Abstract
descoberta de biomarcadores usando espectrometria de massa (MS) tem visto recentemente um aumento significativo dos pedidos, impulsionada principalmente pelo rápido avanço campo da metabolômica. avanços de manipulação instrumentais e de dados têm permitido para o metabolito irrelevantes análises que interrogar simultaneamente múltiplas vias bioquímicas para elucidar fenótipos da doença e os mecanismos terapêuticos. Embora a maioria das abordagens metabolômica baseados em MS são acoplados com cromatografia líquida, alguns estudos recentemente publicados usado dessorção a laser assistida por matriz (MALDI), permitindo a análise da amostra rápida e directa com a preparação da amostra mínima. Nós e outros autores relataram que a prostaglandina E
3 (PGE
3), derivado a partir de COX-2 metabolismo do omega-3 fatty ácido eicosapentaenóico (EPA), inibiu a proliferação de pulmão humano, do cólon e cancro do pâncreas células. No entanto, como a PGE
3 metabolismo é regulada em células cancerosas, particularmente células humanas do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), não é completamente compreendido. Aqui, nós usamos com sucesso MALDI para identificar diferenças no metabolismo lipídico entre duas linhas de cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) celulares, A549 e H596, o que poderia contribuir para a sua resposta diferencial ao tratamento EPA. A análise por MALDI-MS mostrou que o nível de EPA incorporados em fosfolipidos em células H596 foi 4 vezes mais elevada do que as células A549. Curiosamente, H596 células produziram muito menos PGE
3 do que as células A549, embora a expressão de COX-2 foi similar entre as duas linhas celulares. Isto parece ser devido à expressão relativamente mais baixa de fosfolipase citosólica A
2 (CPLA
2) em células H596 do que a de células A549. Além disso, a abordagem MALDI-MS foi usado com sucesso em extractos de tecido tumoral de um modelo de rato transgénico K-ras de câncer de pulmão para melhorar a nossa compreensão do mecanismo de ação da EPA no
in vivo
modelo. Esses resultados destacam a utilidade de combinar um fluxo de trabalho metabolômica com MALDI-MS para identificar os biomarcadores que podem regular o metabolismo de ácidos graxos ômega-3 e, finalmente, afetar seus potenciais terapêuticos
Citation:. Pirman DA, Efuet E, Ding XP, Pan Y, Tan L, Fischer SM, et al. (2013) alterações no metabolismo celular Cancer revelada pela análise da amostra direto com MALDI Espectrometria de Massa. PLoS ONE 8 (4): e61379. doi: 10.1371 /journal.pone.0061379
editor: Julio Francisco Turrens, University of South Alabama, Estados Unidos da América
Recebido: 20 de novembro de 2012; Aceito: 08 de março de 2013; Publicação: 26 de abril de 2013
Direitos de autor: © 2013 Pirman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health subvenção CA144053-01A1. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Embora muito esforço tem sido dedicado ao perfil genômico que conduz à identificação de certos componentes de genes de cancro, informações sobre metaboloma e lipidomics em células cancerosas ou tecidos é limitada. Mesmo que metabolômica e lipidomics representam desafios tecnológicos em termos de capacidade de instrumento, reprodutibilidade e manipulação de dados, estes campos de estudo mostram uma grande promessa no fornecimento de uma visão global do metabolismo de uma célula cancerosa, levando a terapias novas e potencialmente personalizados.
Os recentes avanços em dessorção a laser assistida por matriz /ionização (MALDI) espectrometria de massa (MS), [1] – [7] aumentaram a utilidade de MALDI em uma ampla gama de novas aplicações. Os avanços na instrumentação disponível comercialmente, incluindo MALDI acoplado ao ion trap linear instrumento Orbitrap ou quadripolares-tempo-de-voo espectrómetros (QTOF) de massa permitiram a geração bem sucedida de espectros de massa nas gamas de massa inferiores ( 1000 Daltons), permitindo, assim, MALDI-MS de perfis de metabolitos, incluindo lipidos, tipicamente não comuns com instrumentação MALDI devido a efeitos de matriz e fragmentação fonte [7] – [9]. Estes avanços em MS e instrumentação ionização mudaram MALDI-MS em várias áreas de pesquisa novas, incluindo lipidomics [7], [10] – [12], o peptídeo [2], a droga [13] – [16], e do metabolito [17 ] analisa directamente a partir de amostras biológicas, incluindo tecidos.
