Abstract

A importância da neovascularização para o crescimento do tumor primário e metastático promoveu numerosos ensaios clínicos de inibidores da angiogénese isoladamente ou em combinação com terapias anti-neoplásicos convencionais. Um desafio com o uso de agentes orientadas molecularmente tem sido a desconexão entre a redução de tamanho e comportamento biológico do tumor, ou quando a droga é eficaz quando a resistência do tumor ou emerge. Aqui, nós relatamos a síntese e caracterização de

64Cu-NOTE-bevacizumab como um agente de imagem PET para geração de imagens de conteúdo VEGF intratumoral in vivo.

64Cu-NOTE-bevacizumab avidamente acumulado no 786-O xenotransplantes de carcinoma renal com níveis mais baixos em órgãos de acolhimento. RAD001 (everolimus) marcadamente atenuada

acumulação 64Cu-NOTE-bevacizumab dentro xenotransplantes 786-O carcinoma renal. O tecido tumoral e análise molecular celular validado imagem PET, demonstrando diminuição no conteúdo total e segregada VEGF e activação de VEGFR2. Notavelmente,

PET imagem 64Cu-NOTE-bevacizumab foi concordante com a paragem do crescimento de tumores RAD001. Estes dados sugerem que immunoPET alvo de fatores angiogênicos, tais como VEGF poderia ser uma nova classe de marcadores substitutos complementando os critérios RECIST em pacientes que recebem terapias molecularmente direcionados

Citation:. Chang AJ, Sohn R, Lu ZH, Arbeit JM , Detecção de Lapi SE (2013) da resposta terapêutica Rapalog-Mediated no renal Cancer xenoenxertos Usando ImmunoPET

64Cu-bevacizumab. PLoS ONE 8 (3): e58949. doi: 10.1371 /journal.pone.0058949

editor: Alexander J. Annala, City of Hope, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de julho de 2012; Aceito: 11 de fevereiro de 2013; Publicação: 14 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NCI R01CA159959, o Roe Fundo de Investigação Urologia Beatrice, e do Departamento de Radiologia Mallinckrodt. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a angiogénese, o crescimento de novos vasos sanguíneos, é uma indicação de cancro da promoção do crescimento de tumor, invasão e metástase [1]. tumores nascentes são suportados por oxigênio e nutrientes a partir de vasos sanguíneos próximos, no entanto, como o tumor cresce, o fornecimento de sangue torna-se insuficiente e várias vias de sinalização estimular a expansão neovascularização [2]. Neovasos também pode atuar como condutas metastático tumor [2]. A aparente importância da neovascularização para o crescimento do tumor primário e metastático fomentada numerosos ensaios clínicos inibidor da angiogénese, quer isoladamente ou em combinação com terapias anti-neoplásicos convencionais [3], [4]. Estes agentes de atraso do crescimento do tumor com melhorias iniciais na eficácia terapêutica associada à normalização rede vascular [4]. No entanto, nem todos os pacientes respondem à terapia anti-angiogênico, e resistência quase invariavelmente desenvolve apesar da melhora inicial. Estudos pré-clínicos sugerem que os inibidores de angiogénese aumentar a capacidade de invasão tumoral e metástase [5], embora este reforço agressividade clínica ainda não foi claramente visto em pacientes. Como tal, uma melhor compreensão das limitações e resistência adquirida a inibidores da angiogénese é necessária. redução de secreção do factor angiogénico induzido por terapia testar oferece a promessa de identificação precoce de pacientes que respondem, e uma detecção mais rápida do surgimento de resistência específica do agente.

Factor de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) tem um papel central na angiogénese e possui emergiu como um alvo terapêutico importante. a expressão de VEGF é induzida em doenças malignas através de vários mecanismos. Ao nível da transcrição, o VEGF é um alvo importante dos factores hipoxia-induzida heterodiméricas (HIFs) [6]. HIFs são compostos de, alfa instável (HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α) e subunidades beta expresso constitutivamente (HIF-1β) [6]. Em normoxia, prolilo e asparaginilo hidroxilases criar sítios de ligação para o E3 ubiquitina ligase de von Hippel Lindau (VHL) e proteína de inibir a actividade de transcrição HIF, respectivamente. Durante a hipóxia, os hidroxilases dependente de oxigénio são inibidas, factores de HIF1 /2 de transcrição são estabilizadas, e angiogénico, metabólica, e haste genes alvo celular são induzidas. Além de VEGF, factores de transcrição HIF regular positivamente vários factores angiogénicos [7]. No entanto, dados recentes em um modelo não-doença de HIF-1 ganho de função demonstra que o VEGF é a mais importante para a indução neovascular [8]. Como a perda da função BVS subjacente de células claras de desenvolvimento carcinoma renal [9], estes tumores são particularmente hypervascular devido à indução HIFα mediada por múltiplos fatores angiogênicos incluindo VEGF [6].

