Abstract

A adesão de metástase células de carcinoma da próstata foi quantificada por duas linhas de células de carcinoma modelo LNCaP (nó específico linfático) e PC3 (medula óssea específica). Por microscopia de lapso de tempo e espectroscopia de força que encontramos células PC3 de aderir preferencialmente a células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea (linha celular SCP1). Usando a microscopia de força atómica (AFM), espectroscopia de força com base, o padrão mecânica da adesão às células SCP1 foi caracterizada por ambas as linhas de células de cancro da próstata e em comparação com um substrato que consiste em colagénio do tipo puro I. células PC3 mais energia dissipada (27,6 aJ) durante os experimentos AFM-adesão des forçados e mostrou significativamente mais adesivo e laços mais fortes em comparação com células LNCaP (20,1 AJ). As assinaturas características dos traços força de desprendimento revelaram que, em contraste com as células LNCaP, as células PC3 parecem utilizar o seu filopios para além de estabelecer ligações adesivas. Tomados em conjunto, o nosso estudo demonstra claramente que as células PC3 têm uma afinidade adesiva superior a células estaminais mesenquimais da medula óssea, em comparação com células LNCaP. PCR semi-quantitativa em ambas as linhas celulares de carcinoma da próstata revelou a expressão de dois receptores de integrina de ligação Cl-I, α1β1 e α2β1 em células PC3, sugerindo o seu possível envolvimento na interacção específica para os substratos. O melhor entendimento dos mecanismos exatos por trás desse fenômeno pode levar a aplicações terapêuticas otimizadas visando o comportamento metastático de certas células de câncer de próstata em relação tecido ósseo

Citation:. Sariisik E, Docheva D, Padula D, Popov C, Opfer J , Schieker M, et al. (2013) Sondagem das Forças interação de células do cancro da próstata com colágeno I e medula óssea derivados de células-tronco no single level cell. PLoS ONE 8 (3): e57706. doi: 10.1371 /journal.pone.0057706

Autor: Daniel J. Muller, Instituto Federal Suíço de Tecnologia de Zurique, Suíça |

Recebido: 13 Agosto, 2012; Aceito: 28 de janeiro de 2013; Publicação: 05 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Sariisik et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Subvencionado pelo Ministério da Educação nacional da Turquia (https://egitek.meb.gov.tr), Iniciativa de Excelência alemão através do “Nanosystems Iniciativa Munique” (https://www.nano-initiative-munich.de/de/research -areas /) ea Fundação alemã de pesquisa (https://www.dfg.de/gefoerderte_projekte/informationssysteme/index.jsp). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um dos tumores malignos mais comuns e uma das principais causas de morte por câncer entre os homens na Europa. Quase todos os pacientes com câncer avançado de próstata mostram metástase nos ossos, que é muitas vezes o único local detectável da propagação do cancro [1]. Além disso, o cancro da próstata no osso é frequentemente diagnosticado antes da detecção da doença primária e uma vez que as células de cancro da próstata são enxertados no esqueleto, terapia curativa já não é possível o tratamento paliativo e torna-se a única opção [2]. Embora os investigadores estão agora a começar a compreender os mecanismos de crescimento do câncer nos ossos, os passos iniciais de interações tumor de células-a-osso que promovem a expansão do depósito metastático ainda não é totalmente compreendido. Deste modo, existe claramente uma necessidade de elucidar os factores subjacentes à propagação do cancro da próstata em particular ao esqueleto.

Tem sido sugerido que a metástase do cancro no osso é o resultado de uma interacção complexa entre as células de cancro da próstata com o proteínas da matriz óssea e com os tipos de células que residem no tecido ósseo, tais como osteoblastos e osteoclastos [3] – [5]. Nós e outros demonstraram que a linha celular PC3 cancro da próstata, isolada a partir da medula óssea, tem uma adesão significativamente mais elevada para o principal tipo de colagénio proteína óssea I (Cl-I) do que a linha de células de adenocarcinoma da próstata LNCaP que deriva de um não- ósseo metastático local [6], [7]. Estes resultados sugerem que a afinidade de COL-I pode ser um dos factores moleculares que contribuem para a progressão de algumas células de cancro da próstata para dentro do osso.

No que diz respeito aos factores celulares, para além de osteoblastos e osteoclastos, outro intrigante participante que foi recentemente relatada é a população de células que residem na medula óssea, denominadas células estaminais mesenquimais (MSC). MSCs são as primeiras células progenitoras de osteoblastos e que pode ser expandido e diferenciadas em células mesenquimais especializados, tais como os adipócitos, condrócitos, osteoblastos ou in vitro [8]. Cross et al., 2007, sugeriram que as MSCs podem desempenhar um papel importante no apoio ao crescimento e sobrevivência do cancro da próstata no osso [9].

