Abstract

Fundo

CD166, também conhecido como molécula de adesão celular de leucócitos ativados (ALCAM) , é expressa por diversas células em vários tecidos, incluindo o cancro. No entanto, o papel de CD166 em tumores malignos é controverso, especialmente no cancro do pâncreas. Este estudo teve como objetivo esclarecer o papel eo significado da expressão CD166 no câncer de pâncreas.

Métodos

Eu executei imuno-histoquímica e citometria de fluxo para analisar a expressão de CD166 em tecidos pancreáticos cirúrgicos e linhas celulares de cancro do pâncreas . As diferenças entre isolado CD166 + e as células de câncer de pâncreas CD166- foram analisados ​​por ensaios de invasão e migração, e em modelos de xenotransplante de rato. Também foi realizada RT-PCR e microarray análises para avaliar os níveis de expressão de CD166 e genes relacionados em células em cultura.

Resultados

imuno-histoquímica revelou alta expressão de CD166 em tecidos de câncer pancreático (12,2% ; 12/98), em comparação com os controles pâncreas normal (0%; 0/17) (p = 0,0435). A citometria de fluxo indicou que CD166 foi expressa em 33,8-70,2% de células em tecidos pancreáticos cirúrgicos e 0-99,5% de linhas celulares de cancro pancreático. ensaios de invasão e migração demonstrou que CD166- células de câncer pancreático apresentaram atividades mais forte invasivas e migratórias do que aqueles das células cancerosas CD166 + (p 0,05). Por outro lado, as células CD166 + Panc-1 mostrou uma actividade de formação de colónias significativamente mais forte do que a de células CD166- Panc-1 (P 0,05).

In vivo

análise revelou que as células CD166 + provocou significativamente maior do que o crescimento do tumor de células CD166- (p 0,05) em ambos os modelos de tumor de rato e subcutâneas ortotópicos. a expressão de ARNm do activador de transição epitelial-mesenquimal Zeb1 foi sobre-expresso em células CD166- (p 0,001). microarrays análise mostrou que TSPAN8 e BST2 foram sobre-expressos em células CD166 +, enquanto BMP7 e Col6A1 foram sobre-expressos em células CD166-.

Conclusões

+ células de câncer pancreático CD166 são fortemente tumorigénico, enquanto células de câncer pancreático CD166- exibem actividades comparativamente mais forte invasivas e migratórias. Estes resultados sugerem que a expressão de CD166 está relacionada com diferentes funções nas células de câncer pancreático

Citation:. Fujiwara K, Ohuchida K, Sada M, Horioka K, Ulrich CD III, Shindo K, et al. (2014) CD166 /ALCAM Expression é característica de tumorigenicidade e invasivas e migratórias atividades das células do cancro do pâncreas. PLoS ONE 9 (9): e107247. doi: 10.1371 /journal.pone.0107247

editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 11 Abril de 2014; Aceito: 08 de agosto de 2014; Publicação: 15 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Fujiwara et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. dados de microarranjos estão disponíveis a partir Gene Expression Omnibus (GEO) no NCBI (número de acesso GSE55294)

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelas bolsas-in-Aid do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (Grant número de telefone: 23390327, 24390318, 24390319, 25670584, 25670585, 25670586, 241237) e da Fundação Fukuoka para a Saúde Som (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/) ( https://www.sukoken.or.jp/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é um dos males humanos mais letais, com uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 5% [1]. Este mau resultado é em grande parte porque o diagnóstico precoce é incomum e terapêutica convencionais, tais como a ressecção cirúrgica, quimioterapia e radioterapia têm eficácia limitada [1], [2]. Portanto, novas estratégias são urgentemente necessárias para a terapia do cancro. Recentemente, o conceito de células-tronco cancerosas (CSCs) tem recebido atenção significativa. CSCs compreendem uma população muito pequena de células cancerosas que tenham a capacidade para iniciar e sustentar a formação de tumor [3]. Consequentemente, a terapia dirigida desta população de células pequenas no cancro podem ser mais eficazes do que as terapias actuais, incluindo aqueles para o cancro pancreático.