Além de fator de transcrição sobre-expressão, a fosfoinositida 3-quinase (PI3K) é um módulo paralelo regulação HIF- e produção de células de tumor factor angiogénico-dependente de VEGF [10]. A via PI3K é hyperactivated na maioria dos cancros humanos devido a vários mecanismos [11]. alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) é uma serina-treonina-quinase a jusante de PI3K. mTOR reside dentro de dois complexos localizados em compartimentos intracelulares distintos e cada um possuindo funções específicas [12], [13]. mTORC1 regula a síntese de proteínas em vários níveis, incluindo a iniciação de translação e biogênese do ribossomo [14]. As subunidades HIFα e VEGF são alvos mTORC1 traducionais, e são funcionais em células malignas normóxicas com a activação de PI3K [15]. mTORC2 modula várias funções do microambiente celular e secundário, incluindo a sobrevivência celular, motilidade, proliferação e angiogenese através do seu AKT alvos, SGK, e PKC, e HIF-2α. Tal como PI3K e mTOR também estão a jusante de VEGFR2, a sinalização do receptor de VEGF em células endoteliais principais [16], a mTOR tem um potencial de dupla função neovascularização em ambos os tumores e células endoteliais.

Devido à sua sobre-regulação perto ubíqua, há tem havido um interesse clínico intenso na via mTOR visando em tumores sólidos. A rapamicina e os seus análogos, everolimus, temserolimus, e deforlimus, (rapalogs), ligam-se à ciclofilina, FKBP-12, inibir a formação de um complexo mTORC1 [17]. atividade mTORC2 é inibida com a exposição rapalog prolongada em algumas linhas celulares [18], provavelmente devido ao sequestro de mTOR recém-sintetizado em complexos rapalog inativos. Em estudos pré-clínicos iniciais, a rapamicina foi demonstrado para diminuir o crescimento do tumor e neovascularização [19]. Em outros estudos pré-clínicos, everolimus inibiu o crescimento tumoral e a expressão de VEGF [17]. Devido à Fase III dados de eficácia promissores, rapalogs ter sido aprovado para o tratamento de pacientes com cancro metastático das células renais (RCC) [20]. No entanto, a resistência à terapêutica, quer esteja presente no início ou também se desenvolve durante rapalog tratamento [21]. Várias publicações recentes e passados ​​destacaram tanto a sinalização de desvio, ou ganho genético da função de alvos a jusante de mTOR [22] – [24]

Como VEGF é um marcador de ativação mTOR jusante e um motor da angiogênese, a sua. nível de expressão pode qualificar-se como um marcador de sensibilidade rapalog. Bevacizumab é um anticorpo monoclonal humanizado que liga-se a todas as isoformas de VEGF [25]. Estudos anteriores sugeriram que o bevacizumab radiomarcado pode de forma não invasiva imagem e quantificar a expressão de VEGF [26] – [28]. Embora

64Cu-DOTA (ácido 1,4,7,10 tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético) -bevacizumab mostrou resultados promissores para a imagem latente pré-clínico VEGF xenotransplante [28], a acumulação hepática melhorada associada com o conhecido na vivo instabilidade do cobre-DOTA, nos motivou a investigar um quelato de cobre mais estável. Um trabalho recente por Zhang

et ai

usando NOTE (1,4,7,10 tetraazacyclonoane-N, N ‘, N “, – ácido triacético). como um quelato para

64Cu-bevacizumab ilustrada a superioridade deste complexo para imagiologia por PET [29]. Aqui usamos e avaliou o marcador PET específica VEGF

64Cu-NOTE-bevacizumab para monitorar mudanças para rapalog administração. Em primeiro lugar, testou a eficácia de imagens de

64Cu-NOTE-bevacizumab em xenoenxertos de carcinoma renal, um tumor com superexpressão de VEGF marcado. Em seguida, testamos

64Cu-NOTE-bevacizumab como um indicador de resposta tumoral inibição do mTOR. Nosso estudo demonstra que este marcador PET anticorpo conjugado pode vir a ser útil tanto para selecionar e continuar pacientes em terapias moleculares dirigidas fatores de crescimento angiogénicos segregados.

