Abstract
Fundo
E
extra-esofágicos carcinoma de células escamosas (CCEE) é altamente prevalente na China e outros países asiáticos, como uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer . ESCC exibe anormalidades cromossômicas complexas, incluindo múltiplas aberrações estruturais e numéricas. anormalidades cromossômicas, como amplificações recorrentes e deleções, contribuem diretamente para tumorigênese através da alteração da expressão de oncogenes-chave e genes supressores de tumor.
Metodologia /Apreciação Princípio
T
o compreender o papel de alterações genéticas em ESCC patogênese e identificar alvos críticos amplificação /deleção, foi realizada análise comparativa gama de 1 MB de todo o genoma hibridização genômica (aCGH) por 10 linhas de células CICAc comumente usados. ganhos cromossômicas recorrentes eram frequentemente detectado em 3q26-27, 5p15-14, 8p12, 8p22-24, 11q13, 13q21-31, 18p11 e 20q11-13, com perdas frequentes também foram encontrados em 8p23-22, 11q22, 14q32 e 18q11-23 . Ganho de 11q13.3-13.4 foi a alteração mais frequente em ESCC. Dentro desta região,
CCND1
oncogene foi identificado com alto nível de amplificação e superexpressão em ESCC, enquanto
FGF19
e
SHANK2
foi também notavelmente sobre-expresso. Além disso, uma concordância elevada (91,5%) de amplificação do gene e a sobre-expressão de proteínas de
CCND1
foi observada em tumores primários CICAc.
CCND1
amplificação /superexpressão também foi significativamente correlacionada com a metástases em linfonodos de ESCC.
Conclusão
Estes resultados sugerem que o ganho de genômica de 11q13 é o principal mecanismo contribuir para o amplificação. oncogenes novos identificados dentro do amplicon 11q13 incluindo
FGF19
e
SHANK2
podem desempenhar papéis importantes na CICAc tumorigênese
Citation:. Ying J, Shan L, Li J, Zhong L , Xue G, H Zhao, et ai. (2012) Screening Genome-Wide para alterações genéticas no cancro esofágico por aCGH Identifica 11q13 Amplification Oncogenes Associated com Nodal metástase. PLoS ONE 7 (6): e39797. doi: 10.1371 /journal.pone.0039797
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão
Recebido: 06 de outubro de 2011; Aceito: 30 de maio de 2012; Publicação: 25 de junho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Ying et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (# 30.801.344, # 30.928.012) e do Programa Nova Beijing (No. 2009A70). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de esôfago é uma das neoplasias malignas mais agressivas originado no trato gastrointestinal, e classifica como a sexta maior causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. Sua incidência varia muito entre as diferentes regiões do mundo, com a China como uma área de alto risco. Em alguns distritos do norte e centro da China, sua incidência superior a 100 casos /por 100.000 por ano [2]. Histologicamente, câncer de esôfago é classificado como adenocarcinoma esofágico e carcinoma epidermóide de esôfago (CEE). A maioria dos casos relatados nos EUA são adenocarcinomas de esôfago, no entanto, na China e outros países asiáticos, CICAc é o tipo predominante de que é responsável por cerca de 90% de todos os casos. Apesar dos avanços nas terapias multimodais, CICAc continua a ser um grave problema de cuidados de câncer em muitos países com taxas de sobrevida em 5 anos muito baixas ( 30%) [3]. Assim, é de grande valor clínico para procurar biomarcadores sensíveis e específicos para a detecção precoce e prognóstico desta malignidade, bem como novos alvos terapêuticos.