CD166, também conhecidos como leucócitos activados molécula de adesão celular (ALCAM), é um membro da imunoglobulina superfamília [4]. É detectável em uma ampla variedade de tipos de células, incluindo células epiteliais, células linfóides, células mielóides, fibroblastos, células neuronais, hepatócitos, células da medula óssea e [5]. CD166 foi relatado como sendo um marcador para os CSCs em cancro do cólon e cancro da próstata, o que indica forte tumorigenicidade [6], [7]. Além disso, sua sobre-expressão foi reportado como um marcador de prognóstico independente para alguns tipos de cancro [8]. Por outro lado, a inibição de CD166 foi mostrada para aumentar as actividades invasiva e migratórias em células de carcinoma do ovário e glioblastoma [9], [10]. Em câncer pancreático, houve dados reportados sobre a relação entre dados de expressão e prognóstico CD166, mas ainda é controverso [11] – [13]

No presente estudo, avaliou-se o significado da expressão CD166. em câncer pancreático. Descobrimos que CD166 + células de câncer pancreático exibiu tumorigenicidade mais forte do que a de células CD166-, enquanto CD166- células cancerosas no pâncreas exibiu comparativamente mais forte invasivo e atividades migratórias. Estes resultados sugerem que a expressão de CD166 está relacionada com diferentes funções nas células de câncer pancreático.

Materiais e Métodos

Ética declaração

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Kyushu o (número de aprovação: 24-222) e conduzida de acordo com as Diretrizes éticas para Genoma Humano /Gene Research promulgada pelo governo japonês e da Declaração de Helsinki. Todos os pacientes assinaram documento de consentimento informado, que aprova o uso de seus tecidos para fins de investigação não especificados. experiências com ratos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Kyushu (número de aprovação: A-24-262-0). Os animais foram alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos.

Pacientes e tecidos pancreáticos

tecidos de câncer pancreático foram obtidos de pacientes que foram submetidos a ressecção pancreática em nossa instituição. Para imuno-histoquímica, as amostras foram coletadas de 98 pacientes com cancro pancreático, incluindo 62 homens e 36 mulheres com uma idade média de 65,2 anos (variação: 36-81 anos). As características clinicopatológicas dos pacientes são descritos no Quadro 1. A sobrevivência global foi baseada na data da operação para a data da morte ou último seguimento. Prognósticos foram determinados em setembro de 2013. O tempo médio de sobrevida global foi de 16 meses (variação: 1-135 meses). Sessenta e seis pacientes não sobreviveram para o follow-up. tecidos adjacentes para os espécimes foram avaliados histologicamente de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde. O estágio do tumor foi avaliada de acordo com a classificação da União de Controle do Câncer International. Como tecidos de controle, obtivemos 17 amostras de tecido pancreático normais de pâncreas intactas que foram ressecados para o cancro do ducto biliar, tumor neuroendócrino, ou tumor sólido-pseudopapilar benigna. Para a análise de citometria de fluxo, tecidos de câncer de pâncreas foram coletadas em cinco pacientes, incluindo três homens e duas mulheres com uma idade média de 62,0 anos (intervalo = 37-80 anos), que tinha sido ressecados em nossa instituição entre julho de 2013 e novembro de 2013.

procedimentos de imuno-histoquímica e avaliação

CD166 foi detectada utilizando um anticorpo monoclonal de rato (clone MOG /07, 1: 450; Novocastra, Newcastle upon Tyne, Reino Unido) por incubação durante a noite a 4 ° C. O sistema EnVision (Dako, Glostrup, Dinamarca) foi usado para visualizar a imunocoloração. As células foram consideradas imunocoradas positivamente quando a membrana ou citoplasma foi manchada. Tecidos sem manchar ou intensidades de coloração fraca e moderada no 70% e 30% das células, respectivamente, foram consideradas como CD166

baixa. CD166

alta foi atribuída aos tecidos com intensidades fracas e moderadas de coloração em ≥70% e ≥30% de células, respectivamente. Os cortes foram avaliados independentemente por dois investigadores sem qualquer conhecimento das características clínicas de cada caso.