Materiais e Métodos

Síntese de

64Cu

-NOTA-bevacizumab

64Cu foi produzido através do

64Ni (p, n)

64Cu reação nuclear usando o CS-15 ciclotrão (ciclotrão Corporation, Berkeley, CA) e separado via de permuta iónica como previamente descrito [30]. Bevacizumab (Avastin ™, Genentech /Roche, South San Francisco, CA) foi incubada numa razão molar 01:05, com 2- (pisothiocyanatobenzyl) ácido -1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (SCN- Bz-NOTA) (Macrocyclics, Dallas, TX) em 0,1 M de NaHCO

3 tampão de pH 9,0 durante 30 min. O produto resultante, NOTE-bevacizumab, foi purificado por meio de rotação Zeba dessalgar Colunas (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

64Cu foi complexado com NOTE-bevacizumab a uma razão de 666 MBq /mg (18 mCi /mg) de anticorpo em 0,1 M de NH

4OAc tampão de pH 5,5 a 37 ° C durante 1 hora com agitação constante.

64Cu-NOTE-bevacizumab foi purificado usando colunas Zeba rotação de dessalinização (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) e pureza radioquímica foi determinada por cromatografia de exclusão de tamanho analítica (Superose 12 10/300 GL, GE Healthcare, Piscataway, NJ) com HEPES 20 mM e NaCl 150 mM (pH 7,3), eluída a um caudal de 0,75 mL /min. Millenium 32 de software (Waters, Milford, MA) foi utilizado para quantificar os cromatogramas por integração.

64Cu-NOTE-bevacizumab foi incubada a 37 ° C com soro humano durante 48 horas e avaliadas quanto à estabilidade com cromatografia de exclusão de tamanho.

radiofármaco Ligação Cinética

VEGF

165 (R D Systems, Minneapolis, MN) foi diluída em série em concentrações de 0,5-vezes variando de 10 ng /mL até 0,4 ug /mL em tampão de revestimento de bicarbonato (na 5 mM de

2CO

3, NaHCO 35 mM

3, pH 9,6). 50 ul de solução de VEGF a cada concentração foi pipetado em triplicado aos poços de uma placa de 96 poços e incubadas durante a noite a 4 ° C. A placa foi lavada 3 vezes com 200 ul de PBS, seguido da adição de 100 ul de 1% de BSA (Sigma, St. Louis, MO) em PBS, para bloquear os locais de ligação de proteína restantes em cada poço. Após incubação durante a noite a 4 ° C, cada cavidade foi lavada 4 vezes com 200 ul de PBS. 74 kBq /0,1 ug (2 uCi) de

64Cu-NOTE-bevacizumab em 100 ul de PBS foi adicionado a cada poço e incubou-se à temperatura ambiente durante 2 horas. Não consolidado

64Cu-NOTE-bevacizumab foi cuidadosamente removido, cada poço foi lavado 3 vezes com 200 ul de PBS + 0,1% de Tween 80 (Sigma, St. Louis, MO), em seguida, 200 ul de solução de NaOH 0,2 N foi adicionada a cada bem e incubou-se durante 15 minutos. A radioactividade foi recolhido para cada cavidade e contadas num contador gama.

Tumor Modelo de Xenoenxerto

786-O (CRL-1932, ATCC, Manassas, VA), células de carcinoma das células renais foram cultivadas em meio RPMI um meio suplementado com soro fetal bovino a 10%, e 1% de penicilina /estreptomicina. Login células em fase foram recolhidas, ressuspensas em meio a 1 × 10

5 /mL e 1 × 10

6 células foram injetadas por via subcutânea nas orelhas de camundongos NCr-nu /nu atímicos 6-8 semanas de idade (NCI , Frederick, MD). Os tumores foram obtidas imagens de 3 semanas após a injecção, com um tamanho do tumor de 94,9 mm

3 (n = 4 ratinhos por grupo). Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as Diretrizes do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de investigação e com aprovação do Comitê de Estudos em Animais da Universidade de Washington.

radiofármaco Biodistribuição Estudos

In vivo

estudos de biodistribuição foram realizadas com ratinhos nus atímicos (n = 4 ratos) para determinar a absorção de

64Cu-NOTE-bevacizumab em xenoenxertos de cancro da 786-S de células renais, em relação a órgãos normais. i.v.