A partir do estabelecimento inicial para a expansão posterior no osso, a próstata células cancerosas exigem capacidade invasiva. Nabha et al., 2008 encontraram que as MSCs estimulada a capacidade invasiva de células PC3 através Col-I por indução da secreção da protease de MMP-12 a partir de células PC3 [10]. Além disso, um artigo recente demonstrou que os fibroblastos mesenquimais podem conduzir a invasão de câncer coletiva, remodelando sua matriz circundante, e, assim, criar espaço físico através do qual as células cancerosas pode simplesmente seguir [11].

Estes dados já sugerem específica cross-talk entre as células e MSCs de câncer de próstata, mas ainda não está claro se e como forte estes dois tipos de células podem interagir e quais poderiam ser os mecanismos por trás dessa interação. moléculas específicas da superfície celular pode mediar as interacções celulares. Tais interacções moleculares foram medidos mecanicamente traçando a força necessária para separar pares receptor-ligando ou de células que interagem com pinças ópticas, a sonda de força biomembrana ou microscopia de força atómica [12] – [14]. Tais experiências não só são capazes de medir eventos moleculares descolamento mas também para sondar a incorporação mecânica e a ancoragem das moléculas medidos nas células [15] – [17]. Assim, o principal objetivo deste estudo foi obter novas perspectivas sobre as interacções das células de câncer de próstata com MSCs com ênfase nas forças mecânicas que ocorrem no nível molecular. Em particular, a quantificação das forças de adesão entre as células do cancro da próstata e a proteína da matriz Col-I parece ser essencial, porque estudos anteriores investigaram a afinidade de células de cancro da próstata para várias proteínas da matriz não determinar a sua força de interacção.

como as células de câncer de próstata, usamos células PC3, que se originaram de metástases da medula óssea e como controles, células LNCaP, que foram isoladas de metástase ganglionar. Como as células estaminais mesenquimais que usamos uma linha celular imortalizada chamado MSC SCP1 [18], que possui as características MSC típicas, tais como a auto-renovação e multipotência e permite a análise normalizada de longo prazo. Nós primeiro visualizou a taxa de adesão e propagação de células de câncer de próstata em monocamadas MSC por microscopia de fluorescência lapso de tempo no nível multicelular. Em seguida, foram caracterizadas as forças físicas reais envolvidos em contactos única célula-para-substrato por microscopia de força com um AFM: tanto as células cancerosas da próstata linhas foram imobilizadas em um braço de suporte de AFM e posto em contacto com um Cl-I substrato revestido. Finalmente, medimos forças adesivas célula-célula entre PC3 ou da próstata LNCaP células cancerosas, ligado a um cantilever AFM, e uma célula-tronco mesenquimal monocamada (SCP1).

Materiais e Métodos

Cultura de células para lapso de tempo Microscopia

PC3 (derivado de metástase óssea) e células LNCaP (derivados de metástase ganglionar) foram obtidas a partir de ATCC (Wesel, Alemanha). células PC3 foram mantidas em meios de cultura de células RPMI-1640 (PAA, Cölbe, Alemanha) e 10% de FBS (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha). A linha celular SCP1 é uma linha de células estaminais mesenquimais humanas imortalizadas totalmente descrito em Böker et ai. 2008 [18]. células LNCaP e SCP1 foram cultivadas em MEM alfa GlutaMAX meios de cultura (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com 10% de FBS. Durante a cultura de células de rotina, todos os tipos de células foram cultivadas até 80% de confluência em T-25 ou T-75 frascos de cultura e mantida a 37 ° C em 5% de CO humidificada

2. O meio de cultura foi mudado três vezes por semana e por passagem em células, as células foram descoladas por tratamento com uma solução de tripsina /EDTA 1x (PAA). A preparação das células antes das medições AFM é descrito abaixo no parágrafo “captura celular”.