Células e condições de cultura

células pancreáticas humanas foram dissociadas a partir de tecidos pancreáticos cirúrgicos usando um kit de Tumor de dissociação (humana ) e gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Imediatamente após a dissociação, as células foram analisadas por citometria de fluxo. Além disso, foram analisados ​​os seguintes nove linhas de células de cancro do pâncreas: BxPC3, CFPAC-1, SW1990, AsPC1 e Capan-2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA); Panc-1 (RIKEN, Tsukuba, Japão); MiaPaCa2, SUIT-2, e KP-2 (Ciências da Saúde Research Resources Bank, Osaka, Japão). Analisamos também duas linhas normais pancreáticas duto epiteliais de células: uma linha humana primária normais de pâncreas células epiteliais, CS-PE (DS Pharma Biomedical Co., Osaka, Japão) e uma linha celular imortalizada pancreático ductal epitelial, HPDE6-E6E7 clone 6 ( um presente do Dr. Ming-Sound Tsao, University of Toronto, Toronto, Canadá). Além disso, as células estreladas pancreáticos humanos (PSCs) foram isolados a partir de amostras de pâncreas fresco, utilizando o método de crescimento [14]. A linha de células metastático SUIT-2 foi previamente estabelecido em nosso laboratório [15]. O mesmo método foi utilizado para estabelecer a linha de células metastática Panc-1. As células foram mantidas como descrito anteriormente [16].

análise de citometria de fluxo e separação de células por imunorreactividade

As células de culturas em monocamada subconfluentes foram suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubaram-se com anticorpo monoclonal anti -humana ALCAM-ficoeritrina (PE) (R D Systems, Minneapolis, MN), anti-humano CD24 com fluoresceína isotiocianato (FITC) (eBioscience Inc, San Diego, CA), anti-humano CD44-FITC (MBL, Nagoya, Japão), e anticorpos monoclonais humanos anti-CD133-FITC (Ancell Corp., Bayport, MN). Imunoglobulina de murganho de isotipo G1 K Controlo PE (eBioscience Inc) foi usado como um controlo negativo. IgG1 de ratinho de controlo de isotipo K PE e anti-CD11b-FITC (Miltenyi Biotec) foram utilizadas para excluir células de ratinho a partir de análises. As células marcadas foram analisadas por um citómetro de fluxo (EC800; Sony Biotecnologia, Tóquio, Japão). Para a separação de células, incubámos microesferas magnéticas conjugadas com anti-PE reagente (Miltenyi Biotec) com as células marcadas durante 15 minutos a 4 ° C. As células marcadas foram isolados fazendo passar a suspensão através de um separador de PRO AutoMACS (Miltenyi Biotec). células não marcadas foram selecionados negativamente e recolhidos pelo método de exaustão através do separador AutoMACS PRO.

invasão e migração ensaios Matrigel

A capacidade de invasão das células cancerosas do pâncreas foi avaliada pelo número de células que invadiu através Matrigel (20 ug /poço; BD Biosciences, Bedford, MA) -Revestido câmaras Transwell com poros de 8 ^ m-(BD Biosciences) como descrito anteriormente [16], [17]. As células cancerosas (5 × 10

4 células /0,25 ml) foram semeadas em câmaras superior e incubados durante 24 h (células Panc-1) 48 h (células SW1990) ou 72 h (células SUIT-2). As células cancerosas que migraram para a superfície inferior das membranas foram fixadas com etanol a 70%, coradas com hematoxilina e eosina (H E), e cinco campos aleatórios a 200 × ampliação foram contadas para Panc-1 e células SW1990 ou um campo central a 100 × ampliação para células SUIT-2 sob um microscópio de luz (BZ-9000E; Keyence, Osaka, Japão). A migração de células de cancro do pâncreas foi avaliada utilizando inserções Transwell revestidas. As durações de incubação durante o ensaio de migração foi de 18 h para as células Panc-1, 40 h para as células SW1990, e 24 h para as células SUIT-2. Os resultados foram expressos como o número médio de células que migram em cinco campos aleatórios a 200 × ampliação. Cada condição experimental foi testada em triplicado, e três experiências independentes foram executadas.