64Cu-bevacizumab, 0,555 MBq /0,83 ug, 15 uCi, foi injectado, ratos sacrificados 24 horas mais tarde, e a absorção específica de tumores e seleccionar órgãos foi medida usando um contador gama com fundo e correcção de decaimento. recaptação específica foi expressa como% de dose injectada por grama de tecido (% ID /g), tal como calculado por normalização para o total da actividade injectada, utilizando uma quantidade conhecida de actividade injectada como um padrão.

Estudos animais de companhia pequeno

Small PET /animais experiências de TC foram realizados com o scanner Inveon MicroPET /CT (Siemens, Knoxville, TN).

64Cu-bevacizumab intravenosa (2.96-3.7 MBq /4,4-5,5 ug (80-100 uCi) em 100 mL de 0,9% de solução salina estéril) foi injectado Vinte e quatro horas mais tarde, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano a 2% e fotografada. imagens estáticas de vinte minutos (n = 4 ratinhos para cada grupo de tratamento) foram recolhidas e co-registadas com o software de exibição de imagem (Inveon Investigação do local de trabalho, Siemens, Knoxville, TN). As regiões de interesse, incluindo o tumor e músculo foram de contorno, e os valores de absorção padrão (SUV) para tumores foram determinados utilizando a seguinte fórmula: SUV = [(MBq /mL) x (. Peso dos animais (g)) /dose injectada (MBq) ].

Tratamento RAD001

RAD001 (everolimus) emulsão (Novartis, San Diego, CA) foi administrada por sonda gástrica diariamente às 10 mg /kg de peso corporal. Os animais de controlo receberam uma emulsão de placebo (Novartis formulação proprietária). Após as experiências de imagiologia iniciais descrito acima, os murganhos foram administrados RAD001 ou veículo durante 7 dias consecutivos e, subsequentemente, re-fotografada com

64Cu-NOTE-bevacizumab (2,96-3,7 MBq /4,4-5,5 ug) como descrito acima (RAD001, N = 4, veículo, n = 4 ratos). Os estudos de biodistribuição (como descrito acima) foram realizados após a conclusão da pequena imagem PET animais no dia 7. Para as experiências de crescimento tumoral, um grupo separado de ratinhos de idade de 8-12 semanas portadores de tumores de orelha bilaterais foram tratados com veículo (N = 7 ratos, 14 tumores analisados) ou RAD001 (n = 9 ratos, 18 tumores). o crescimento do tumor da orelha foi determinada por medição das três maiores dimensões perpendiculares e o volume do tumor em mm

3 foi analisada para cada tumor nos dias 7 e 14 do tratamento.

Immunoblotting

RAD001 (n = 3 ratos) e controlo de veículo (n = 3 ratos) tumores de orelha 786-S foram colhidos, homogeneizados em tampão RIPA (Tris 50 mM a pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% nonilfenil-polietileno-glicol ( Nonidet P-40 substituto), 0,1% de SDS, 1% de desoxicolato de sódio, 1% de Triton X-100) suplementado com Cocktail de Inibidor de Protease Inhibitor Cocktail e fosfatase 1 e 2 (todos 1:50; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ). Os lisados ​​tumorais Límpido foram quantificados quanto à concentração de proteína utilizando o kit de ensaio BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) e armazenado a -80 ° C. A proteína total (120 mg) foi separado em géis de SDS-poliacrilamida, transferidas para membranas de PVDF (Invitrogen, Carlsbad, CA), bloquearam-se com leite seco não gordo a 10% em solução salina tamponada com Tris (pH 7,6) contendo 0,5% de Tween 20 (TBST ), e sondados com anticorpos de coelho para S6K

T389, S6K, AKT

S473, AKT, pVEGFR2

Y1175, VEGFR2 (todo 1:1,000, Cell Signaling Technology), anticorpo policlonal VEGF galinha (1:2,500 Ab14078, Abcam) e policlonal de coelho para a β-tubulina (1:35,000, Abcam). Após incubação durante a noite a 4 ° C, as membranas foram lavadas três vezes em TBST, incubados durante 1 hora à temperatura ambiente, em anticorpos secundários ligados a peroxidase de rábano (1:5,000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), e as bandas de proteína foram visualizadas com ECL mais reagente (GE Healthcare, Piscataway, NJ). carga de proteína foi normalizada para p-tubulina.