MALDI-MS foi recentemente utilizado com sucesso para analisar directamente amostras biológicas combinadas com a manipulação de dados estatísticos. Estas abordagens podem ser utilizadas para diferenciar tipos de tecidos ou identificar as vias de metabolismo regulados diferencialmente. Por exemplo, as sondas intra-cirúrgica a ser desenvolvido pela Balgo,
et al., Em que o tecido é amostrado durante a ressecção cirúrgica, analisado através de EM, podem então ser categorizados com software estatístico [18]. Esta abordagem permitiu a discriminação rápida, isenta de tecido doente e saudável e poderia potencialmente ser usadas para substituir classificação histológica tradicional durante a ressecção cirúrgica de um tumor. Recentemente, MALDI-MS, também foi utilizado para classificar os tipos de tumores, bem como de origem do tumor, embora não intrasurgically [5], [19] – [21]. Estes estudos recentemente publicados destacar a ampliação do uso de MALDI-MS para análise tecidual direto para caracterizar tecidos com base em seus perfis metabólito, lipídios, peptídeos e proteínas.
No presente estudo, foi utilizado MALDI acoplado a um espectrómetro de massa de QTOF para a rápida interrogação de duas linhas celulares de NSCLC para revelar diferenças no metabolismo celular do ácido óleo de peixe derivado de, ácido gordo poli-insaturado (PUFA) eicosapentaenóico (EPA). Nós também adaptado a técnica para analisar directamente e caracterizar o metabolismo lipídico tecido de EPA a partir de tumores de ratinho transgénico pulmonares K-ras-tratados EPA tanto por cromatografia líquida acoplada com espectrometria de Massa Tandem (LC-MS /MS) e MALDI-MS para verificar o
in vitro
dados MALDI usando uma abordagem complementar.
Numerosos estudos pré-clínicos têm apoiado a noção de que os ómega-3 os ácidos gordos peixe-derivados de petróleo EPA e ácido docosahexaenóico (DHA) tem a capacidade de prevenir a proliferação de células de cancro, migração e invasão em vários tipos de tumores, incluindo NSCLC [22]. Nós e outros investigadores relataram que a eficácia de EPA pode ser mediada através do seu ciclo-oxigenase (COX) metabolito da prostaglandina E
3 (PGE
3) no pulmão humano, cólon e células de cancro pancreático [23] – [25 ]. Em contraste com o DHA, EPA também pode actuar como um substrato da COX, particularmente COX-2, conduzindo a um aumento do PGE
3, em oposição ao ácido araquidónico (AA), que dá origem à pró-inflamatória metabolito da prostaglandina E
2 (PGE
2) (fig. 1) [22]. Os níveis elevados de actividade de COX-2 e, portanto, PGE
2, são conhecidos por estarem associados com a proliferação celular aumentada e o potencial metastático nos tumores [26] – [28]. EPA foi previamente demonstrado ser eficaz na redução da proliferação de células A549, aumentando a produção de PGE
3 e, assim, aumentar a PGE
3 /PGE
2 rácio [22]. No entanto, como outros fatores associados com a síntese de prostaglandina afetar o efeito anti-câncer da EPA em células NSCLC não foi totalmente avaliada.
Aqui, utilizando MALDI-MS em duas linhas de células NSCLC que expressam níveis semelhantes de COX-2, que identificam diferenças com sucesso no metabolismo celular de EPA. Com esta técnica, fomos capazes de directa e rapidamente (tempo de análise 30 segundos) interrogar o metabolismo diferencial, particularmente o metabolismo lipídico, em cada linha de células de uma forma reprodutível. Diferentes metabolismo lipídico EPA derivado foi também observada em tecidos de tumor de pulmão derivados de
K-ras mutante
rato. Estudos anteriores demonstraram perfis de proteínas bem sucedida de subtipos de cancro do pulmão humano utilizando MALDI-MS [29], mas aqui que mostrou o potencial de MALDI não só para discriminar subtipos de cancro pelos seus perfis de lípidos distintos, mas também para acompanhar a eficácia biológica de tratamento através da identificação biomarcadores de adequados. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório para analisar diretamente as células cancerosas por MALDI-MS, revelando diferenças no metabolismo celular, o que pode ser crítico para EPA-suscitou actividades anticancerígenos em células NSCLC.