ampliações genómicas e deleções contribuir para a tumorigénese humana ao alterar a expressão níveis de oncogenes importantes e genes supressores de tumor (ETG). Apesar de sua alta prevalência, CICAc não foi estudado tão intensivamente como o seu homólogo adenocarcinoma. Esforços têm sido feitos para identificar alterações no número de cópias brutas de ambas as linhas celulares CICAc e tumores, incluindo cariótipo, fluorescência
in situ
fluorescente (FISH), hibridação genômica comparativa convencional (CGH) e perda de heterozigosidade (LOH) analisa . De acordo com dados disponíveis publicados até agora, as amplificações cromossômicas mais comumente citados em ESCC são 3T, 4T, 5p, 8p, 7q, 9Q, 10q21, 11q13-q22, 18p11.3, 20Q e 22qtel [4] – [12]. As amplificações abrigando oncogenes, v.g. 11q13 (
CCND1
,
EMS1
), 3q26 (
EIF5A2
), 21q22 (
ETS2
), 8q24
(MYC)
, têm sido consistentemente observado em mais de um estudos [4] – [12]. perdas cromossômicas recorrentemente envolvem 3p, 5q, 9p, 13q, 18q e 21q, em que os genes tais como
FHIT
,
APC
,
RB1
e
CDKN2A alvo
estão localizados [4] – [12]. Nos últimos anos, de alta resolução matriz baseada em CGH (aCGH) foi aplicada para identificar oncogenes alvo e STG através definir ganhos e perdas correntes em vários cancros. Até recentemente, dois estudos realizados análise aCGH em amostras CICAc primárias, revelando recorrentes, amplificações de alto nível em 3q27.1, 7p11, 8q21.11, 8q24.21, 11q13.3, 11q22, 12q15-q21.1, 18q11.2 e 19q13.11-q13.12 e deleções em 4q34.3-q35.1 e 9p21.3 [13]; [14]. No entanto, em comparação com linhas celulares CICAc “puros”, amostras CICAc primários contêm lotes de células normais que podem afectar aCGH resultados de diferentes maneiras. Apesar de vários estudos de genoma inteiro abrangentes sobre linhas de células CICAc foi relatado, as linhas celulares utilizadas são oriundas principalmente da ESCC japonês (série TE) e Sul CICAc Africano pacientes, respectivamente [15] – [17]. Profiling de múltiplas linhas de células CICAc provenientes de diferentes áreas de alto risco em Asian via aCGH não só irá permitir a identificação de alterações cromossômicas recorrentes em ESCC asiática, mas também fornecer informações valiosas para futuros estudos utilizando essas células linhas como modelos CICAc.
neste estudo, nós perfiladas 10 linhas celulares CICAc comumente usados provenientes da China continental (EC1, CE18 e EC109), Hong Kong chinês (HKESC1, HKESC2, HKESC3 e SLMT1) e japonês (KYSE70, KYSE410 e KYSE520) pacientes para todo o genoma número de cópias de DNA alterações usando análise aCGH. Entre alterações identificadas, a amplificação de 11q13 é o ganho mais freqüente, abrigando
FGF19
,
SHANK2
e
CCND1
. Descobrimos ainda que
CCND1
expressão era frequentemente regulada em tumores CICAc primários, e amplificação de DNA contribui para a sua sobre-expressão, que está correlacionada com metástases em linfonodos de tumores CICAc primários.
Resultados
Perfis genômico de CICAc celular Lines por 1 Mb aCGH
Dez linhas celulares CICAc foram analisados utilizando 1-Mb aCGH (array clone Sanger 3040-BAC /PAC). rácios de intensidade de sinal para cada BAC foram processados e apresentados como parcelas log2 usando software SeeGH [18]. A Figura 1 mostra cariogramas o representante SeeGH de uma linha celular ESCC (CE18) analisados, demonstrando a identificação de vários ganhos e perdas. Outros cariogramas SeeGH de linhas celulares CICAc analisadas são mostradas na Figura S1. A Figura 2 resume as regiões recorrentemente alterados (log2 com rácios mais do que 1 ou menos que -1). Em geral, os ganhos cromossômicas foram mais frequentemente detectado do que perdas. As alterações mais freqüentes incluem ganho de 11q13 (70%) e perda completa da 18q11-23 (50%). Outros ganhos que ocorrem em três ou mais linhas de células são 3q26-27 (40%), 5p15-14 (50%), 8p12 (30%), 8p22-24 (30%), 13q21-31 (30%), 18p11 ( 30%) e 20q11-13 (40%). Outros perdas que ocorrem em três ou mais linhas de células são 8p23-22 (40%), 11q22 (30%) e 14q32 (30%) (Fig. 2).
proporções da intensidade de sinal log2 normalizados foram traçados usando SeeGH Programas. A relação sinal log2 de 0 representa o número de cópia equivalente, entre a amostra e o ADN de referência (detalhes em Materiais e Métodos). Cytoband padrão para cada cromossoma é mostrado na esquerda. As linhas verticais indicam relações sinal log2 de -2 a +2, com número de cópias crescente na direita e diminuindo na esquerda. Cada ponto azul escuro representa um único clone BAC.