VEGF ELISA

células 786-S foram cultivadas em placas de 6 poços a uma densidade celular de 3 x 10

5 células por cavidade e cultivada em completa overnight médio. Log-fase as células foram então cultivadas em meio RPMI 1640 isento de soro suplementado com veículo (DMSO) ou 100 nM ou 1000 nM de rapamicina durante 6 horas, o meio foi substituído por 2 ml de meio contendo veículo fresco isento de soro ou o mesmo diferente rapamicina concentrações, e o sobrenadante da cultura celular foi colhido 18 horas mais tarde. Segregada proteína de VEGF no meio condicionado foram quantificados por ELISA em quatro culturas independentes por grupo, utilizando o VEGF humano Quantikine Kit ELISA (R D, Minneapolis, MN). E normalizada para a quantidade total de ADN celular

Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± SD. O Student bicaudal

t

-teste, o teste Mann-Whitney U, de um e dois way ANOVA, e análise de regressão linear (6.0b GraphPad Prism, La Jolla, CA) foram utilizados para testes de significância . Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Síntese e Determinação in vitro

64Cu-NOTE-Bevacizumab VEGF Afinidade de ligação

Como anterior. estudos utilizando

64Cu-DOTA conjugados apresentaram alta de fígado acumulação de radioactividade indicando potencial transmetalação a outras proteínas in vivo [28], [31], optamos por usar NOTA que forma um cobre mais estável complexo [32]. Bevacizumab foi conjugada com NOTA-Bz-NCS e radiomarcados com

64Cu. A eficiência da radiomarcação foi de 92,1% ± 4,7%, a pureza radioquímica foi de 98,1 ± 1,7%, e a actividade específica foi de aproximadamente 644 MBq /mg (17,4 mCi /mg) (n = 5 experiências independentes).

64Cu-NOTE-bevacizumab era estável até 48 horas no soro a 37 ° C, sem produtos de degradação visíveis na análise por HPLC de exclusão de tamanho.

Para testar

especificidade VEGF 64Cu-NOTE-bevacizumab Os ensaios foram realizados de imunorreactividade. VEGF

165 foi plaqueada em triplicado em concentrações incrementais na faixa de 0,4 a 10 mg /mL. A quantidade de ligado

64Cu-NOTE-bevacizumab como uma percentagem da actividade total adicionado foi elevado com o aumento da concentração de 13,3 ± 0,72% a 0,4 ug /ml de VEGF

165-34,4 ± 3,89% com 10 ug /mL de FCEV (Figura 1). Co-incubação com 20 ng excesso de bevacizumab não marcado diminuiu acentuadamente

64Cu-NOTE-VEGF bevacizumab

165 ligação a 2,04 ± 0,35% demonstrando especificidade da imunorreatividade anticorpo radiomarcado (Figura 1).

O aumento da ligação de observou

64Cu-NOTE-bevacizumab com o aumento da concentração de VEGF. O bloqueio de ligação inibida utilizando 20 ug bevacizumab não marcada evidencia a especificidade do marcador. Todos os ensaios foram realizados em triplicado. Bares mostrados são +/- desvio padrão.

64Cu-NOTE-Bevacizumab Biodistribuição e imagem Indica reforçada tumor renal Localização

Para testar

64Cu-NOTE-bevacizumab avidez de um tumor com a expressão de VEGF marcado, estudos de biodistribuição foram realizados em ratinhos nus atimicos com tumores de 786-S da orelha heterotópicos Figura 2A e B). O nível circulante de

64Cu-bevacizumab no sangue foi de 9,3 ± 3,8% da dose injectada por grama (ID /g). captação tumoral foi de 22,0 ± 5,3% ID /g enquanto a captação muscular foi de apenas 1,1 ± 0,4% ID /g. Baço, pulmão, fígado, rim e absorção também foi baixa em 5,8 ± 2,5%, 4,8 ± 1,7%, 5,6 ± 1,4% e 2,6 ± 0,6%, respectivamente. Assim, embora os ratinhos deu dois tumores, um em cada orelha, absorção no tumor orelha única amostrada foi significativamente robusta comparada com sede órgãos. A adição de uma dose de bloqueio 100 ug de bevacizumab não marcada do tumor inibiu significativamente