Microscopia Time-lapse e quantificação de Adesão Celular

células SCP1 (10

6 células ) foram cultivadas em pratos de 6 cavidades até à confluência completa (como mostrado na Fig. 1C). células PC3 e LNCaP foram marcadas com o corante fluorescente 10 fiM verde CFDA (diacetato de carboxifluoresceína, éster de acetoximetilo, Invitrogen) e depois plaqueadas em monocamadas formadas SCP1 (5 × 10

5 células cancerosas /poço). Logo após, imagens de microscopia foram coletadas com intervalos de 25 minutos durante pelo menos 12 horas. Durante este tempo, as células foram mantidas em um bio-câmara, proporcionando estável de 37 ° C e 5% de atmosfera de CO2 humidificada (Pecon, Erbach, Germnay), montada num microscópio óptico invertido (Axiovert 100, Carl Zeiss Hallbergmoos, Alemanha). As imagens foram tiradas com uma câmara CCD AxioCam MRM (Carl Zeiss) e usando a ferramenta manualmente contador de células de programa Image J version1.40 (National Institute of Health, EUA) o número de células aderentes foi estimado e mostrado como percentagem para a entrada da célula inicial em 4 e 12 horas.

(a) de contraste de fase e microscopia fluorescente de PC3 CFDA-rotulados e células LNCaP semeadas em monocamadas SCP1 em pratos de 6 poços. As imagens são tomadas após 4 h. (B) Quantificação de células PC3 e LNCaP aderentes depois de 4 e 12 h de cultura em monocamadas SCP1. A percentagem de células aderentes foi quantificada pela primeira vez, por contagem manual das células CFDA-rotulados com a ferramenta contador de células no programa Image J e em segundo lugar, por comparação com o número inicial de células plaqueadas (5 × 10

5 células /poço ). Nas imagens também um ligeiro fundo das partículas de corante CFDA é visível (mais aparente na imagem LNCaP). As análises revelaram que já em 4 células h PC3 completamente aderida à SPC1 células, enquanto as células LNCaP teve uma taxa de adesão significativamente mais baixo em 4 h e 12 h. As barras do gráfico mostram ± SD média de quatro experiências independentes (p 0,0001, teste t não emparelhado). (C) do PC e células LNCaP (2 × 10

5 células /poço) foram cultivadas em monocamadas em placas de SCP1 6 poços, durante até 8 dias. imagens de contraste de fase demonstrou a formação e propagação de colónias (PC3 descritas) na parte superior de células SCP1 entre os dias 1 e 8. Em contraste, as células LNCaP formaram pequenos grupos de células (setas) que não se expandir mas regrediram por dia 8. (D) A quantificação do número de PCs e celulares LNCaP depois de 1, 5 e 8 dias de cultivo em monocamadas SCP1. A proliferação de células PC3 e LNCaP foi calculada subtraindo-se as monocamadas de controlo SCP1 a partir da contagem de células totais da co-cultura. Da mesma forma para os dados de microscopia, a análise quantitativa confirmam que as células PC3 mas não LNCaP foram capazes de se dividir e expandir ainda mais em células SCP1. Mostra o gráfico significa ± DP de três experiências independentes para cada ponto de tempo (p 0,0001, teste t não emparelhado).

célula de análise Proliferação

monocamadas SCP1 foram formados como descrito acima e 2 × 10

5 PC3 e LNCaP foram adicionados e deixou-se expandir para SPC1 células por um período de 8 dias. Além disso, vários poços de cultura foram mantidas apenas com células SCP1 (

SCP1

mono

), a fim de ser utilizados como controlos para a análise de quantificação. Os co-culturas (

PC3

+ SCP1, LNCaP

+ SCP1

) foram monitorados microscopicamente e fotografou com a câmera AxioCam MRM (Zeiss). No dia 1, 5 e 8, os co-culturas foram tratadas com tripsina e, utilizando células Neubauer câmara de contagem, o número total de células foi estimado. A proliferação de células PC3 e LNCaP sobre SCP1 monocamada (

PC3

em mono

,

LNCaP

em mono

) foi calculado da seguinte forma:

Imunocitoqu�ica

Antes do revestimento de proteína, lâminas de vidro foram limpas com etanol a 70% e a seguir autoclavadas. A fim de verificar o colágeno tipo I (Col-I) -coating das lâminas de vidro e a expressão I colágeno na SCP1, foram preparadas lâminas e monocamadas SCP1 como segue. SCP1 células foram crescidas em lâminas de vidro, durante dois dias, a fim de formar monocamadas confluentes de células, enquanto que Cl-I – lâminas de vidro revestidas foram preparadas por adição de 1 mg /ml Col-I solução a 4 ° C durante a noite. Em seguida, as monocamadas SCP1 e as lâminas Col-I-revestidos foram fixadas com acetona pura durante 20 minutos a -20 ° C, lavadas com PBS. Imagem-iT sinal fx Enhancer (Invitrogen um produto para a redução de fundo e de intensificação do sinal Alexa Flour anticorpos secundários) foi aplicada durante 30 min e bloqueadas com BSA a 10% durante 1 hora. O anti-colagénio-I anticorpo monoclonal primário de ratinho (Sigma) foi aplicada durante a noite a 4 ° C. Este passo foi seguido de incubação com o anticorpo anti-ratinho secundário conjugado com Alexa Flour 488 durante 1 hora e o corante nuclear DAPI, durante 5 minutos. Em paralelo, controlos negativos foram realizados por omitindo o anticorpo primário. Fotomicrografias foram tiradas com uma câmera Axiocam MRM em um Axioskope 2 microscópio (Carl Zeiss) usando 40x objetiva.

AFM Setup

experimentos Força Espectroscopia foram conduzidos utilizando um NanoWizard II, juntamente com um módulo CellHesion ( JPK Instuments, Berlim, Alemanha), montado num Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss, Goettingen, Alemanha) com uma unidade de temperatura feito sob medida para 37 ° C. Para reduzida influência do ruído ambiente, o Axiovert foi colocada sobre uma mesa de isolamento activa (Micro 60, Halcyonics, Gottingen, Alemanha) contra vibrações e toda a montagem foi colocada em um m

a caixa à prova de som 1 3 também estabilizar a temperatura do toda experiência.

Os sensores de força utilizados para espectroscopia de força foram tipless consolas de nitreto de silício com uma constante da mola nominal de 0,01 N /m (tipless, MLCT-O10, Veeco, EUA). Estes sensores de força com uma constante baixa primavera acabou por ser mais adequado para medições de adesão celular. Em particular, a superfície plana tipless fornece uma área de adesão para uma única célula. Ao cobrir essa superfície com adesivos de células, tais como lectinas (e. G. Concavalin A) ou polímeros carregados positivamente (por exemplo, polilisina) vários tipos de células pode ser firmemente e rapidamente ligada ao sensor de [16], [19], [20]. células de cancro da próstata transformaram a aderir electrostaticamente de forma estável para lisina e, além disso, manter a sua forma esférica ao longo de todo o processo de medição em vez de espalhar como em superfícies revestidas Col-I. Antes da célula experiências de espectroscopia de adesão, os sensores de força, por conseguinte, foram revestidas com poli D-lisina (PDL, Millipore, EUA) numa solução de 100 ug /ml durante a noite PDL. PDL foi usada em vez de PLL, porque é menos degradável e as células não tendem a espalhar. As constantes de os sensores de força de mola foram determinados individualmente pelo método de ruído térmico [21].

curvas força-distância foram registados enquanto o piezo viajou em circuito fechado até 20 uM a uma velocidade de 7 uM abordagem /s até que uma força de disparo de 100pN foi alcançado, e uma velocidade de retração de 3 mm /s.

Preparações de substrato

Temos utilizado colágeno tipo I (Col-I) de vidro -Revestido cobrir deslizamentos e monocamadas SCP1 como substratos para as experiências de espectroscopia de força AFM dentro da mesma tampa do prato de cultura. Para formar monocamadas SCP1, as células foram cultivadas em SCP1 tampas prato de cultura (não tratadas prato Petri de 35 × 10 mm, Nunc A /S, Roskilde, Dinamarca) durante dois dias a 37 ° C, 5% de CO

2. Antes da utilização, elas foram lavadas com e coberto por 1,5 ml fresco meio MEM-alfa isento de soro (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) suplementado com HEPES 15 mM (Sigma-Aldrich, Alemanha), resultando numa

2 medições independentes CO médio. Para células de COL-I lamelas de vidro (O medições 15 mm foram lavadas em 70% de etanol e água destilada) foram revestidas com COL-I (100 ^ g /ml) a 4 ° C durante a noite. Antes das medições de adesão celular, as lamelas Col-I-revestidas foram colocadas em cima da monocamada SCP1 nas tampas prato de cultura (tal como representado na Fig. 2B). Uma lamela de cobertura de vidro adicional revestidos com BSA (0,5% w /v) a 4 ° C durante a noite foi colocada em cima da outra secção da monocamada SCP1 e foi utilizado para a captura de células (ver a próxima secção). A tampa prato de cultura, contendo todos os três tipos de substratos (BSA, Col-I e SCP-1 monocamada) foi, em seguida, montado sobre um estágio de temperatura controlada na AFM e foi deixado a equilibrar durante 10 min em ar ambiente a 37 ° C.