Métodos
as linhas celulares
o cancro do pulmão de células não pequenas humano A549 e células H596 (NSCLC) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e mantidas numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO
2 a 37 ° C. As células A549 e H596 foram rotineiramente cultivadas em meio DMEM /F12 (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 5% e 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (Hyclone Laboratories, Logan, UT, EUA), respectivamente, e penicilina -Streptomycin 100 × solução e 2 mM de L-glutamina a partir de GIBCO (Invitrogen).
imunotransferência
Para Western blot, as células a 70% de confluência foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) , tratadas com tripsina e os sedimentos celulares foram recolhidos. O sedimento foi lavado duas vezes com PBS frio e o sedimento resultante foi ressuspenso em tampão de lise (Invitrogen), sonicada imediatamente ou armazenados a -80 ° C. Os lisados celulares foram sonicadas em gelo durante 3 minutos (Sonicator Misonix 3000, Farmingdale, NY, EUA), e centrifugado a 14000 rpm durante 15 min a 4 ° C. Os níveis de proteína foram quantificados através do ensaio de proteína da BioRad DC (BioRad, Inc., Hercules, CA). Iguais níveis de proteína (50 ug) foram resolvidas em 7% (CPLA
2) e 10% de geles (COX-2) de SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno, de acordo com métodos padrão. Seguindo uma incubação de 2 h em 5% de leite em pó magro tampão preparado em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 0,1% (TBST) de bloqueio, as membranas foram sondadas com CPLA
2 anticorpo primário (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) ou o inibidor de COX-2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA) em 1:1000 diluição durante 2 horas, lavados em TBST, incubados em anticorpos secundários durante 1 h, seguido de 3 × 10 min cada em TBST lavar. As bandas proteicas foram visualizadas através de quimioluminescência usando o kit ECL + detecção e Hyper-Film (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA). A igualdade de carga das amostras foi ilustrado por transferência de Western para detectar a presença de β-actina.
CPLA
2 Ensaio de Actividade
A actividade de CPLA
2 foi determinada utilizando um CPLA
2 kit de ensaio (Cayman Chemical Company). Resumidamente, A549 e H596 (5 × 10
6) As células foram semeadas em pratos de 100 mm e deixou-se crescer durante a noite para atingir ~ 70% de confluência. As células foram lavadas duas vezes com tampão A frio (50 mM de Hepes, pH 7,4; EDTA 1 mM), raspadas com um levantador de célula (Corning Incorporated, Corning, NY, EUA) e transferido para um tubo eppendorf em gelo. Após sonicação durante 3 minutos, os lisados foram centrifugados a 14000 rpm durante 15 min a 4 ° C. O sobrenadante foi removido e a concentração de proteínas foi determinada pelo ensaio de proteína da BioRad DC. Para o ensaio de actividade, foi utilizado o volume equivalente de 1 ug de proteína. A absorvância foi lida a 414 nm num leitor de placas Spectra Max M5 (Molecular Devices Corp., Sunnyville, CA, EUA). O CPLA
2 a actividade foi expressa em pmol /min /mL, como determinado pela fórmula fornecida no protocolo do fabricante.
K-ras de rato transgénico
Todas as experiências com animais foram aprovados pela Institutional animal Care e do Comitê Use na Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center. Para avaliar o metabolismo lipídico de EPA em tecidos do pulmão de rato, de cinco semanas de idade,
K-rasLA
C57BL6 /129 /SV F1 ratinhos mutantes foram utilizados como um modelo de tumor de pulmão espontâneas e alimentados com uma dieta contendo óleo de soja ou EPA (1% e 2%) durante 9 semanas. No final da nona semana, os ratinhos foram sacrificados, os tecidos do pulmão foram removidos, em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à sua análise por MALDI-MS congelado-flash.