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi avaliada através da medição da intensidade de fluorescência do iodeto de propidio (PI) como descrito anteriormente [18 ]. As células foram semeadas em seis poços de uma placa de 24 poços (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) a uma densidade de 1 × 10

4 células /poço. Após incubação durante os tempos indicados, PI (30 umol /L) e digitonina (600 umol /L) foram adicionados a cada poço para núcleos de etiqueta com PI. A intensidade de fluorescência de PI, o que correspondeu ao número total de células, foi medida utilizando um leitor de Infinito F200 multimodo (TECAN, Männedorf, Suíça).

Colónia ensaio de formação de

As células foram semeadas numa densidade de 1 × 10

3 células /cavidade em pratos de Nunc-cultura de células de 6 poços (Thermo Fisher Scientific KK, Yokohama, Japão) e incubados durante 10 dias. Em seguida, as células foram coradas com violeta de cristal, e o número de colónias foi contado com o Sistema XRS ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Todas as experiências foram realizadas em triplicado em pratos.

Esfera ensaio de formação de

As células foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

3 células /poço em placas de 6 poços ultra-baixas de fixação ( Corning Inc., Corning, NY, EUA) e cultivadas em DMEM isento de soro: meio de Ham F12 (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 20 ng /de factor de crescimento epidérmico humano recombinante mL (PeproTech, Rocky Hill, NJ), 10 ng /ml humano factor-2 de crescimento de fibroblasto recombinante (Pepro Tech), 1% de insulina-transferrina-selênio Solução (ITS-L), 200 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. Após 12 dias, o número de esferas que consistem em 20 células foram contadas e fotografadas sob um microscópio de luz. O experimento foi realizado duas vezes.

ensaio de adesão

O ensaio de adesão foi realizada como descrito em estudo anterior [12], com pequenas modificações. As células foram semeadas a uma densidade de 1 × 10

6 células /poço em placas de 24 poços (Becton Dickinson Labware). Após 60 min, as células foram lavadas com PBS para remover as células não-aderentes. As células adesivas foram coradas com violeta de cristal e contadas sob um microscópio de luz. Todas as condições foram testadas em quadruplicado e o experimento foi realizado duas vezes.

experimentos in vivo

ratinhos nus femininos Cinco semanas de idade foram implantados por via subcutânea ou ortotopicamente com células cancerosas suspensas em 100 mL PBS como descrito previamente [19]. diâmetros tridimensionais foram medidos para calcular o volume do tumor. Os ratinhos foram sacrificados no dia indicado e os tumores subcutâneos ou ortotópicos foram excisados ​​e pesados. Para a análise de citometria de fluxo, as células tumorais foram dissociadas utilizando o Kit de Tumor de dissociação (humano) e gentleMACS Dissociator.

silenciamento de expressão CD166 por pequenos ARN

células

Cancro interferentes em aproximadamente 90% de confluência foram transfectados com CD166-7 (SI02780169) pequeno ARN interferente (siRNA) (Qiagen, Tóquio, Japão) por electroporação utilizando o Sistema de Nucleofector (Lonza, Bazel, Suíça) de acordo com as instruções do fabricante. Para verificar a especificidade knockdown, foi utilizado um ARNsi de controlo (Qiagen). As células foram usadas em experiências subsequentes em 24-144 horas após a transfecção.

RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)

O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas usando um Kit de Isolamento de RNA High Pure (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e ADNase I (Roche Diagnostics) tratamento de acordo com as instruções do fabricante. qRT-PCR foi realizada utilizando um kit de QuantiTect SYBR Green transcrição reversa-PCR (Qiagen) e o Real-Time PCR System CFX96 (Bio-Rad Laboratories). Os iniciadores foram adquiridos a partir de Takara Bio Inc. (Tóquio, Japão). As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela 2. Cada mistura de reacção foi incubada primeiro a 50 ° C durante 30 min para a transcrição reversa para sintetizar DNA complementar da primeira cadeia por priming o ARN total com um iniciador específico do gene. A PCR foi iniciada por incubação a 95 ° C durante 15 minutos para activar a polimerase, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 20 s, e 72 ° C durante 30 s. Genes níveis de expressão foram calculados usando uma curva padrão construída com ARN total de Panc-1, SUIT-2, ou unidades específicas. Os níveis de expressão de genes foram normalizados para os da β-actina como um controlo interno e expressos como a razão da expressão do gene alvo para a expressão de p-actina. Todas as amostras foram realizadas em triplicado, e cada amostra foi analisada pelo menos duas vezes. Nenhum produto de PCR detectáveis ​​foram amplificados sem transcrição reversa antes. A precisão e integridade dos produtos de PCR foram confirmados usando um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA).

