Abstract

O câncer de próstata (PCA) é uma doença complexa que afeta desproporcionalmente afro-americanos e outras pessoas de ascendência Africano. Um certo número de regiões em todo o genoma tem sido associada a APC, a maioria deles com efeitos moderados. Alguns estudos têm relatado alterações cromossômicas em 12p e 12q que ocorrem durante o aparecimento e desenvolvimento de CaP, mas até o momento nenhuma associação consistente da doença com cromossomo 12 variação polimórfica foi identificado. A fim de desvendar os fatores de risco genéticos que fundamentam as disparidades de saúde CaP investigamos cromossoma 12 utilizando marcadores informativos ascendência (AIMS), que nos permitem distinguir regiões genômicas de origem europeia ou Oeste Africano, e testou-os para a associação com PCA. SNPs adicionais foram genotipados nas áreas onde foram detectados sinais significativos de associação. O sinal mais forte foi descoberto no SNP rs12827748, localizado a montante do

PAWR

gene, um supressor de tumor, que é amplamente expressa na próstata. O alelo mais frequente em europeus foi o alelo de risco entre os afro-americanos. Nós também analisou genes de vitamina D relacionada,

VDR

e

CYP27B1

, e encontrou uma associação significativa da APC com o polimorfismo TaqI (rs731236) na antiga. Embora nossos resultados justificam mais investigação, descobriram um fator de susceptibilidade genética para CaP em um candidato provável, por meio de uma abordagem que aproveita a contribuição diferencial dos grupos dos pais para uma população misturada

Citation:. Bonilla C, Hooker S, Mason T, Bock CH, Kittles RA (2011) Prostate Cancer Susceptibilidade Loci Identificado no cromossomo 12 em afro-americanos. PLoS ONE 6 (2): e16044. doi: 10.1371 /journal.pone.0016044

editor: Amanda Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Agosto, 2010; Aceito: 06 de dezembro de 2010; Publicação: 16 de fevereiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Bonilla et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. CB foi um destinatário de Departamento de Defesa Congressionally-Programa de Pesquisa dirigida Medical US conceder nenhuma. W81XWH-06-1-0066. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) representa um problema de saúde importante para a população masculina dos EUA. Em particular, os afro-americanos são desproporcionalmente afetados pela APC, apresentando-se com a doença mais avançada e pior prognóstico do que os americanos Europeias [1]. As razões para as diferenças incluem um número de fatores genéticos e ambientais, tais como raça, idade, história familiar, status socioeconômico e acesso aos cuidados de saúde [2].

Ao longo dos anos tem havido uma acumulação de provas em favor de um componente hereditário significativo na CaP susceptibilidade, porém a busca de genes CaP tem produzido alguns resultados consistentes. Recentemente, de ligação, de associação e de mapeamento mistura scans do genoma detectaram loci risco nos cromossomos 2p15, 3p12, 6q25, 7q21, 8q24, 10q11, 11q13, 17q12, 17q24, 19q13, 22q13 e Xp11 [3] (veja também o catálogo GWAS: https://www.genome.gov/gwastudies/), embora variantes polimórficas nessas regiões parecem representar apenas uma pequena proporção da predisposição genética observada para CaP.

para determinar se as desigualdades na saúde entre Africano -americanos e americanos europeus podem ser parcialmente explicadas pelas diferenças nos antecedentes genéticos, procurado para alelos com grandes diferenças de frequência entre essas populações que também têm uma incidência sobre a susceptibilidade a CaP.

em uma blindagem preliminar de 21 de ascendência marcadores informativos ( AIMS) no cromossomo 12 em 368 casos e controles afro-americanos CaP encontramos uma indicação de associação através de uma região estendida (a partir de 23 Mb para 64 Mb). Nós aumentamos o tamanho da amostra ea cobertura do cromossomo com objetivos e SNPs adicionais em uma tentativa de limitar a região de interesse e, se possível, identificar a variante causal. Uma atenção especial foi dada ao receptor da vitamina D (

VDR

, OMIM * 601.769) gene, localizado no cromossoma 12q13.11, já que é um candidato provável e relatórios anteriores revelaram uma associação entre polimorfismos neste gene e CaP [4].