Análise por MALDI- MS
células (1 × 10
6) foram plaqueadas em placas de 6 poços e cultivadas durante a noite. As células foram então tratadas com EPA (25, 50, ou 100 uM), em meio isento de soro contendo 1% de BSA durante 24 horas. No final do período de incubação, as células intactas foram recolhidas por tripsinização, centrifugou-se a 3000 rpm durante 2 min a 4 ° C, lavadas em PBS, e o sedimento celular foi ressuspenso em 20 ul de PBS. As células foram ou armazenadas a -80 ° C ou imediatamente processados para análise de MALDI-MS.
Para a análise de MALDI-MS de células, os sedimentos celulares foram descongelados e 1 mL da suspensão foi manchado para uma polilisina-revestido lâmina de vidro (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA), utilizado como um alvo MALDI. Por MALDI-MS análises de amostras de tecidos, de 10-30 mg de tecido foi homogeneizada em 500 uL de PBS utilizando um homogeneizador de tecidos Precellys (Bertin Technologies, Paris, França). Uma alíquota de 1 mL do homogenato foi manchada sobre uma lâmina de vidro revestido por polilisina. As suspensões de células e homogeneizado de tecido foram secos num exsicador de vácuo à temperatura ambiente durante 10 min. ácido di-hidroxibenzóico (DHB) (20 mg /ml) em clorofórmio /etanol (09:01;
v /v
) foi aplicado às amostras por revestimento por pulverização por meio de um nebulizador Meinhard (Meinhard, Golden, CO, EUA). A mistura de clorofórmio /etanol permitiu a formação de cristais rápida sobre as células, evitando pooling do solvente matriz. Os espectros de massa foram obtidos num espectrómetro de massa Waters SYNAPT G1 QTOF (Milford, MA, EUA). Para a identificação de lípidos, os dados de massa precisas e MALDI-MS /MS foram obtidos num espectrómetro de massa de MALDI Thermo Scientific LTQ Orbitrap (San José, CA, EUA).
LC-MS /MS
as prostaglandinas e
2 e e
3 (PGE
2 e PGE
3), foram extraídos de acordo com o método previamente publicado de Yang
et ai. [30], [31]. Resumidamente, uma aliquota do tampão 0,5 ml de PBS foi adicionado aos tecidos ou peletes de células congelados, seguido por homogeneização em tubos de 1,5 mL com esferas de cerâmica usando o homogeneizador de tecidos Precellys (Bertin Technologies) e alíquotas de 400 ul foram usados para extracção de prostaglandina. Todos os procedimentos de extração foram realizados sob luz mínima. As amostras foram então reconstituído em 100 ul de metanol /ácido acético a 0,1% (50:50,
v /v
) antes da análise por LC-MS /MS [31].
O extracelular níveis de PGE
2 e PGE
3 em células A549 e H596 foram extraídos de acordo com Yang
et al [22]. PGE
2 e PGE
3 foram quantificadas por LC-MS /MS usando um Agilent 6460 triplo quadrupolo (qqq) espectrómetro de massa (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA) equipado com um 1200 HPLC bomba binária Agilent HP entrada (Agilent). PGE
2 e PGE
3 foram separadas usando um 2 × 100 milímetros Kinetex 3 μ C18 analítica (Phenomenex, Torrance, CA, EUA). A fase móvel consistiu em ácido fórmico a 0,1% e acetonitrilo com ácido fórmico a 0,1%. A temperatura da coluna foi mantida a 40 ° C, e as amostras foram mantidas a 4 ° C durante a análise. analitos individuais foram detectadas utilizando ionização por electrospray e monitoramento de reação múltipla, ea seguinte
m /z
transições foram monitorados no modo de ionização negativa com:
m /z
351 → 271 para PGE
2,
m /z
349 → 269 para PGE
3 e
m /z
355 → 275 para PGE
2-d
4. Os níveis de PGE
2 e PGE
3 foram quantificados usando curvas padrão autênticos e normalizada para tanto o número de células (intracelular ou extracelular) ou a quantidade de proteína foi determinada por um ensaio de Bradford (Bio-Rad).