Anormalidades com frequência ≥20% em 10 linhas de células CICAc são mostrados. * Regiões com anormalidades em linhas celulares ≥50% são exibidas em negrito.
A amplificação e superexpressão do 11q13 Genes em linhas celulares CICAc
Entre as regiões identificadas com alterações recorrentes, a amplificação de 11q13 0,3-13,4 é o ganho mais frequente em CICAc (Fig. 3A), em especial nas linhas celulares derivadas de pacientes chineses (6/7 linhas celulares, 85%). Vários genes com funções potenciais oncogênicos foram identificados neste local, incluindo
CCND1
e
CTTN
. Assim, 11q13, foi investigada para a confirmação dos ganhos e identificação de genes amplificados, por duplex de ADN genómico por PCR em 10 linhas de células CICAc.
CCND1
é mapeado para o centro do 11q13 amplicon, e amplificação de alto nível do
CCND1
foi confirmado em 6/10 linhas celulares (Fig. 3B, C), enquanto
CTTN
exibiu o segundo maior nível de amplificação (em 5/10 linhas celulares).
, perfis aCGH de seis linhas celulares CICAc no
CCND1
lócus. rácios de sinal log2 normalizados foram plotados. As amplificações foram definidos como intensidades de sinal log2 ≥1. As linhas horizontais representam relações sinal log2 de -1 a 3, com o aumento do número de cópias para cima. Cada ponto preto /colorido representa um único clone BAC. Os nomes dos clones BAC relacionados também são mostrados. Transcrição mapa do amplicão núcleo 11q13 é mostrado na parte inferior.
B
, análise genômica duplex semi-quantitativa DNA PCR de
CCND1
em 10 linhas de células CICAc e 3 amostras normais PBMC. rácios de intensidade de sinal de
CCND1
/
GAPDH
são mostrados.
C
, Resumo do número de cópias do gene alterações de vários genes dentro do 11q13 amplicon. Os números mostrados na tabela são dobras de números de cópias de linhas celulares CICAc relação aos valores médios de três amostras de PBMC. PBMC, células mononucleares do sangue periférico.
Vários genes em torno de
CCND1 Restaurant at 11q13 foram ainda examinadas pela semi-quantitativa RT-PCR em linhas celulares CICAc. Os resultados mostraram que
FGF19
e
SHANK2
também foram notavelmente sobre-expresso em linhas celulares CICAc, enquanto apenas fracamente ou não expresso no esôfago normal ou imortalizado células normais (Fig. 4), embora nenhuma amplificação óbvio de
SHANK2
foi detectado nestas linhas celulares.
FGF3
(dados não mostrados) e
4
basicamente não foram expressas em qualquer linha celular ou CICAc esófago normal. A sobre-expressão de
CCND1
e
CTTN
também foi observada na maioria das linhas celulares CICAc quando comparado com esófago normal, embora eles foram geralmente expressos em esófago normal e as células imortalizadas (Fig. 4). Tomados em conjunto, estes dados confirmam que 11q13 é a amplificação mais frequente em ESCC e delineados vários genes, incluindo
CCND1
,
CTTN
,
FGF19
e
SHANK2,
como potenciais oncogenes críticos afetados.
o estado de amplificação de 11q13 região por aCGH e
CCND1
por DNA PCR multiplex estão listados na parte inferior. +, Amplificada; -, Não amplificado. 23x, 25x, 30x: ciclos de RT-PCR. Todos os outros genes foram examinados por RT-PCR com 30 ciclos, com
GAPDH Compra de apenas 23 ciclos.