Materiais e Métodos

assuntos

Quinhentos e cinquenta casos afro-americanos independentes e controles foram incluídos no estudo. Recrutamento para ambos os pacientes e controles saudáveis ​​teve lugar no Hospital da Universidade Howard, em Washington, DC, por meio da Divisão de programas de rastreio Urologia e câncer de próstata.

Os níveis de PSA e outras avaliações clínicas foram determinados para todos os casos APC e todos os controles . pacientes com câncer de próstata não têm mais do que um parente de primeiro grau com PCA. Todos os controles teve um exame de toque retal normal.

Doença agressividade foi definida com base no palco TNM e grau de Gleason. Baixa agressividade foi determinada por uma categoria T lt T2c e um grau de Gleason 7. Por outro lado, alta agressividade foi caracterizado por uma categoria T ≥T2c e uma nota Gleason ≥7. O estudo foi aprovado pela Howard University e da Universidade de Chicago hospitais Institutional Review Board e por todos os participantes, que forneceram consentimento informado por escrito.

O DNA genômico foi obtido a partir de amostras de sangue periférico utilizando técnicas padrão.

a genotipagem

um conjunto de 124 ascendência marcadores informativos (AIMS), localizado no cromossomo 12, a maioria dos quais foram selecionados a partir de um mapa mistura publicada sob medida para os afro-americanos [5], foram genotipados em casos e controles e utilizados para estimar ascendência local. Além disso, as proporções de mistura individuais foram estimadas usando um conjunto de 103 AIMs genome-wide escolhidos a partir do mesmo painel. Os indivíduos pertencentes a cada população parental, ou seja, HapMap Yoruba (YRI) e CEPH (CEU), também foram digitados para estes marcadores.

Além disso, nós genotipados quinze SNPs em dois genes que estão envolvidos no metabolismo da vitamina D, onze sobre o receptor de vitamina D (

VDR

) e quatro no

CYP27B1

(OMIM * 609506).

Finalmente, genótipos para um outro conjunto de 55 SNPs no cromossoma 12 foram coletadas e analisadas em uma tentativa de circunscrever as regiões associadas a genes específicos.

a plataforma Illumina BeadLab [6] foi utilizada para genotipagem todos os objectivos neste projecto.

VDR

,

CYP27B1 Comprar e todos os SNPs usados ​​para o mapeamento mais fino foram ensaiadas com a plataforma Sequenom MassARRAY [7].

Todas as posições físicas e detalhes SNP relatados no presente estudo foram baseados em NCBI genoma construir 36 e dbSNP construir 130.

a análise dos dados

O v2.2 programa ESTRUTURA [8] foi executado para estimar individual e ascendência específica para um local. Para a nossa análise o número de populações parentais foi fixado em dois. Executa consistiu basicamente de 30000 Burn-ins e 70000 iterações, e 5000 de mistura burn-ins quando necessário. Para a coleta de dados no local a local ascendência (local) foi utilizado o modelo de ligação, enquanto que um modelo que utiliza informação da população a partir de genótipos dos indivíduos parentais foi seleccionada para obter proporções ascendência individuais.

O desequilíbrio de ligação (LD) padrões ao longo cromossomo 12 foram examinados com o v4.2 programa Haploview [9]. Seleção de tagSNPs também foi feito com Haploview usando o YRI como a população de referência, a marcação de pares e ar

2 limite de 0,8.

regressão logística binária foi utilizada para estimar odds ratio (OR) e 95% de confiança intervalos (IC) para a associação de marcadores individuais e haplótipos com PCA com ajuste para idade, ascendência individual e local, através dos programas SPSS v15 e Plink 1,07 [10]. Os cálculos de energia foram realizadas com o programa Power Calculator genética [11].

Funcional

in silico

análise das variantes genéticas para identificar mudanças no fator de transcrição locais, 5’UTR e motivos 3’UTR de ligação e conservação entre as espécies foi realizada utilizando os programas incluídos na caixa de ferramentas genepi [12].

resultados

Um total de 669 indivíduos foram inscritos na análise, incluindo 253 pacientes americana CaP Africano , 297 controles afro-americanos, 59 africanos ocidentais (HapMap YRI) e 60 europeus (HapMap CEU). As características clínicas e demográficas da amostra americana Africano são apresentados na Tabela 1.