a análise estatística
Cada repetição biológica foi visto duas vezes e analisados duas vezes por MALDI-MS e os experimentos foram repetidos três vezes. espectros exportado de cada grupo foram enviados para o software online Metaboanalyst (Metaboanalysis 2.0, disponível:. https://www.metaboanalyst.ca/acessado pode 2012), [33] [32]. Este software on-line oferece uma variedade de ferramentas estatísticas para reduzir o espectro complexo e identificar de forma significativa mudança
m /z
valores. Análise de Componentes Principais (PCA), análise parcial de mínimos quadrados discriminar, t-testes e análise de variância foram utilizados para analisar os dados de MS resultantes tanto para identificar evoluções picos e para determinar se os tipos de células ou tecidos podem ser discriminados entre si . Significativamente diferentes características foram então comparados com os de tanto o Metaboloma Databank Humano (HMDB; disponível: https://www.hmdb.ca Acessado Maio de 2012.) Eo METLIN (Disponível: https://metlin.scripps.edu/. acessada Mai 2012) de banco de dados para a caracterização do composto.
resultados
metabolismo EPA foi regulados diferencialmente em NSCLC A549 e as células H596
Como já relatado anteriormente, o efeito anti-proliferativo das EPA em células NSCLC humanas eram mediados através da sua expressão de COX-2 e a formação do metabolito anti-proliferativa, a PGE
3 [22]. No entanto, quando tratados duas NSCLC A549 e H596 células com EPA, EPA inibiu a proliferação de células A549 (IC
50 6,25 ^ M) de forma mais eficaz do que o fez as células H596 (IC
50 50? M) ( A Fig. 2A), embora estas duas linhas de células mostraram semelhante expressão de COX-2 (Fig. 2B). Para delinear os mecanismos que medeiam os efeitos diferenciais observado com o tratamento com EPA, avaliou-se os diferentes perfis de espectro de massa destas linhas celulares, utilizando MALDI-MS, seguido por análise de APC (Fig. 3). Inicialmente esta análise foi usado simplesmente para determinar se o recolhidos espectros de MS pode, efectivamente, ser utilizada para discriminar entre tipo de célula e tratado versus amostras não tratadas. Significativamente mudando picos identificados por valores de p 0,05 foram investigados e identificação tentativa incluindo os lípidos PC mais discutidos. O MALDI-MS espectros de células A549 e H596 não tratados apresentaram metabólicas /assinaturas lipidomas muito semelhantes (Fig. S1A e S1B) além de algumas pequenas variações na intensidade do sinal e, portanto, não diferenciadas por análise PCA, células A549 e H596 tratadas com EPA diferiam substancialmente na sua metabólica /perfis lipidomas (Fig. 4). Após o tratamento EPA, o padrão de metabolito nas duas linhas de células foram diferenciados por observação facilmente novos e supra-regulados picos, sugerindo que o metabolismo celular de EPA nestas duas linhas de células são regulados diferencialmente (Fig. S1C e S1D).
(A). O efeito anti-proliferativo de EPA em células não-pequenas humano A549 do cancro do pulmão e células H596 (B). A exposição de células A549 à EPA durante 72 horas produziu uma dez vezes mais forte inibição da proliferação celular em células A549 do que em células H596.
As células foram não tratadas (A) e tratou-se com 50 uM EPA ( B). As células A549 e H596 não tratados apresentaram espectros de massa semelhante (A). No entanto, o tratamento de pós-EPA levou a um padrão metabólico claramente diferenciados entre estas duas linhas celulares (B). Os dados são representativos de duas réplicas biológicas com análises repetidas. Uma média de 25 espectros de massa foram recolhidos e calculados a partir de cada local de célula. A quantidade de tempo para cada análise era inferior a um minuto. Os dados foram representados a partir de três experiências replicadas.
Um aumento significativo é observado para
m /z 802,5
, o que corresponde a um PC (36:5) de ácido gordo. MS /MS confirmou que o PC (16:00 /20:05) era um componente do
m /z
valor observado (resultados não apresentados). Espectros mostrado em (C) e (D), que corresponde às células A549 de linha não tratada e tratada EPA; respectivamente, também apresentam um aumento na
m /z 802,5
após o tratamento com EPA. No entanto, este aumento é significativamente menor do que o aumento observado para a linha celular H596.