(a), imagens de contraste de fase de uma célula de cancro da próstata ligado ao braço de suporte (setas) acima de uma monocamada SCP1 (esquerda) e uma lâmina de Col-I-revestido (à direita). As barras de escala indicam 10 um. Nos cantos inferior esquerdo são inseridas imagens de imunofluorescência. Col-I, marcadas com corante fluorescente AlexaFluor488 aparece em núcleos verdes e celulares, corados com DAPI em azul. (B) As células individuais a partir de duas linhas celulares de cancro da próstata diferentes (PC3 e LNCaP) foram imobilizados para um tipless AFM cantilever (sensor de força), a fim de estudar as suas forças de interacção com a superfície apical de uma monocamada SCP-1 (representando as células estaminais mesenquimais ) ou com o Col-I (representando matriz óssea). (C) vista de topo esquemática da tampa prato de cultura com uma lamela de cobertura de vidro de BSA-revestido (como substrato para pescar um suavemente injectado de células de cancro da próstata) e um eu Col-tampa de vidro revestido deslizar tanto no topo de uma monocamada de células estaminais mesenquimais . Para a calibração e pesca uma célula, o sensor de força visita o slide BSA, para o experimento sobre o colágeno o Col-I deslizar e para o experimento em células mesenquimais a monocamada SCP1.

Cultura celular e celular captura Força para espectroscopia

células LNCaP (PC3) ou cultivadas para 80% de confluência foram incubadas em solução de tripsina /EDTA (0,02%) durante 5 min a 10 min, até que libertado do substrato após a lavagem com PBS sem cálcio e magnésio . Este procedimento deve remover todas as proteínas da matriz, possivelmente, cobrindo as superfícies das células sem afetar os receptores de integrina [22], [23]. Em seguida, as células foram transferidas com meio MEM-alfa adicional num tubo de centrifugação. As células foram, então, centrifugadas (1000 rpm, 3 min) antes da ressuspensão do sedimento com meio MEM-alfa fresco. As células foram deixadas num incubador a 37 ° C durante 15 min., De modo a adaptá-los para a temperatura de medição de 37 ° C na AFM.

a utilização de células LNCaP (PC3 ou aprox. 2 μ

contendo 100 a 300 células L) foram então suavemente injectado na lamela de cobertura não-adesiva de BSA-revestidos, a fim de capturar subsequentemente um deles com o adesivo cantilever PDL-revestido: a cantilever adesivo foi posicionado sobre um dos as células saudáveis, obviamente, (tamanho médio, redondos em contraste normal, sem bolhas, há outras indicações anormais em forma) sobre a lamela BSA-revestido, e baixou de uma forma gradual, até que foi perto da superfície da célula. Em seguida, o cantilever foi gentilmente em contato manteve com o celular por alguns segundos antes que a célula-bound cantilever foi levantada verticalmente em cerca de 100 mm [24]. A célula foi autorizado a estabelecer adesão firme sobre o cantilever para um par de minutos. Algumas células (aprox. 10%) se recusaram a aderir firmemente à alavanca em vez soltos, conforme determinado agitando o microscópio e observar o movimento de células com a agitação induzida. Neste caso, a célula foi lavada fora do raio de acção, levantando-o para fora do líquido e de volta novamente, de modo a capturar uma nova célula. No caso da adesão firme, foi utilizada a célula de adesão para as experiências e monitorizada pelo experimentador através da imagem de microscópio de luz durante todo o período de medições.