analisa Microarray

Foram realizadas análises de microarray do células CD166 + e CD166- derivados de ambas as linhas celulares Panc-1 e SW1990. A qualidade das amostras de RNA foi avaliada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer. Um Humano HT-12V4 Expressão BeadChip (Illumina, San Diego, CA) foi utilizado para as análises. Os dados foram analisados ​​usando o software BeadStudio versão 3.2.3 (Illumina).

A análise estatística

Os valores são expressos como a média ± desvio padrão. As comparações entre os dois grupos foram feitas usando o teste t de Student. A significância estatística foi definida como P 0,05. O teste χ2 foi utilizado para analisar a correlação entre a expressão de CD166 e as características clínico-patológicas observadas no estudo imuno-histoquímico. A sobrevivência foi calculada pela análise de Kaplan-Meier e as curvas de sobrevida foram comparadas pelo teste de log-rank. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando JMP 9.0.2 software (SAS Institute, Cary, NC).

Resultados

Casos de câncer de pâncreas são frequentemente CD166

High

coloração imuno-histoquímica para CD166 foi realizada utilizando tecidos pancreáticos cirurgicamente ressecado (Figura 1A). Consistente com um estudo anterior, encontramos forte coloração CD166 em células das ilhotas e coloração moderada nos nervos como controlos positivos [11] – [13]. Em alguns casos, CD166 foi expresso moderadamente nas células acinares. Em 17 amostras de tecido pancreático normais, as células epiteliais do ducto pancreático não expressaram CD166 ou CD166 mostraram expressão fraca. Todos os tecidos pancreáticos normais foram identificados como CD166

baixa. Em tecidos de câncer de pâncreas, algumas células cancerosas foram coradas moderadamente para CD166, e identificamos 12,2% (12/98) dos tecidos de cancro do pâncreas como CD166

alta. A percentagem de CD166

tecidos elevados de cancro do pâncreas foi significativamente maior do que em tecidos normais do pâncreas (p = 0,0435). Em tecidos de câncer de pâncreas, descobrimos que a expressão CD166 foi associado com a invasão perineural (p = 0,037, Tabela S1), mas não prognóstico utilizando análise de sobrevivência de Kaplan-Meier (p = 0,1473, Figura 1B).

(A ) coloração imuno-histoquímica para CD166 foi realizada utilizando tecidos pancreáticos ressecados. (A) No pâncreas normais, CD166 foi fortemente expresso na membrana das células dos ilhéus (setas pretas) e fracamente em células do ducto pancreático normal (seta preta). (B) Em alguns tecidos de câncer de pâncreas, as células cancerosas foram positivos para CD166. Ampliação original: 200 ×. Inserções: 600 ×. (B) a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier revelou que a intensidade de expressão CD166 no câncer de pâncreas não se correlacionou com o prognóstico (p = 0,1473). (C) análise de citometria de fluxo da expressão de CD166 em células separadas com base na expressão de EpCAM. A taxa de expressão positiva (%) é indicado para cada marcador.

Também avaliamos CD166expression em tecidos pancreáticos por citometria de fluxo. Em tecidos de câncer de pâncreas, o CD166 + taxa variou 15,2-45,3% (média = 29,1%). Porque CD166 é expressa em vários tipos de células [5], utilizou-se a molécula de adesão celular epitelial (EpCAM), que é expresso exclusivamente nos epitélios e neoplasias derivadas-epiteliais, para excluir tecido não-epiteliais a partir da análise. Entre EpCAM + células (10-56,5% das células, média = 20,6%), a taxa positiva de CD166 variou de 33,8% a 70,2% (média = 47,9%) (Figura 1C). Não houve diferença significativa entre CD166 e taxas de positividade EpCAM (p = 0,3488).