CCND1 superexpressão na Primária CICAc e sua associação clinico-patológica
a expressão da proteína CCND1 foi ainda investigado pela imuno-histoquímica em ESCC tissue microarray (TMA) de 171 ESCC primária e cirúrgico margem histológicos tecidos esofágicas normais adjacentes. Casos com 10% das células tumorais que apresentam coloração nuclear positiva foram marcados por CCND1 superexpressão. Noventa e quatro dos 171 casos (55%) apresentaram CCND1 superexpressão, incluindo 42 casos de grau 1+, 35 casos de grau 2+ e 17 casos de grau 3+ (Fig. 5a). Em contraste, apenas dispersa células positivas foram encontradas em células basais de epitélio esofágico normal.
.
A
,
Mais painéis
, coloração imuno-histoquímica para
CCND1
.
Esquerda, positividade dispersa de
CCND1
, especialmente na camada basal, é visto no epitélio esofágico normal (ampliação original, × 200).
Oriente, um caso de ESCC é negativo para
CCND1
expressão (ampliação original, × 200).
direito, difusa e coloração nuclear forte para
CCND1
neste caso de ESCC (ampliação original, × 200).
painéis de fundo
, análise de FISH. Sinais verdes referem-se a referência a sonda de chr 11 centrômero enquanto os sinais vermelhos são sonda alvo para
CCND1
.
Esquerda
, sem amplificação no epitélio esofágico normal,
Oriente, um caso CICAc sem amplificação.
direito, um caso CICAc amplificado.
B
. Resultados do
CCND1
níveis de amplificação e expressão em 94 CICAc primária embebido em parafina.
Em seguida, testamos a correlação entre a superexpressão CCND1 e características clínico-patológicas, incluindo o tamanho do tumor, grau, linfonodo metástase, ea idade do paciente. superexpressão CCND1 foi significativamente associada com metástase ganglionar (
p
= 0,006) (Tabela 1), mas não com a PT, grau ou idade do paciente (
p Art 0,05, respectivamente). Nos casos com superexpressão CCND1, não houve diferença significativa em relação à metástase ganglionar, entre grupos de alto expressão CCND1 (grau 2+ e 3+) e no grupo de baixa expressão (1+) (
p
= 0,37).
CCND1 superexpressão resultante de gene Amplification mas não ativado β-catenina Sinalização
Para confirmar a amplificação do gene da
CCND1
em ESCC primária e investigar a associação com a sua sobre-expressão, aplicamos hibridização fluorescente in situ (FISH) análise com comercial
CCND1
sonda juntamente com CEP 11 sonda em 94 casos.
CCND1
foi amplificado em 50 casos (53,2%) e não-amplificada em 44 casos (46,8%) (Fig. 5B). Além disso, a amplificação do gene por FISH e proteína sobre-expressão por imuno-histoquímica para
CCND1
mostrou 91,5% (
κ
= 0,69) de concordância.
Na análise imunohistoquímica, coloração nuclear de β-catenina foi positivo apenas em 4/94 casos (4,3%). Todos os casos positivos β-catenina foram negativos para CCND1 por imuno-histoquímica.
