ou Polycomb e sua expressão pode prever a rotulagem dos subconjuntos de células que possuem alto potencial carcinogénicos ou colônia formando [27]. Para determinar se estes

candidato

marcadores CSC foram limitados a CD44 específico classificadas subconjuntos, que exibiu o CD44

oi e CD44

lo subpopulações de células para a expressão de mRNA diferencial; amplificação RT-PCR de IMC-1, hTERT, SUZ-12, EZH2 e OCT4 foi realizada. Indexados ao ARNm da beta-tubulina, existe uma grande variabilidade na expressão destes marcadores dentro dos subconjuntos de células classificadas-CD44 (Figura 2E). Por exemplo, o IMC-1 e mRNA hTERT é mais altamente expresso em CD44

células hi do que os CD44

células lo em amostra M-3 e M-2, respectivamente. Apenas em amostra M-1, as distribuições esperados de marcadores CSC (IMC elevado, hTERT, SUZ12, EZH2 e OCT-4) são evidentes em CD44

células hi do que os CD44

células lo.

estes resultados indicam que 1) marcadores moleculares que codificam modificadores da estrutura da cromatina ou genes embrionários pode estar presente em ambos os subconjuntos altamente tumorigénicas e não tumorigénicas de populações de células de cancro indivíduo pulmonares, e 2) que é marcada variabilidade na expressão diferencial de esses candidatos “CSC-biomarcadores” em biospecimens câncer de pulmão.

CD44

células hi formar tumores em NOD /SCID (IL2rγ

null) Ratos

Como marcadores moleculares específicos não pode de forma confiável diferenciar tumorigénico de subconjuntos de células não tumorigénicas, podemos distinguir estes subconjuntos com base fenótipos comportamentais? O CD44

hi e CD44

subpopulações de células lo a partir de populações de células tumorais individuais consistentemente apresentam diferenças em holoclone aderente e formação de colónias em agar mole. Uma medida experimental chave do “CSC”, no entanto, é pela demonstração de maior potencial tumorigénico em modelos de ratos. Tem sido demonstrado que NOD /SCID (IL2rγ

ratinhos nulos são o modelo sensível para avaliar a fenótipos comportamentais CSC- altamente tumorigénicas [16], [28]. Para corroborar diferenças observadas na formadoras de colónias e esferóide formando habilidades de CD44

oi vs CD44

células lo com

in vivo

tumorigênese, investigamos sua capacidade de formar tumores em NOD /SCID (IL2rγ

null) camundongos.

diluições limitantes (30.000 ; 3000; 300) de ordenados CD44

células lo hi e CD44

de M-1 e M-2 MPEs foram injectadas na direita e flancos, respectivamente, de NOD /SCID (IL2rγ

null) esquerda. CD44

hi células tumorais da amostra M-1 formado tumores em 3/3 ratinhos a ambos 30.000 e 3.000 injectado doses de células, e em um dos 3 ratinhos injectados com 300 células de tumor (Figura 3 a, B, C). o período de latência de tumores foi de 50-90 dias, a 90-150 dias e 150 dias, para 30.000; 3.000 e 300 CD44

células hi respectivamente (Figura 3E) Assim, a cinética de formação de tumores pelo CD44 altamente tumorigênico

células hi foi dependente da dose. O CD44

células tumorais hi de amostra M-2 tumores gerados em 2 de 3 ratos em 30.000 células tumorais com um período de latência de 90-100 dias, um período de latência superior ao observado em CD44

células hi de amostra M -1 (Figura 3E). Assim, embora CD44

células hi consistentemente exibir potenciais mais elevados do que tumorigênicos CD44

células lo da mesma amostra, as amostras tumorais individuais podem exibir diferentes cinética de crescimento na avaliação de propriedades CSC em bioensaios comportamentais.

(a) tumorigenicidade e período de latência de CD44

células hi (M-1) injectados com a 30.000; 3.000 e 300 células. Camundongos injetados com CD44

oi (flanco direito) tumores formados e CD44

células lo não formar tumores (flanco esquerdo). Os números (1/3, 2/3 ou 3/3) representam o número de animais com tumor /grupo em particular o ponto momento da medição. O período de tempo de dias após a implantação do tumor é expresso ao longo do eixo X e do volume do crescimento do tumor é expresso como mm

3 ao longo do eixo Y. tumores primários parentais não separados implantados com 500.000 células /ratinho não demonstraram qualquer crescimento do tumor, mesmo depois de 3 meses de implantação de células tumorais (dados não apresentados) (B) Os ratinhos portadores de tumores no flanco direito injectados com CD44

células de hi e nenhum tumor foi detectado no flanco esquerdo injetado com CD44

células lo (C) tumores ressecados formadas por CD44

células hi em camundongos. (D) Análise FACS de células individuais obtidas a partir de tumores de ratinho derivadas de CD44

hi células de M-1 MPE amostra. As células tumorais mostraram expressão de CD44, c-met, uPAR e CD166 marcadores. (E)

ratos hi e CD44

células lo de amostras M-1 e M-2 em NOD /SCID (IL2rγ

null) tumorigenicidade e período de latência de CD44.

Notavelmente, o CD44

células lo a partir de qualquer cultura primária

não formam tumores nos flancos esquerdo dos ratos, durante todo o intervalo de controlo (Fig. 3 B e e). Além disso, nós também fizemos

não

observar a formação do tumor com a injeção de 5 × 10

5

células

indiferenciados, embora esta população presumivelmente continha ~5-10% (ou 25.000 50.000) CD44

células hi. Esta observação sugere que CD44 interessante

hi células podem ser expostas às influências inibidoras para o crescimento do tumor em células que têm uma expressão de CD44 de superfície menor intensidade na mesma população de tumor.

Para testar se CD44 implantado

oi células contribuíram para tumores heterogéneos (sugestivos de diferenciação multipotentes), os tumores gerados a partir de CD44 enxertados

oi a partir de células M-1 foram extirpados, digerido, e análise de marcadores da superfície celular foi realizada por FACS em suspensões de células individuais. As células do tumor permaneceram altamente positiva para o marcador CD44, com 98,2% de células coradas positivamente, embora a CD44-IMF era ainda mais elevada do que as células originalmente implantados. A heterogeneidade entre células foi evidenciada pela expressão variável de outros biomarcadores CSC comumente associados (Figura 3D), [cMET (40,4%), uPAR (47,6%) e CD166 (27,4%)]. Células portadoras desses marcadores também foram previamente detectados nas amostras MPE biospecimen primárias, em frações diferentes [5].