CD166 expressão em linhas celulares de cancro pancreático humano

Em seguida, analisamos o CD166 + tarifa em linhas celulares de cancro do pâncreas por citometria de fluxo, e descobriram que CD166 foi expresso numa grande variedade de células (0-99,5%) (Figura 2A). Notavelmente, não foi encontrada relação entre o CD166 + taxa e potenciais malignos, tais como invasão, migração e proliferação, que estava em consonância com as conclusões de um relatório anterior (Tabela S2 e Figura S1) [20]. Para avaliar melhor o significado da expressão CD166 no câncer de pâncreas, analisamos SW1990 e células Panc-1 entre os quais 77,7-99,3% (média = 86,4%) e 38,5-54,0% (média = 46,9%) expressaram CD166, respectivamente. Após a separação das subpopulações CD166 + e CD166-, fizemos o check-CD166 semanal expressão em parental, CD166 + e as células CD166- ao longo de um período de 6 semanas (Figuras 2B, C). O CD166 + taxa não se alterou significativamente em células CD166 +, enquanto que em ambas as células parentais e CD166- aumentou gradualmente. De nota, não observamos diferenças morfológicas óbvias entre CD166 + e CD166- Panc-1 células (Figura 2D).

(A) CD166 taxas de positividade em duas linhas normais pancreáticas duto epiteliais celulares, linhas celulares de cancro do pâncreas, e células estreladas pancreáticas (PSCs). (B, C) células Panc-1 (C) (células parentais) SW1990 (B) e foram separadas com base na expressão CD166 (CD166 + e CD166-) por um separador AutoMACS PRO. Mudanças na expressão de CD166 em +/- subpopulações parentais e CD166 foram monitorados com frequência por citometria de fluxo ao longo de 6 semanas. (D) A morfologia das células Panc-1 separados com base na expressão de CD166. ampliação original:. 40 ×

CD166- células mostram altas atividades invasivas e migratórias, ao passo que CD166 + células mostram uma atividade de formação de colónia mais forte

Para explorar os efeitos de CD166 no câncer de pâncreas, diversos processos associados ao cancro foram testados em linhas de células pancreáticas que foram separadas com base na expressão CD166. Foram comparadas as capacidades invasivas e migratórias de células CD166 + e CD166- derivados de ambos SW1990 e linhas de células Panc-1. CD166- SW1990 e células CD166- Panc-1 exibiu significativamente maior do que a invasão de células de seus homólogos celulares CD166 + (p 0,05; Figura 3A). Além disso, as células exibiram uma CD166- marcadamente aumentada potencial migratório em comparação com a de células CD166 + de ambos SW1990 e linhas celulares de Panc-1 (p 0,05; Figura 3B). Utilizando um ensaio de proliferação, observou-se que as células CD166 + mostraram uma maior actividade proliferativa do que a de células CD166- a partir da linha celular SW1990 (p 0,0001), mas não CD166- células da linha celular de Panc-1 (Figura 3C). No ensaio de formação de colónia, células CD166 + Panc-1 mostrou uma actividade de formação de colónias significativamente mais forte do que a de células CD166- Panc-1 (p 0,05; Figura 3D). Em ensaios de formação de esfera e de adesão, não foram encontradas diferenças entre as capacidades de CD166 + e CD166- Panc-1 células (Figura 3E e 3F).

(A) ensaios de invasão das células CD166 + e CD166- derivado de SW1990 e linhas de células Panc-1 foram realizados por cultura das células em inserções Transwell revestidas com Matrigel. Após os tempos indicados, as células sobre a membrana inferior das inserções foram coradas com H E (imagens representativas são mostrados) e quantificado. (B) Os ensaios de migração de células CD166 + e CD166- de SW1990 e linhas celulares de Panc-1 foram realizados por cultura das células em inserções. Após os tempos indicados, as células sobre a membrana inferior das inserções foram coradas com H E (imagens representativas são mostrados) e quantificado. Ampliação original: 200 ×. (C) A proliferação de CD166 + e células derivadas de CD166- SW1990 e linhas celulares de Panc-1 foi medido nos tempos indicados pós-sementeira inicial. (D) Quantificação e imagens representativas das capacidades de formação de colónia de CD166 + e as células CD166- Panc-1. (E) Quantificação e imagens representativas das capacidades de formação esfera de CD166 + e as células CD166- Panc-1. (F) Quantificação e imagens representativas das capacidades adesivas de CD166 + e células CD166- Panc-1. ampliação original: 40 ×. Os dados representam a média ± SD; *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01; ***,

p Art 0,0001; NS, não significativo.