Discussão
CICAc é o sexto tipo de câncer mais fatal no mundo inteiro e é responsável por 90% dos casos de todos os cânceres de esôfago na China [19]. Embora a incidência de ESCC é baixa nos países ocidentais, este tumor é comum na Ásia, especialmente em algumas regiões da China como província de Henan e da cidade Shantou [20]; [21]. Como outros tipos de câncer, fatores ambientais e genéticos contribuem para CICAc patogênese. Tabaco, álcool, bebida quente /alimentação, deficiência alimentar e acalásia têm sido considerados como os principais fatores de risco ambientais para ESCC, como revelado por estudos epidemiológicos [21]; [22]. Enquanto isso, as análises genéticas citogenéticos e moleculares demonstraram múltiplas anormalidades genéticas em ESCC, incluindo perdas cromossômicas e ganhos. Elucidação desses aberrações levará a uma melhor compreensão da ESCC patogênese, e continuar a desenvolver terapias e biomarcadores para a previsão de metástases e prognóstico. Neste estudo, foi realizada uma investigação exaustiva de anomalias genómicas em ESCC por CGH-array com base de alta resolução, para delinear as regiões cromossômicas mínimas de amplificações e exclusões. Os resultados fornecem imagens detalhadas de múltiplas lesões genéticas em genomas CICAc, e também dar dicas para posterior identificação dos oncogenes críticos e ETG nesta malignidade
De acordo com os achados anteriores [4] -. [14], os ganhos recorrentes, incluindo 11q13 (
CCND1
,
EMS1
), 3q26 (
EIF5A2
), 21q22 (
ETS2
) e 8q24
(MYC)
e perdas, incluindo 3p, 5q, 9p, 13q, 18q e 21q com genes alvo, tais como
FHIT
,
APC
,
RB1
e
CDKN2A
, foram identificados em linhas de células CICAc neste estudo. Entre amplicons detectados, 11q13.3-13.4 é a região cromossômica mais frequentemente amplificados. Dois genes,
CCND1
e
CTTN localizado nesta região, foram identificados com amplificações de alto nível em várias linhas celulares CICAc. Enquanto investigados em nível mRNA, encontramos vários genes, incluindo
CCND1 CTTN, FGF19
e
SHANK2
, eram frequentemente sobre-expresso em linhas celulares CICAc. Recentemente, Sawey et al relatou que
CCND1
e
FGF19
dois oncogenes condução no carcinoma hepatocelular [23]. Neste estudo, nós nos concentramos em
CCND1
. Nosso estudo confirmou a amplificação frequente (53,2%) e proteína concordantes sobre-expressão (51,1%) do
CCND1
em ESCC primário. Além disso, uma correlação positiva entre
foi observada CCND1
amplificação /superexpressão e metástase linfática em ESCC, indicando que
CCND1
pode servir como um marcador de prognóstico para ESCC, em linha com outros estudos ([ ,,,0],24] – [27] para além de amplificação, CCND1 sobre-expressão pode ser conduzido por regulação da transcrição, tais como a via de sinalização Wnt Beta-catenina é um membro chave da via de sinalização Wnt, que foi sugerida envolvido na iniciação do cancro esofágico.. e progressão [28]. neste estudo, apenas 4,3% (4 de 94) dos casos CICAc foram identificados com expressão nuclear de beta-catenina. os resultados indicam que o ganho genómico de 11q13 em CICAc é o mecanismo primário resultante em
CCND1
amplificação e superexpressão. Este mecanismo também tem sido relatada em outros tipos de tumores, tais como carcinoma de cabeça e pescoço [29], tumores hipofisários [30], e cancro da mama [31].
CTTN é um -actina associada proteína andaime, se liga e activa o complexo de proteína relacionada com a actina (Arp2 /3) e, portanto, regula as redes ramificadas de actina na formação das estruturas associadas à actina cortical dinâmicas.
CCND1
e
CTTN
são frequentemente co-amplificada em cancros [32] – [34]. Anteriormente,
CTTN
foi identificado como um
bona fide
oncogene localizado na 11q13 envolvido em ESCC carcinogênese, contribuir para a metástase de várias caners incluindo ESCC, mama, hepatocelular, e cabeça e pescoço escamoso carcinomas de células [32] – [34]. FGF19, um factor de crescimento de fibroblastos, em conjunto com CCND1, foi recentemente relatado que um grande oncogene condutor no carcinoma hepatocelular [23]. O envolvimento de FGF19 e outros oncogenes novos identificados no CICAc patogênese e os mecanismos de moléculas relacionadas precisa ser mais investigada.