64Cu-NOTE-bevacizumab absorção que demonstra a especificidade do radiofármaco in vivo (Figura 2A). imaging animais PET pequena demonstrado elevada absorção de tumor de

64Cu-NOTE-bevacizumab (SUV 10.6) (Figura 2B). Como um teste adicional de especificidade, que administrada uma dose iv de bloqueio excesso de 10 vezes de bevacizumab em conjunto com o marcador de PET

64Cu-NOTE-bevacizumab. A absorção de tecido tumoral diminuída dose de bloqueio não marcado três vezes (Figura 2B). Notavelmente, a dose de bloqueio revogada detecção de imagem do tumor (6,3 ± 2,1%), com o sinal residual que emana da piscina traçador sangue (Figura 2B).

Ratos

(A) com 786-O carcinoma de células renais tumores foram orelha iv injectado com 100 uCi de

64Cu-NOTE-bevacizumab (n = 4 ratos). 24 horas após a injecção seleccione órgãos e tumores foram colhidos, pesados ​​e a quantidade de actividade em cada tecido foi determinada num contador gama. A dose injectada corrigida-decaimento% (ID) /g de tecido foi calculada para cada órgão. Uma dose de bloqueio de 100 mg bevacizumab não marcado acentuadamente e, especificamente reduzida captação do traçador tumor sem nenhum efeito detectável na acumulação tracer órgão host. (B) Os ratos com 786-S tumores de orelha de carcinoma de células renais foram administrados 100 uCi de i.v.

64Cu-NOTE-bevacizumab na ausência (painel da esquerda), ou na presença (painel da direita), de anticorpo não marcado 100 ug. Vinte mínimo de exames estáticos foram adquiridos 24 horas após a injecção.

RAD001 Diminui tumor renal alvo fosforilação e VEGF conteúdo

Antes de testar

64Cu-NOTE-bevacizumab PET resposta terapêutica imagiologia, um grupo de ratinhos foi tratado diariamente com RAD001, 10 mg /kg, ou veículo, para determinar o efeito do rapalog na sinalização mTOR tumor e conteúdo de VEGF. Catorze dias de RAD001 produzido indetectável fosforilação da mTOR específica treonina 389 local da proteína ribossomal S6 quinase (Figura 3). Em contraste com trabalho anterior com linhas de células humanas demonstrando rapalog indução PI3K-mTORC2 feedback negativo [33], houve uma fosforilação AKT redução de 15% na serina 473 (pAKT

S473), um alvo mTORC2, consistente com a fixação do rapalog-mTOR [34]. Tratamento RAD001 diminuição da expressão da proteína VEGF tumoral em 60% com uma concomitante redução de 60% em VEGFR2 fosforilação, o VEGF de células endoteliais princípio receptor de sinalização, tal como determinado por normalização para os respectivos controlos tubulina de carregamento (Figura 3A). Para testar os efeitos de células autónomas de rapalogs sobre a secreção de VEGF 786-O, meios condicionados a partir de rapamicina e as culturas tratadas com o veículo foram analisadas quanto ao teor de VEGF. A rapamicina causou uma queda de 20% em VEGF segregada em comparação com o controlo (Figura 3B). Esta resposta parcial das células 786-S poderia ser devido a incapacidade da rapamicina para inibir a metas mTORC1 chave que regulam a tradução de mRNAs “fracos”, como 4E-BP1 [13] (Figura 3). Existem várias explicações para a diminuição mais pronunciada nos níveis de VEGF nos imunoblots versus análise de ELISA. Como medida de ELISA de VEGF segregada, é possível que o VEGF foi segregada e antes do início do tratamento de rapamicina, por conseguinte, o medicamento só inibiu a tradução e secreção do factor de crescimento dos recém-sintetizado em células em cultura. Além disso, a rapamicina pode afectar a via de secreção de VEGF celular em um mecanismo distinto em comparação com a regulação de translação do mRNA de VEGF. Mais provavelmente, era a diferença pronunciada entre a cultura de células em que o fornecimento de nutrientes é uniforme, apesar de privação de soro, contra o microambiente do tumor em ratos intactos potencialmente possuindo descasamentos de perfusão ou shunt arteriovenosa.