CD166 + células mostram forte tumorigenicidade em modelos de xenotransplante de rato

Para avaliar os efeitos de CD166 em

in vivo

o crescimento do tumor, nós transplantados subcutaneamente As células CD166 + ou CD166- em ratinhos nus. Descobrimos que CD166 + células tinham significativamente maior do que a tumorigenicidade das células CD166- derivadas da linha celular de Panc-1 (p = 0,0082; Figura 4A e na Tabela 3). Da mesma forma, SW1990 derivado CD166 + células tendem a gerar tumores maiores do que os das células CD166-, embora a diferença não foi estatisticamente significativa (Figura S2 e Tabela S3). Em modelos de xenoenxerto de ratinho ortotópico, os tumores derivados de células CD166 + Panc-1 eram mais pesados ​​do que os de células CD166- Panc-1 (p 0,05; Figura 4B). Análise dos modelos de xenoenxertos subcutâneos e ortotópicos por citometria de fluxo mostrou que a CD166 + taxa em tumores a partir de células CD166 + foi significativamente maior do que nos tumores de células CD166-, embora imunohistoquímica não mostraram diferenças significativas na expressão de CD166 (Figuras 4C-F). Também não houve relação significativa entre o tamanho dos tumores eo CD166 + taxa de células (Figura 4G).

Mice (A) foram transplantados subcutaneamente com parental, CD166 + e as células CD166- da célula Panc-1 volumes de linha (imagem representativa) e tumorais foram regularmente medido por 7 semanas. (B) mouse modelos de xenoenxerto de tumor ortotópico também foram gerados a partir de células CD166 + e CD166- Panc-1. Os tumores foram excisados ​​e pesados ​​molhado. (C, E) Análise imunohistoquímica de CD166 em subcutânea (C) e tumores ortotópicos (E) derivados de CD166 + e CD166- SW1990 e células Panc-1. ampliação original: 100 ×. (D, F) CD166 expressão foi analisada em subcutânea (D) e tumores ortotópicos (F) derivados de células CD166 + e CD166- por citometria de fluxo. (G) A análise da relação entre o peso do tumor e a taxa de positividade de células CD166 em tumores ortotópicos derivados de CD166 + e células CD166- Panc-1. Todos os gráficos mostram a média ± SD; *,

p Art 0,05, **,

p

. 0,01

CD166- células sobre-expressar a transição epitelial-mesenquimal (EMT) ativador Zeb1

Hong et al. relataram que knockdown de CD166 por RNA de interferência não tem efeito sobre o crescimento ou a invasão de células de cancro pancreático [12]. Nós também inibiu a expressão CD166 por RNA de interferência na linha de células do câncer de pâncreas SUIT-2. Como resultado, o knockdown de CD166 não afectou a invasão, migração, proliferação, ou actividades de formação de colónias (Figuras 5A, 5B, e S3A-C). Para elucidar fatores-chave ressaltando as diferenças funcionais entre CD166 + e as células CD166-, nós próxima focada na expressão de marcadores para EMT e CSCs pancreáticas. Foi avaliada a expressão de marcadores de células de EMT em SW1990 e Panc-1 utilizando qRT-PCR. Na fase primária de EMT, células perdem a expressão de marcadores epiteliais, expressam marcadores mesenquimais, e adquirir propriedades móveis e invasivas [21]. O nível de ARNm Zeb1, um activador de EMT, foi maior do que em células CD166- que em células CD166 +, embora não havia nenhuma diferença nos níveis de ARNm de epitelial marcador de E-caderina (Figura 5E). O nível de ARNm de N-caderina, um marcador mesenquimais, foi mais elevada em células CD166 + de que, em células CD166-. Além disso, o nível da metaloproteinase 2 (MMP2) de ARNm, que está relacionada com a capacidade de invasão celular, foi aumentada em comparação com células CD166- que em células CD166 + [22]. Em seguida, foi analisada a relação entre a expressão CD166 e CSC marcadores CD24, CD44 e CD133; no entanto, não encontramos quaisquer alterações significativas na sua expressão entre as células CD166 + e CD166- derivados de Panc-1 células (Figura 5D) [23], [24].