Entre outros ganhos cromossômicas freqüentes, 3q26-27 é um amplicon romance detectado em ESCC. oncogenes bem conhecidos que residem nesta região incluem
EVI1
,
EIF5A2
e
PIK3CA
, que têm sido relatados para expor funções oncogênicos potenciais. Além disso,
TRIO Comprar e
CTNND2 Restaurant at 5p,
MYC
em 8q22,
KLF5
e
POU4F1 Restaurant at 13q e
NKX2.2
em 20p também foram considerados a desempenhar papéis oncogênicos em outros tumores [35]; [36] e pode contribuir para CICAc carcinogênese. Regiões de eliminações elevada que contenham conhecido ou ETG candidatos também foram detectados, incluindo 18q11-23 contendo
Smad2, SMAD4
e
DCC
(EC1, EC109, HKESC3, SLMT1 e KYSE70), 8p22 contendo
DLC1
(EC1, KYSE70, 410 e 520) e uma região em 14q32 contendo
DLK1
e
MEG3
(EC1, EC109 e KYSE70). Outras eliminações de alto nível contendo ETG candidatos incluem 4q21.23-21.3 (
MAPK10
,
PTPN13
e
ARGAP24
), 7p21.2 (
DGKB
), 7q35 (
CNTNAP2
), 8q11 (
CEBPD
), 10p11 (
PARD3
), 13q31.1 (
SPRY2
) e 16q22 -23 (
ATBF1
). A maioria destas regiões deletadas de CICAc também têm sido relatados em um ou mais outros tipos de cancro [37]; [38]. Importante, genéticos /interrupções epigenéticas ou níveis de expressão alterada de alguns candidatos ETG mencionado acima, incluindo
Smad2
,
SMAD4
,
DCC
,
DLC1 Comprar e
PARD3 de viajantes têm sido relatados em tumores CICAc e linhas de células, indicando que aCGH estudo usando várias linhas de células tumorais pode facilitar a identificação de genes de cancro críticos em tumores humanos. [39] – [42].
Em conclusão, várias regiões mínimas de supressões e amplicons foram detectados em 10 linhas de células CICAc comumente utilizados neste estudo, e vários novos oncogenes localizados na região mais frequentemente amplificados 11q13, incluindo
FGF19
,
SHANK2
e
CCND1
, foram identificados. Este estudo fornece dados cruciais para posterior identificação e caracterização de oncogenes críticos e ETG envolvidos na patogênese ESCC.
Materiais e Métodos
Linhas Celulares
Dez linhas celulares CICAc (EC1, CE18, EC109, HKESC1, HKESC2, HKESC3 e SLMT1 são de pacientes chineses, enquanto KYSE70, KYSE410 e KYSE520 são a partir de pacientes japoneses) e três linhas imortalizadas normais esofágicas epiteliais celulares (Het-1A, NE1 e NE3) foram usados no estudo [ ,,,0],43]. As linhas celulares foram mantidas em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT), cultivadas em 5% de CO
2 a 37 ° C.
As amostras tumorais
foi obtido um total de 171 amostras fixadas em formalina e embebidos em parafina (FFPE) chineses CICAc (2007-2008) e de margem cirúrgica histológica tecidos normais adjacentes esôfago, após consentimento informado escrito dos pacientes que recebem e Institucional Review Board aprovação (IRB) do Hospital do Câncer, da Academia chinesa de Ciências Médicas, Beijing, China. Todos os pacientes foram tratados previamente (isto é, sem a quimioterapia ou a radioterapia), com tumores primários operados. A idade média dos pacientes era de 58 anos (variação 33-78), e rácio entre homens e mulheres foi 4.2: 1 (138: 33). Hematoxilina e eosina (HE) seções -stained foram revisados para confirmar o diagnóstico e definir áreas tumorais. estágio do tumor (PT) e grau foram definidos de acordo com a classificação atual da OMS de tumores.