Depois de eliminar marcadores com mais de 50% genótipos desaparecidas, menos de 5% menor freqüência do alelo (MAF), fora de Hardy- Weinberg nos controles (p 0,0005), estreitamente ligada aos outros ( 0,1 cm intermarker distância)., 76 cromossomo 12 metas e 88 AIMs do genoma foram analisados ​​(Tabelas S1 e S2)

com base em o poder analisa tivemos no poder ~ 70% da média (36-83%) para detectar um risco relativo de 1,5 genótipo em um nível alfa de 0,05 para as variantes com um menor freqüência do alelo ≥5%, assumindo o marcador está em LD completo com a variante causal e uma prevalência dos APC nos afro-americanos de 2,5%. Se todas as variantes foram considerados, poder diminuiu para ~ 60% (8-83%), devido ao fato de que há um poder limitado para detectar os efeitos das variantes com frequência inferior a 5% (potência de 22% em média), consulte a Tabela S3.

Ancestrais e estrutura populacional

Usando o conjunto dos objectivos do genoma, diferença média freqüência do alelo (delta) entre populações parentais foi encontrado para ser 74%, estendendo-se de 55% para 96% ( tabela S2). ESTRUTURA corridas estabeleceu dois como o número mais provável de clusters dentro afro-americanos, independentemente do status, indicando a presença de estratificação populacional. Média de ascendência indivíduo Europeia (± sd) foi de 22 ± 17% para toda a amostra, semelhante ao relatado anteriormente estimativas para esta população [13]. casos CaP tinha em ascendência média mais elevada Oeste Africano que os controles (79% vs 77%), embora a diferença não foi significativa (Tabela 1). Os pacientes eram significativamente mais velhos do que os controlos (p 0,001, Tabela 1).

Associação com o estado da doença

Nossa análise inicial utilizando 242 casos e 126 controles constatou que três dos 21 objetivos foram significativamente associados com o estatuto de doença após ajuste para idade e ascendência indivíduo (p 0,05, Tabela 2)., enquanto outro AIM estava perto de significância (rs1963562, p = 0,07)

a fim de investigar mais profundamente estes associação sinais que expandiu o conjunto AIM cromossomo 12 com 75 polimorfismos adicionais e aumentou o tamanho da amostra para um total de 550 indivíduos. A média de diferença de frequência de alelos entre africanos ocidentais e europeus para este conjunto alargada dos objectivos foi de 70% (intervalo: 24% -95%), ea distância média entre os marcadores foi de 1,25 Mb (Tabela S1). Cobertura do cromossomo alargado de 0,2 Mb a 131,2 Mb. Muito poucos marcadores deste painel AIM estão em LD em toda a região, e aqueles que mostram

2 baixos valores de R. Isso é esperado em certa medida, foram selecionados variantes para garantir a ausência de LD nas populações parentais.

Associação com PCA foi descoberto durante dez novos marcadores em um nível alfa de 0,05, o ajuste para idade e ascendência indivíduo, embora nenhum atingiu significado se a aplicação de uma correção de Bonferroni para múltiplos testes (p 0,0007, Tabela S1). Curiosamente, para todos os loci, o alelo mais frequente entre os europeus também foi o alelo conferindo risco de CaP.

Foram selecionados 55 SNPs extras dentro das regiões associadas e genes candidatos vizinhos para tentar identificar a origem do sinal de associação . Foi dada preferência a tagSNPs tal como definido pelo programa Haploview na população YRI. Isso foi feito em duas etapas, 20 SNPs foram digitados e analisados ​​em primeiro lugar e, com base nesses e os resultados anteriores, foram adicionados mais 35 variantes, particularmente nos genes