(A) RAD001 revogada ribossômica mediada por mTORC1 proteína quinase S6 fosforilação em lisados ​​de tumor sem afectar mediada por mTORC1 4E-BP1 fosforilação. conteúdo VEGF tumoral foi reduzido em 60% e acompanhada por uma diminuição semelhante proporcional em VEGFR2 fosforilação. Os dados foram normalizados para imunotransferência da proteína total não fosforilada para cada destino e a p-tubulina. Cada pista é ligado de um tumor em um mouse. (B) Análise por ELISA de meio condicionado a partir de células tratadas com RAD001 786-O em cultura, n = quatro culturas independentes por grupo de tratamento, demonstrou uma queda de 20% no nível de proteína de VEGF segregada. Os dados de ELISA foram normalizados para o total de ADN celular para corrigir diminui mediada por RAD001 em proteína celular total. * P . 0,0001

64Cu-Nota-bevacizumab Biodistibution Alterações em resposta a RAD001

Em seguida, investigamos se imagiologia PET

64Cu-NOTE-bevacizumab poderia detectar diminuições tumoral conteúdo VEGF mediada por RAD001 em um modelo do rato da RCC. Os estudos de biodistribuição foram realizados a 7, em vez de 14 dias de administração RAD001 para testar se a absorção de VEGF foi dissociada da alteração significativa de crescimento de tumor (Figura 4A). RAD001 diminuiu significativamente a absorção tumoral

64Cu-NOTE-bevacizumab duas vezes, os tumores tratados com veículo, 30,3 ± 8,3%, 13,8 ± 2,6 RAD001% ID /g, respectivamente,

P

0,001. estudos de imagem MicroPET /CT executadas em uma coorte paralelo de ratinhos com tumor (Figura 4B e C) revelou uma diminuição de três vezes de tumoral de intensidade de sinal

64Cu-NOTE-bevacizumab, SUV 4.0, ratos tratados com o veículo, em comparação, SUV 12.2 . O crescimento do tumor de análise da resposta em outra coorte paralelo de RAD001 e ratinhos tratados com veículo (ver Materiais e Métodos) mostrou que RAD001 impediu expansão tamanho do tumor durante os 14 dias de tratamento, tal como determinado por análise de regressão linear em que o declive do aumento de crescimento do grupo de veículo foi de 14,98 (p = 0,0001), enquanto que a inclinação do grupo tratado RAD001 foi 0,20 (p = 0,92). Two-way análise de variância revelou também uma diferença significativa em tamanhos dos tumores de acordo com os dias de medição e veículo versus tratamento de drogas. Infelizmente, diferencial, RAD001 volume do tumor diminuição tinha já atingiu significância estatística pelo dia 7, como determinado por ANOVA de uma via, p = 0,003 para o dia 0 o dia 7 ou intervalo de tempo único análise de ponto de dia 7 tamanho do tumor entre o veículo ea grupos RAD001, Mann-Whitney U-test, p = 0,013, impedindo a determinação do valor preditivo da imagiologia de VEGF-PET, neste ponto do tempo (Figura 5).

(a) Biodistribuição de

64Cu- NOTE-bevacizumab em ratos (n = 4 ratinhos por grupo) portadores de tumores O-786 de carcinoma de células renais após o tratamento com RAD001 ou veículo. (B) ratinhos portadores 786-O carcinoma de células renais tumores de orelha foram verificados no início do estudo seguinte i.v. injecção de 100 ^ Ci

64Cu-NOTE-bevacizumab (n = 4). RAD001 foi então administrada por 7 dias e os exames repetidos. Não foi uma marcada diminuição no sinal

64Cu-NOTE-bevacizumab na RAD001 em comparação com o controle do veículo rato tratado. (C) A diminuição do valor de absorção padrão (SUV) na RAD001 em comparação com ratinhos tratados com veículo.

a determinação do crescimento do tumor orelha tridimensional revela que RAD001 (▪) essencialmente impede o crescimento de tumores de orelha (n = 9 ratinhos com 18 tumores bilaterais) em comparação com o crescimento linear nos comandos do veículo (•) (n = 7 ratinhos com 14 tumores bilaterais).