Maior nível de EPA incorporação fosfatidilcolina (PC) em H596 do que em células A549
A inspecção dos espectros recolhidos oferece uma visão sobre o metabolismo EPA regulados diferencialmente nestas duas linhas de células específicas, mostrado na Fig. 4. Os picos apresentados nesta figura representam espécies de lipídios com os dois diferentes comprimentos de cadeia acilo e graus de insaturação. Por exemplo,
m /z
804,5 representa o PC sodiated contendo dois acil-correntes totalizam 36 carbonos com 4 duplas ligações (36:4). A partir dos resultados anteriormente publicados, um pressuposto razoável que pode ser feito de uma cadeia acilo contém 16 átomos de carbono com zero ligações duplas e que a outra cadeia contém 20 carbonos e quatro ligações duplas (uma porção AA) [7]. Mais vulgarmente, o radical insaturado ocupa a posição SN2 no backbone fosfoglicerol; No entanto, como a degradação de lípidos e de regeneração é continuamente em fluxo, as estruturas são continuamente mudar, tornando determinações estruturais lipídicas absolutos difícil, em qualquer momento dado. FIG. 4B mostra também um aumento de cinco vezes em
m /z
802,5, [M + Na]
+ de PC em células H596 após tratamento com EPA comparada com a de células tratadas com veículo sozinho. Outras análises MALDI-MS /MS identificou esta massa de facto, constituído por um PC provavelmente derivado de EPA como PC (36:5) (Fig. S2). O aumento observado de PC (36:5) está atribuído à incorporação dos ácidos gordos EPA no PC, possivelmente, na posição SN2. Em comparação, o metabolito semelhante a partir de células A549 (Fig. 4C e 4D) mostra apenas um aumento marginal na
m /z 802,5
. Portanto, estas diferenças no metabolismo celular pode ser especificamente correlacionada com células H596 após tratamento EPA. A comparação dos espectros de células não tratadas do PC (36:4 intensidades) em ambas as linhas celulares resultou em valores semelhantes, indicando estas duas linhas de células têm a capacidade semelhante para formar tais espécies PC. Este resultado sugere que as células A549 e H596 diferem minimamente na biossíntese de PC, mas poderia ter diferentes habilidades para regular a utilização de EPA a partir do PC.
Para gerar estimativas comparáveis entre as duas linhas de células e para abranger qualquer MALDI variações de intensidade de sinal, cada PC ácidos graxos (
m /z
802 e 804) foi normalizada para a intensidade do sinal do grupo de cabeça PC (
m /z
184), que se forma principalmente via fragmentação fonte. Assumindo que o conteúdo total de PC entre as duas linhas celulares é semelhante, este ião serve como um ião de normalização adequada, uma vez que pode ser usada para representar as espécies PC inteiro. Esta abordagem foi limitada a espécies de PC com uma cadeia acilo na posição 16:00 SN1 e a substituição de PUFA na posição SN2 para simplicidade de comparação. Cálculos semelhantes podem ser feitos com o aumento do comprimento da cadeia acilo SN1. A partir dos cálculos, um aumento significativo no PC (36:5) e PC (36:4) é observada em células H596 após tratamento com EPA (Tabela 1). O aumento em PC (36:5) pode ser atribuída à formação de espécies de PC com uma porção EPA adicionado na posição SN2 dos grupos PC. O aumento no PC (36:4) é indicativo da mudança da AA entrar na via da COX-2 em direcção ao da EPA. Um aumento em ambas as espécies de PC também é observada na linha celular A549; no entanto, este efeito não é tão profunda como a observada na linha de células H596.