análise (A) qRT-PCR de os níveis de mRNA de CD166 em SUIT-2 células após interferência de RNA foi realizada nos dias indicados após a transfecção. Controle (siControl) ou CD166 células silenciadas (siCD166) foram analisadas por ensaios (B) a formação de colónias nos dias indicados após a transfecção. (C) Análise de qRT-PCR de EMT marcadores de E-caderina, N-caderina, Zeb-1, e em MMP2 CD166 + e CD166- Panc-1 e células SW1990. (D) As relações entre a expressão de CD166 e CSC marcadores CD24, CD44, CD133 e em células Panc-1 foram analisadas por citometria de fluxo. Os dados representam a média ± SD; *,

p Art 0,05; NS, não significativo.

análise Microarray mostra sobre-expressão de TSPAN8 e BST2 em CD166 + células, enquanto BMP7 e Col6A1 são sobre-expressos em células CD166-

Para identificar outra chave moléculas envolvidas na expressão de CD166, foram realizadas análises de microarray de células CD166 + e CD166- de ambas as linhas celulares Panc-1 e SW1990. A comparação dos dados de microarray identificou 26 genes que foram sobre-reguladas por mais do que duas vezes em células CD166 + (Tabela S4) e 11 genes que foram sobre-reguladas por mais do que duas vezes em células CD166- (Tabela S5). Destes genes, que seleccionado TSPAN8, BST2, BMP7, Col6A1 e para posterior análise, porque estes genes têm sido referida como estando envolvida na tumorigenicidade ou invasão do cancro e a migração celular. análise de qRT-PCR foi então realizada para validar dados de microarray (Figura 6A) [25] – [29]. Para avaliar os efeitos de CD166 knockdown sobre a expressão destes quatro genes, os seus níveis de ARNm foram avaliados em células SUIT-2 após a interferência de ARN. Como resultado, não se verificaram alterações significativas nos níveis destes genes (Figura S4) de expressão.

(A) qRT-PCR foi usado para analisar os níveis de mRNA de TSPAN8, BST2, BMP7, e Col6A1, que se verificou ser sobre-regulada por mais do que duas vezes em células CD166 + e CD166- em comparações de dados de microarray. (B) A taxa de positividade de CD166 em linhagens de células metastáticas Panc-1 e metastáticos SUIT-2 foi medida por citometria de fluxo. Análise (C) qRT-PCR também foi usada para examinar os níveis de ARNm de CD166 nas linhas de células metastáticas. Os dados representam a média ± SD; *,

p Art 0,05, **,

p Art 0,01, ***,

p

. 0,001

Para explorar se CD166 desempenha um papel na metástase, foram utilizadas duas linhas celulares de cancro metastático previamente estabelecidos pancreáticas que foram gerados a partir de metástases no fígado em modelos de xenotransplante de rato nu [15]. Estas linhas celulares, metastático Panc-1 e metastático SUIT-2, mostrou um potencial metastático do fígado mais forte em comparação com a das suas linhas celulares parentais. Na linha de células metastática Panc-1, a taxa de expressão de CD166 foi significativamente aumentada em comparação com o das células parentais (99,2% vs 46,9%, Figura 6B). Na linha de células SUIT-2, a maioria das células expressaram CD166 em ambas as células parentais SUIT-2 (99,3%) e células SUIT-2 metastáticos (99,4%). análise de qRT-PCR mostrou que os níveis de ARNm de CD166 em ambos metastático Panc-1 e células SUIT-2 metastáticos foram significativamente maiores do que aqueles nas suas linhas celulares parentais (p 0,0001 e p = 0,0015 para Panc-1 e SUIT-2,