Discussão

neste estudo, nós com sucesso sintetizados e avaliados

64Cu-NOTE-bevacizumab para geração de imagens dos níveis de VEGF em xenoenxertos tumorais RCC. Este composto mostrou-se estável, especificamente acumulado em tumores, e poderia ser bloqueada pela adição de bevacizumab não marcado. Além disso, uma diminuição mediada por RAD001 na expressão de VEGF foi claramente visualizados por imagens PET usando

64Cu-NOTE-bevacizumab. captação do traçador diminuição foi concomitante com efeito estático de RAD001 no crescimento do tumor. Assim,

64Cu-NOTE-bevacizumab pode ser um novo biomarcador substituto para estabilização da doença mediada por rapalog ou mTOR quinase terapêuticas inibidoras.

resposta terapêutica tumor Tradicionalmente sólida é marcado com base na redução dimensional tumor, seja medido fisicamente , radiografia, ou por TC e RM. Os critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST) e sua versão RECIST1.1 mais recente fornece uma metodologia padronizada para comparações de eficácia em todo drogas e estudos. No entanto, o surgimento de terapias direcionadas molecularmente desafia RECIST como uma referência eficácia [35]. Quando as terapias orientadas molecularmente são eficazes, produzem principalmente doença estável (SD) ou resposta parcial (PR), com alterações mínimas no tamanho de tumor. Limitações de RECIST para a determinação da eficácia terapêutica molecular motiva desenvolvimento de CT, MRI, e algoritmos e técnicas de imagem de ultra-som adaptados em especial para vascular tumor segmentação drogas. Esses algoritmos são projetados para detectar mudanças na densidade global vascular tumoral, fator de derrame vascular mediada angiogênico, e tumor fluxo vascular [36].

Outra abordagem para avaliar a eficácia terapêutica é PET. Os tumores são caracterizados por reforço da glicose e a incorporação de timidina em resposta a desregulação do metabolismo e genética proliferação [37]. Radiotraçadores

18F-fluorodeoxyglucose (FDG) e

18F-fluorotimidina (FLT) [38] – [40], a imagem do tumor captação de glicose e síntese de DNA a detecção do tumor primário e metástases e monitoramento da resposta terapêutica. Ambos FDG e FLT PET pode revelar a eficácia terapêutica antes das alterações de volume do tumor. Estes dois marcadores de PET são desafiados pelo fato de que alguns tipos de câncer como o carcinoma de células renais (e próstata) são predominantemente FDG insensível [41], e FLT subestima a proliferação em tumores com pirimidina upregulation síntese ou de salvamento via ativada de-novo [42]. No entanto, na minoria dos CCRs FDG positivos, PET detecta a resposta do tumor mais cedo do que a redução de tamanho e prediz melhor sobrevida livre de progressão (PFS) [14]

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Apesar de limitações em cancros como o RCC, uma nova dimensão em PET tornou-se aparente nos últimos anos. “Traçadores” ImmunoPET são conjugados de anticorpo-radionuclido que se ligam a proteínas, quer ligado à superfície da célula, ou segregada para o microambiente do tumor [43]. Usando agentes quelantes bifuncionais, tais como as formas de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA) NCS (isotiocianato) ou NHS (N-hidroxissuccinimida) ou 1,4,7-triazaciclononano N, N’N “-triacético (NOTA), iões metálicos radionuclídeos pode ser complexado nos núcleos quelante enquanto que as ligações covalentes são formados com os grupos de lisina livres em anticorpos ou péptidos [44]. O poder desta abordagem é que DOTA /nota quelatado marcadores de PET podem ser conjugados com anticorpos específicos para um repertório de factores angiogénicos. Como VEGF é o principal fator angiogênico produzido pela RCC (ea maioria dos outros tipos de câncer também), este fator angiogênico tem sido explorada como um alvo de imagem. Estudos anteriores avaliaram o uso de bevacizumab radiomarcado para imagens PET de expressão VEGF. Por exemplo, o bevacizumab foi marcado radioactivamente com

89Zr [26] e

86Y [27] para imagiologia pré-clínica de modelos de xenoenxerto do ovário. Apesar da capacidade destes agentes para imagem de VEGF, a alta energia e a abundância do decaimento gama a partir destes radionuclidos são uma preocupação em relação à exposição

64Cu, que tem uma alta energia de decaimento gama muito menos abundantes. Paudyal

et al.

Avaliada

64Cu-DOTA- bevacizumab para imagens expressão VEGF pré-clínicos em xenoenxertos colorretal [28]. A captação pelo fígado foi relativamente elevada, 17,2% ID /g, em contraste com a nossa traçador

64Cu-NOTE-bevacizumab onde era 4,8% ID /g. Uma explicação para a captação hepática diferencial pode ser o mais elevado

64Cu afinidade de ligação em comparação com NOTA DOTA. Nagengast

et al

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