array CGH Análise
cromossômica alta peso molecular do DNA foi isolado de linhas celulares utilizando o kit Qiagen (Qiagen , Hilgen, Alemanha). A pureza e o peso molecular do DNA foram examinadas em géis de agarose. 1 Mb resolução matrizes todo o genoma com 3040 clones BAC /PAC foram fornecidos pelo Instituto Sanger, Reino Unido (https://www.sanger.ac.uk/Projects/Microarrays/) [44]. detalhes clones são listados na Ensembl (https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html)
matriz-CGH foi realizada com ligeiras modificações [43] -. [45]. Resumidamente, o ADN da amostra (600 ng) foi marcado com Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia), ao passo que de ADN de referência de células periféricas normais mononucleares do sangue (PBMC) de doadores chineses saudáveis com Cy3-dCTP usando a matriz BioPrime CGH genómico Labeling System (Invitrogen, Carlsbad, CA). nucleótidos não incorporados foram removidos usando Módulo Purificação fornecido no sistema de rotulagem. As amostras marcadas e DNA normal (50 mL cada) foram misturados e precipitado com etanol juntamente com 67,5 ul de Cot-1 DNA humano (Invitrogen). Em seguida, o ADN misturado foram ressuspensas em 30 ul de tampão de hibridação, desnaturados e pré-hibridadas em uma câmara de humidade no interior de um forno de hibridação a 5 rpm durante 2 horas a 37 ° C. A mistura de pré-hibridação foi preparado como se segue: 80 uL de arenque ADN de esperma (10 mg /ml, Sigma) e 67,5 uL de Cot-1 DNA humano (Invitrogen) foram precipitadas, ressuspensas em 120 ul de tampão de hibridação e desnaturado durante 10 min a 72 ° C. Depois de pré-hibridização, a sonda foi adicionada pré-hibridados sobre a lâmina, e incubados a 5 rpm durante 48 horas a 37 ° C. As lamelas foram enxaguadas e lavadas três vezes, e armazenadas a 4 ° C secou-se ao ar.
lâminas hibridadas foram digitalizadas utilizando um scanner Axon 4000B (Axon Instruments Inc, Union City, CA) e analisadas com a imagem 4,0 GenePixPro software de análise onde as manchas foram definidos e intensidades de fluorescência média foram calculados. O fundo subtraído intensidades de fluorescência foram importados para um modelo de planilha Microsoft Excel design personalizado. Um ponto específico foi excluída se os pontos duplicados têm uma diferença de 10%. Os valores médios das manchas duplicados foram apresentados na saída gráfica sob a forma de log2 significativo (Cy5 /Cy3) proporção em função da distância ao longo de cada cromossoma (Mb). Cromossômicas no número de cópias mudanças foram classificados como perda hemizygous se a razão log2 foi variando de -0,2 a -0,7, e deleção homozigótica se -0.7, ou ganho genômica para o rácio do log2 de 0,2 a 0,5, e amplificação se 0,5. alterações no número de cópias visto nos cromossomas sexuais foram excluídos na análise.
Multiplex Genomic PCR
Multiplex PCR permitiu uma avaliação semi-quantitativa da amplificação do DNA /perda.
gene GAPDH
foi selecionado como um controlo interno. Nós amplificado
CCND1
eo controle interno simultaneamente. Para
CCND1
, um par de iniciadores (directo: 5′-tgctgcgaagtggaaaccat e reverso: 5′-caacaagttgcagggaagtc) gerou um produto de PCR de 227 pb. Para
GAPDH, um par de iniciadores (directo: 5′-gcctcactccttttgcagac e reverso: 5′-gatgaccttgcccacagcct) gerou um produto de PCR de 157 pb. As reacções de PCR foram realizadas num volume final de 20 ul contendo 200 mM de trifosfatos de desoxinucleótido, MgCl 2,5 mM
2, 50 ng de ADN, 0,5 mM de cada um dos oligonucleótidos e 0,5 U de AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA). As condições reaccionais eram como se segue: uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 30 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 30 s e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 2% e visualizados. Todas as reacções foram realizadas pelo menos duas vezes em experiências independentes.
semi-quantitativa de transcrição reversa PCR
O ARN total foram extraídos a partir de sedimentos celulares utilizando Reagente TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH). A transcrição reversa PCR (RT-PCR) foi realizada como descrito [43], utilizando
GAPDH como um controlo. Os primers para todos os genes será fornecido mediante solicitação. O programa de PCR utilizou uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 30 ciclos de reacção (94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s) (ou 23, 25 ciclos para CCND1), com uma extensão final a 72 ° C durante 10 min.