H596 níveis mais baixos gerados de PGE
3 do que células A549
Uma vez que o MALDI- dados de MS sugerem que a EPA foi observado, principalmente, numa forma de fosfolípido em H596 células mas não em células A549 e ambas estas células têm capacidades de biossíntese de fosfolípidos semelhantes, a nossa hipótese corrente é que pode haver diferenças nas quer a expressão ou actividade de fosfolipase a
2 (CPLA
2), uma enzima que liberta ácidos gordos a partir da posição de SN2 o esqueleto de glicerol. Esta alteração pode levar às diferentes capacidades de H596 e células A549 para formar PGE
3, dependendo da disponibilidade de substrato, limitando, assim, os efeitos anti-proliferativos de EPA nas células H596.
primeira comparou o intracelular e os níveis extracelulares da PGE
3 em H596 e células A549 tratadas com EPA (50 uM). Como mostrado na Fig. 5, o nível intracelular de PGE
3 foi quase duas a quatro vezes superior, nos pontos do tempo até 20 horas em células A549 do que nas células H596, enquanto que uma maior quantidade de PGE extracelular
3 estava observada em células A549 do que em células H596 após 4 horas de tratamento. Para testar ainda mais a nossa hipótese, determinou-se o nível de proteína de CPLA
2, bem como a sua actividade nestas células. Como mostrado na Fig 6., a expressão da proteína de CPLA
2 era notavelmente maior em células A549 do que a de células H596 (Fig. 6A). Do mesmo modo, a actividade de CPLA
2 foi 4 vezes superior em células A549 do que a de células H596 (Fig. 6B). Em conjunto, estes dados sugerem que a libertação de EPA em H596 células de PC EPA-incorporada era muito menor do que em células A549 devido à expressão e actividade de CPLA limitado
2 em H596 células, que suportam a hipótese de que o metabolismo de EPA é diferencialmente regulada , como sugerido por análise de MALDI-MS.
(a) células foram tratadas com EPA para diferentes tempos como indicado, e células intactas foram recolhidos por tripsinização e submetido a análise por LC-MS /MS. Níveis intracelulares de PGE
3 em células A549 foram, pelo menos, duas vezes maior do que aqueles nas células H596. (B) meios de cultura celular foram colhidos em momentos diferentes, tal como indicado e sujeitas a extracção em fase sólida. os níveis extracelulares da PGE
3 foram depois analisados por LC-MS /MS. Os dados são representativos de duas experiências separadas
(A) A expressão da proteína de cPLA2 em A549 e células H596 foi determinada por Western blotting.; (B) Actividade de cPLA2 em células A549 e H596 foi medido como anteriormente descrito. Tanto o nível de proteína e a actividade da cPLA2 foi significativamente menor em células H596 em comparação com a das células A549.
EPA metabolismo lipídico alterado em K-RAS tecidos de tumor de pulmão de rato
Para determinar se MALDI-MS poderia ser usado para observar as alterações no metabolismo do tecido
in vivo
, após o consumo da dieta de EPA, as experiências foram também realizadas em extractos de tecido de pulmão de genéticos K-ras ratinhos mutantes. Os espectros de massa recolhidas directamente a partir de tecido de pulmão variando de
m /z
800-840 são mostrados na Fig. 7. A partir da análise de tecido directo com MALDI, o efeito de cada dieta pode ser observado a partir dos perfis lipídicos do tumor. Após a alimentação EPA (Fig. 7A), a espécie de PC correspondentes com a EPA (
m /z 802 e 830
) acil-grupo foi regulada positivamente em comparação com o que, no grupo de dieta de soja. Curiosamente, a proporção de PGE
3 ao longo de PGE
2 foi significativamente aumentado a partir de 0,011 ± 0,004 de tecidos a partir de ratos de soja alimentado para 0,063 ± 0,03 (1% de EPA) e 0,42 ± 0,11 (2% de EPA) de pulmão tecidos derivadas de ratinhos alimentados com EPA (Fig. 7B). A observação de EPA incorporação nas espécies PC bem correlacionados com a proporção de PGE
3 /PGE
2 detectada a partir das mesmas amostras de tecido por LC-MS /MS, o que sugere que a EPA levou a mudança do tumor no metabolismo de produzindo o metabolito proliferativa PGE
2 ao metabolito anti-proliferativa PGE
3 através da via da COX-2.
a). espectros de massa MALDI coletados diretamente a partir de lisados de tecido tumoral de K-ras tumores pulmonares mutantes, quer não tratados ou tratados com EPA. mudanças observadas no catabolismo de lipídios de AA a EPA está encaixotado, mostrando alterações significativas no metabolismo do tumor. B). Proporção de PGE
3 /PGE
2 extraiu-se a partir de tecido de tumor derivado do modelo de ratinho transgénico K-ras. PGE
2 e PGE
3 foram quantificadas por LC-MS /MS. Estes dados representam mudança de metabolismo do tumor de produzir AA derivados PGE
2 a PGE
3 da EPA provocando assim um efeito anti-proliferativo.