TMTC1

,

HMGA2

(OMIM * 600.698) e

PAWR

(OMIM * 601.936), que exibiu a associação mais forte com PCA (Tabelas S1 e S4). Seis SNPs eram invariáveis ​​nesta população, enquanto três estavam fora de Hardy-Weinberg (p 0,002), portanto 46 polimorfismos foram incluídos na análise final, dos quais quatro foram significativamente associados com PCA (um em

HMGA2

e três em

PAWR

). Nós não perseguir o

HMGA2

associação qualquer outra desde rs17179670 é uma variante intrônica, é o único polimorfismo associado à doença dentro deste gene e o sinal de associação não é particularmente forte (p = 0,03).

a região do gene PAWR

na sequência de todas as rodadas de rs12827748 análise, localizados a montante do

gene PAWR

, manteve-se o SNP mais significativamente associados, mesmo após o ajuste para idade e ascendência indivíduo (p 0,01). Este SNP mostra uma grande diferença de frequência entre populações europeias e do Oeste Africano (C alélicas: 0,63 vs 0,01, respectivamente), enquanto que a frequência do mesmo alelo em casos PCA é 0,18 em comparação com 0,11 nos controles (Tabela S4). Para eliminar adicionado confusão pela ascendência incluímos estimativas ascendência locais no modelo de regressão.

ascendência local em rs12827748 foi avaliada usando o AIM rs10778691, que era o mais próximo a rs12827748 (distante ~130 kb), e revelou que a probabilidade de dois cromossomas Europeias neste locus era maior nos casos do que nos controlos, embora o resultado não foi significativo (8,3% vs 7.6%, p = 0,74). ajuste adicional para ascendência local não elimina a importância da associação entre rs12827748 e PCA (OR 1,6; 95% CI, 1,1-2,4; p = 0,02, Tabela 3).

Dois outros

PAWR

SNPs também foram significativas (rs8176908, rs8176882, p 0,05, Tabelas 3 e S4), os menores alelos estão completamente ausentes em populações europeias e têm uma frequência inferior a 10% entre os africanos ocidentais. No entanto, quando todos os três marcadores são incluídos na regressão logística, com a idade, ascendência individual e local como covariáveis, única rs12827748 exibe uma associação significativa (p = 0,03). O desequilíbrio de ligação é forte entre rs8176908 e rs8176882, mas mais fraca entre qualquer destes e rs12827748 (dados não mostrados).

haplótipos construído usando os três

PAWR

polimorfismos mostrou uma forte efeito protetor do haplótipo TGG (p = 1,7 × 10

-4), enquanto os haplótipos que incluíram todos os alelos europeus (isto é, os alelos que têm uma frequência mais elevada no europeu do que nas populações da África Ocidental, CGG) ou todos os alelos da África Ocidental (TCT) aumentou significativamente o risco da doença (Tabela 4). Apenas o haplótipo TGG permaneceu significativa após correção para testes múltiplos por meio de análise de permutação.

Foram avaliadas

in silico

o impacto que rs12827748 pode ter sobre a função do gene e não encontrou nenhuma interrupção do fator de transcrição sites ou outros efeitos regulamentares vinculativas. Este é um SNP intergênico que fica entre

PAWR

e

PPP1R12A

e pode estar em desequilíbrio de ligação com variantes funcionais em qualquer gene, embora

PAWR

como um supressor de tumor é um candidato mais provável. No entanto, os padrões de LD em populações HapMap CEU e YRI mostram que rs12827748 pode ser encontrada dentro de um grande bloco que inclui todos

PAWR

e sua região a montante com uma separação bem definida a partir do bloco que contém

PPP1R12A

Como esperado, observou-se que os portadores da rs12827748 C alelo exibido significativamente maior média de ascendência européia do que os indivíduos com o genótipo TT (0,30 vs 0,20, p 0,005)., mas não houve diferenças em ascendência entre casos e controles dentro de cada grupo genótipo. No entanto, se os indivíduos são seleccionados com base nos níveis de ascendência locais, por exemplo, por limitação da amostra para os indivíduos com uma probabilidade superior a 95% de ter dois cromossomas Europeias em rs10778691 (N = 32) ou para os portadores do genótipo rs12827748 CC (N = 21), casos mostram uma ascendência Oeste Africano globais significativamente elevada (54-66% contra 32-34% nos controles), embora ainda é baixa em relação à média da amostra não seleccionada (78%). Apesar de o tamanho das amostras a ser bastante pequeno, as diferenças são significativas (p = 0,03 e 0,01). Isto sugere que há provavelmente são fatores adicionais herdados do ancestral Oeste Africano que predispõem à CaP