CICAc tissue microarray (TMA)
para cada caso, tanto tecidos tumorais e normais foram duplicados com um diâmetro de 1 mm numa lâmina de vidro. Antes de a aquisição de amostras, coradas com HE FFPE de slides de cada caso foi observado sob um microscópio e os locais de morfologia tipicamente característico de ESCC e tecidos normais circundantes foram circulados. As amostras foram tomadas a partir dos locais circulados no bloco de parafina utilizando o Tissue Beecher Instruments Arrayer (Silver Springs, MD). Para cada bloco, dois núcleos de 1 mm foram perfurados a partir das regiões circulados no bloco dador e vestiu no bloco receptor para assegurar a representação das amostras, e evitar a informação em falta devido a uma perda de núcleos de tecido. Um total de 171 espécimes CICAc, 54 espécimes de mucosa normal correspondente foram dispostas em dois blocos receptores. As secções de tecido microarray (4 mm) foram cortadas 24 h antes de imuno-histoquímica.
Automated Imunohistoquímica
A imuno-histoquímica foi realizada com um Ventana Referência XT Autostainer (Ventana, Tuscon, EUA), utilizando anti-coelho monoclonal CCND1 humano /ciclina D1 (SP4 clone) e monoclonal de ratinho β-catenina anti-humano (clone β-catenina-1) da Dako (Glostrup, Dinamarca) com kits Ventana UltraView (Ventana, Tucson, EUA). As lâminas foram incubadas durante 24 min a 37 ° C com anticorpos primários. Diaminobenzidina ou 3-amino-9-etilcarbazole foi usado como cromogénios e as lâminas foram contrastadas com hematoxilina antes da montagem. Ambos os cromogénios utilizados em secções regulares completas antes do teste TMA deu resultados concordantes em termos de ambas as superfícies e as intensidades de imunocoloração. Os controlos negativos foram criados por omissão do anticorpo primário e substituição com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
os níveis de expressão e CCND1 β-catenina foram determinadas semi-quantitativamente usando um sistema de pontuação de quatro níveis, com base na positiva fracção nuclear de coloração de células tumorais (grau 0 = 0-10%; 1+ = 11-25%; 2+ = 26-50%; grau 3+ = 51-100%). Uma pontuação de 0 foi considerado negativo, enquanto uma pontuação de 1+, 2+ ou 3+ foi considerado positivo. Para β-catenina, coloração no citoplasma pode ter estado presente, mas não foi incluído na determinação da positividade.
Fluorescência hibridização in situ (FISH)
Para a análise FISH de
CCND1
amplificação do gene, foram utilizadas duas sondas diretas marcado, Vysis
CCND1 Kit Twitter /CEP11 FISH Probe incluindo LSI
CCND1
(11q13) SpectrumOrange contra
CCND1
(11q13) e CEP11 SpectrumGreen (Vysis /Abbott, IL, EUA) contra o centrômero do cromossomo 11. análise de FISH foi feito de acordo com “sondas de DNA identificador específico LSI Locus” de Vysis. O
CCND1
gene no cromossoma 11 rácio centrômero foi medido em pelo menos 60 núcleos de células tumorais e uma pontuação média foi tirada. Observando mais de duas cópias do
CCND1 Compra de cada cromossomo 11 foi considerado um sinal positivo para
CCND1
amplificação do gene.
Análise Estatística
Estatística A análise foi realizada usando SPSS versão 12.0. A associação entre os peixes e os resultados de IHQ e as variáveis clínico-patológicas são realizados usando o χ
2 -teste. Para todos os testes, um
p
-VALOR de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
Informações de Apoio
Figura S1..
perfis de genoma completo de 10 linhas de células CICAc por 1 Mb aCGH. rácios de intensidade de sinal log2 normalizados foram representados graficamente utilizando o software SeeGH. A relação sinal log2 de 0 representa o número de cópia equivalente, entre a amostra e o ADN de referência (detalhes em Materiais e Métodos). padrão Cytoband para cada cromossomo está à esquerda para cada parcela. As linhas verticais indicam relações sinal log2 de -2 a +2, com número de cópias aumenta para a direita e diminui para a esquerda. Cada ponto preto representa um único clone BAC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0039797.s001
(TIF)
Reconhecimentos
Agradecemos Dr tzer Jing Seng para o ajuda da matriz-CGH, Profs Gopesh Srivastava e George Tsao (University of Hong Kong) para alguns CICAc e linhas de células epiteliais do esôfago normais, e DSMZ (Colecção alemã de Microrganismos culturas de células). para linhas celulares KYSE (Shimada et al, Cancer 69: 277-284, 1992)
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