Discussão
A inicial objectivo deste estudo foi determinar se a resposta diferencial de linhas celulares de NSCLC para tratamento de EPA pode ser medido por análise directa com MALDI-MS. Embora as ferramentas estatísticas empregue não podiam discriminar directamente entre as duas linhas de células antes do tratamento, que poderia diferenciar com sucesso as linhas de células com base nos seus perfis de espectro de massa, após o tratamento EPA. Estes dados levaram a um aumento da compreensão do mecanismo biológico responsável pela relativamente mais baixa sensibilidade das células H596 ‘EPA ao tratamento do que a de células A549, mesmo que a expressão da proteína COX-2 foi semelhante em ambas as linhas celulares. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório para analisar diretamente as células cancerosas por MALDI-MS, revelando diferenças no metabolismo celular, que poderia ser um índice para atividades anticancerígenas EPA-induzidos em células NSCLC. Esta simples abordagem MALDI-MS permitiu a interrogação do lipídico vias que operam em linhas celulares de NSCLC sinalização.
Enquanto estiver usando MALDI-MS sem separação analítica tem inúmeras desvantagens, incluindo a supressão de íons, íons interferentes da matriz MALDI, e da incapacidade para separar espécies endógenas isobáricos, a técnica ainda tem um grande potencial na sua capacidade para medições diretas de amostras biológicas. Isto foi exemplificado pelo crescimento recente em aplicações de imagiologia MS MALDI [34]. Mais avanços na análise biológica direta por meio de técnicas de MS, tais como técnicas de ionização free-matriz ou técnicas de dessorção atmosféricas, permitirá uma amplitude maior de cobertura metabolômica e lipidomas.
Estas técnicas podem ser especialmente útil quando se combina quantitativa clássica abordagens metabolômica alvo. Tal como aqui relatado, utilizando MALDI-MS para investigar diferenças no metabolismo lipídico, após o tratamento de células com EPA levou a uma possível caracterização do fenótipo do NSCLC A549 e H596 células. Além disso, o desvio metabólico semelhante em H596 e células A549 foi também observada nas células a ser tratada com o ácido araquidónico, ou seja, a intensidade do pico do PC (36:4), PC incorporados-AA, foi mais elevada em células H596 do que em células A549 (dados não mostrados). Assim, estes resultados sugerem que os padrões diferenciais metabólicos gerados nas células não foram dependentes do substrato, em vez mais provável era dependente do fenótipo destas duas linhas celulares. Os resultados de MALDI-MS foram substanciadas por mais interrogação da via da COX-2 e do seu metabolito EPA PGE
3 usando quantitativa LC-MS /MS. Dado que os ácidos gordos, tais como EPA ou AA, precisam de ser lançado a partir de fosfolípidos na membrana por CPLA
2 em ordem para que possam ser utilizados por COX ou lipoxigenases, estes dados sugerem que CPLA
2 é diferencialmente regulada nestas duas células NSCLC. Com efeito, observou-se menor expressão tanto da actividade e CPLA
2 no H596 do que a de células A549. No momento, estamos avaliando se CPLA
2 é fundamental para a EPA-suscitou actividade anti-proliferativa através da sua COX-2 metabólito PGE
3 em células NSCLC.
As ferramentas estatísticas utilizadas nos guiou em discriminar entre estas linhas celulares e nos ajudou a identificar uma diferença de metabólitos entre os grupos de tratamento. APC e análise discriminante (dados não mostrados) foram utilizadas como uma ferramenta para identificar preliminar simplesmente as diferenças nos espectros de massa de células ou tecidos, com ou sem tratamento de EPA. Fomos capazes de identificar algumas características correspondentes a essas diferenças, mas a interpretação do espectro de massa direta acabou por ser utilizado.