A vitamina D genes relacionados:. VDR e CYP27B1

A forma ativa da vitamina D (1,25 ( OH)

2D

3) reduz a proliferação e promove a diferenciação, e tem sido implicada em cancros do cólon, da mama e da próstata. Ao mesmo tempo, tem sido relatado que os indivíduos de ascendência Oeste Africano tem aproximadamente duas vezes mais baixa os níveis de soro de vitamina D (25 (OH) D, a principal metabolito circulante) do que aqueles de ascendência predominantemente Europeia [14], o que pode implicar uma protecção menor de câncer para o primeiro. Sugeriu-se que a variação polimórfica dentro de genes na via de vitamina D, tais como

VDR

, pode contribuir para que as disparidades verificadas nas taxas de APC entre populações de diferentes origens.

Vários estudos examinaram variação no

VDR

em busca de uma associação com diferentes tipos de câncer. Há seis polimorfismos comumente estudados em

VDR

: variante Cdx2 no promotor (rs11568820), FokI no exão 2 (rs2228570), BsmI no intron 8 (1.544.410), ApaI também sobre intron 8 (rs7975232), TaqI no exão 9 (rs731236), e o poli-a de repetição mononucleótido na 3’UTR do gene. Taql é forte em LD com os outros marcadores na região (BsmI, ApaI e o poli-A microssatélites). Os polimorfismos na região reguladora a 5 ‘são conhecidas por afectarem a actividade de transcrição do gene enquanto que polimorfismos no 3’UTR têm sido associados com a estabilidade de ARNm [15]. Resultados para CaP foram inconsistentes com alguns estudos que mostram associações positivas e outros postular nenhum efeito [16] – [19]. Uma associação com PCA avançada também tem sido relatada, ie Gleason grau ≥7 [20].

Uma vez que dois dos genes na via de vitamina D, ou seja,

VDR

e

CYP27B1

, estão localizados no cromossomo 12, que examinou mais de perto, digitando alguns SNPs neles.

CYP27B1 codifica a enzima 1-α-hidroxilase que catalisa a conversão de 25 (OH) D para 1,25 (OH)

2D

3. variantes polimórficas deste gene foram examinados mas não achou a ser associada com PCA [21]. Os detalhes dos SNPs digitadas são dadas na Tabela 5. Associação com doença foi observado para duas intimamente ligada

VDR

SNPs, rs731236 (Taq) e rs7975128 (p 0,05, Tabelas 3 e 5), e os seus haplótipos ( tabela 6). No entanto, o ajuste por idade e ascendência indivíduo removeu a significância das associações. Não houve efeito da

CYP27B1

variantes sobre o risco de CaP era evidente neste estudo.

Discussão

Nós temos uma tela cromossomo 12 na busca de alelos que predispor os afro-americanos para o aparecimento e desenvolvimento de CaP e que pode parcialmente explicar as diferenças na incidência e mortalidade entre afro-americanos e americanos europeus. Depois de cuidadosamente controlar os efeitos de ascendência individual e local que identificou um polimorfismo (rs12827748) localizada a montante da

PAWR

gene que aumentou significativamente a susceptibilidade para CaP. O alelo C, que confere risco, é raro na África Ocidental, mas é a principal alelo em populações europeias. Dois adicional

PAWR

SNPs (um intrônica, um sinónimo) também foram associados com PCA na análise marcador único, mas a inclusão dos três polimorfismos no modelo de regressão eliminado todo o seu significado, exceto para rs12827748. No entanto, uma vez que as duas últimas variantes só estão presentes em populações de ascendência Africano Ocidental eles também podem representar fatores de risco CaP que por causa de suas frequências mais baixas não são detectados de forma tão independente sinais significativos. Há então a possibilidade de que esta região abriga factores de susceptibilidade de Europeu, bem como origem Oeste Africano, e em uma população misturada tais como afro-americanos de ambos poderia ser no trabalho.

Também é interessante notar que, todos os SNPs associados eram de fato baixa frequência variantes com frequências de cerca ou abaixo de 10% nos controles. Odds ratio correspondentes a essas variantes variou de 1,6 a 2,8, maior do que aqueles normalmente relatado em estudos de associação do genoma. Por causa do tamanho relativamente pequeno do nosso estudo não há energia suficiente para detectar o efeito de variantes raras (aqueles isto é, com frequências inferiores a 1%) e, portanto, não pode ignorar-los como potenciais factores causais APC. Da mesma forma, a importância de variantes com frequências abaixo de 5% pode ter sido subestimada por causa do poder inadequada.

O

PAWR

ou gene de próstata resposta a apoptose está localizado no cromossomo 12q21 e é altamente expressa no próstata. Ela promove a apoptose e causa regressão do tumor, e a sua infra-regulação é aparente durante a tumorigénese [22]. No entanto, a perda de

PAWR

não é suficiente para causar CaP no

PAWR

nulos ratos, mas faz isso quando combinada com concomitante

PTEN

heterozigosidade [23]. Nossos resultados sugerem que

PAWR

pode ser um gene de susceptibilidade CaP baixa penetrância e merece uma análise mais aprofundada em outras populações e em relação a outros fenótipos relacionados CaP. A relevância destes resultados, no entanto, só pode ser determinada pela sua replicação em estudos posteriores como não podemos ignorar o fato de que estudos com amostras pequenas correm um maior risco de relatar associações de falsos positivos [24].

o número limitado de casos e controles também afetou nossa capacidade de realizar um estudo formal de mapeamento de mistura no cromossomo 12 como não é reduzido poder de detectar um risco menor do que 2 vezes devido à ascendência [25].

Detectamos uma associação marginalmente significativa do CaP com dois SNPs no

gene VDR

, incluindo o polimorfismo TaqI. Ao contrário do que tem sido encontrada em uma recente meta-análise do alelo menor (C = t) em TaqI foi o alelo de risco em nosso estudo, embora a meta-análise de associação significativa foi identificada através da reunião Europeu, Africano e populações asiáticas [4 ]. No entanto, um olhar mais atento para os dados estratificados por etnia indica que, enquanto o alelo C parece ter efeito protetor em europeus e asiáticos que parece conferir risco em populações de ascendência Africano [4]. A maioria dos estudos que analisaram TaqI em europeus não encontrou um efeito significativo ou relatados que a maior (T) alelo aumento da susceptibilidade à CaP [26], [27]. Por outro lado, estudos de polimorfismos VDR em afro-americanos com PCA são bastante limitadas, a maioria com amostras de pequenas dimensões e, consequentemente, inconclusivos em relação ao papel de TaqI [26].

Finalmente, é importante enfatizar que a avaliação de todo o genoma cuidadoso das origens ancestrais de uma população misturada como afro-americanos representa um valioso meio de desvendar os fatores de risco genéticos que são susceptíveis de contribuir para a existência de disparidades de saúde.

Informações de Suporte

Tabela S1. : Lista de 76 ascendência marcadores informativos (AIMS) distribuídos ao longo cromossomo 12 usado para estimar ascendência local e detectar associação com o câncer de próstata

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016044.s001

(DOC)

Tabela S2.

Genome-wide ascendência marcadores informativos (AIMS) utilizados na estimativa de proporções ascendência individuais em casos de câncer de próstata afro-americanos e controles

doi: 10.1371. /journal.pone.0016044.s002

(DOC)

Tabela S3.

poder estimado para detectar efeitos do cromossomo 12 SNPs

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016044.s003

(XLSX)

Tabela S4.

Cinquenta e cinco SNPs digitados em 12 regiões previamente associados ou cromossómicas candidato

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016044.s004

(DOC)

Reconhecimentos

somos gratos a todos os participantes do estudo, e Folasade Akereyeni e Chiledum Ahaghotu por sua ajuda inestimável com o recrutamento voluntário.