A adesão celular As medições da força

A célula imobilizada sobre o sensor de força foi empurrado contra quer a monocamada ou a corrediça SCP1 Col-I-revestido com uma força de contacto de 100 pN. O tempo de contacto entre a célula e o seu substrato sonda foi definido como 0s resultando num contacto forçado de forma eficaz 0,3 s, a fim de limitar as taxas percentuais de adesão (de curvas com eventos de adesão) para uma gama tão baixa quanto possível. taxas de adesão inferiores a 30% proporcionar uma alta probabilidade de detecção de interacções moleculares simples [24]. Em taxas de adesão mais elevados passos unbinding individuais tendem a resultar de múltiplas ligações moleculares que atuam em paralelo. Para quantificar as diferenças entre linhagens de células e superfícies, foi aplicado este tempo de contato curto e baixa força de contato de 100pN em todo o experimentos. A velocidade de retracção foi ajustado para 3? M /s como um compromisso entre a resistência hidrodinâmica, que aumenta com a velocidade (aqui em cerca de 5 PN) e os efeitos de deriva térmicas que diminuem com a velocidade. A distância de retracção foi ajustado para 20 ^ M para ter em conta amarras longas (Fig. 2A) e para assegurar a célula tinha separado do substrato completamente depois de cada ciclo. medidas de força sobre a monocamada SCP1 e Col-I foram realizados dentro da mesma placa de cultura, enquanto que para cada célula imobilizada em um cantilever um novo prato foi preparado. Isto resultou em duas experiências por placa de cultura: ou uma célula de LNCaP em cantilever contra o vidro Col-I-revestido e subsequentemente contra a área de superfície apical da monocamada SCP1 ou uma célula PC3 em cantilever contra Col-I e em seguida, comparada SCP1 monocamada (Fig. 2B). A ordem dos substratos foi também invertida dentro dos experimentos PC3, que mostra resultados idênticos. Em cada experiência (sondagem um tipo de célula para um tipo de substrato), pelo menos, 80 curvas força foram tomadas entre uma célula em cantilever e um tipo de substrato. No total, pelo menos 10 experimentos independentes para cada combinação de interações-substrato celular (LNCaP vs. Col-I; LNCaP vs. SCP1; PC3 vs. Col-I; PC3 vs. SCP1) foram realizadas, produzindo pelo menos 800 curvas força por classe de interação. Durante toda a experiência, foi utilizado um microscópio óptico para controlar a forma esférica e a fixação firme da célula imobilizada para o sensor de força PDL-revestidos (Fig. 2A). Além disso, provou por contactos celulares prolongados de 1 min a 500 PN a COL-I, que a célula imobilizada para o sensor de força pode sustentar forças de adesão de, pelo menos, 8,5 nN, sem desmontar a partir do sensor.

Força de Adesão Celular avaliação

Para análise dos dados apenas as partes retração dos ciclos de aproximação de retracção foram avaliados. A fim de obter informação quantitativa característica das curvas força-distância, uma avaliação e detecção etapa software de dados de design personalizado [25] foi usado para DeNoise o sinal (linhas pretas na Fig. 3), encontrar a linha de base (linhas tracejadas na Fig . 3), correta para arrasto hidrodinâmico e eventual deriva e para extrair os seguintes parâmetros:

o ponto de dados menor à esquerda marca o esforço de contacto de 100 pN; a linha a tracejado representa a linha de base branco que intersecta a curva de retorno no círculo preto que define a superfície da célula; a linha preta é o sinal propalado-de e as cruzes vermelhas indicam detectado etapas de-adesão em que a avaliação força de adesão ocorre. A curva (a) da força a partir de uma célula interagir com PC3 Col-I para ilustrar a avaliação força de adesão: A seta vermelha # 1: altura passo do primeiro evento de-adesão na curva de retracção. A força de descolamento é a medida absoluta da Cruz Vermelha até a linha de base; # 2: a altura dos degraus do segundo evento de-adesão depois de um patamar de força de 0,9 mm de comprimento; # 3: posição de passo do primeiro evento de aderência; # 4: Posição passo do segundo evento de-adesão. (Para definições, ver adesão celular Avaliação Força na secção Materiais e Métodos). Curvas características de cada um dos quatro tipos diferentes de experiências estão representados: (B) PC3 em Cl-I, (C) PC3 em SCP1 monocamada, (D) de LNCaP em Cl-I e LNCaP (E) na SCP1 monocamada

altura dos degraus [pN] descrevendo a diferença de força medidos antes e depois de um evento descolamento indivíduo, visível como um passo vigor. O algoritmo identifica um tal passo a maxima no derivado do sinal denoised que ultrapassar um determinado limiar e marca-lo por uma pequena cruz vermelha (cf. também Fig. 3). O último passo em uma curva de força é o mais fiável, uma vez em contraste com todos os outros (intermediário) passos nenhuma outra ligação entre células e substrato persistir. Por conseguinte, o último passo não é potencialmente reduzida por outras ligações que existem em paralelo.

taxa de adesão [%] que descreve a fracção de curvas com, pelo menos, um passo força detectada.

número de passos a descrever número médio de passos detectados por curva (contando apenas curvas com pelo menos um detectados patamar de força).

posição passo [mm] descrevendo a distância entre o ponto de contacto (círculo preto no cruzamento da linha de base e curva de retorno) e um passo vigor.

trabalho de descolamento [aJ] descrevendo a energia dissipada durante esse experimento vigor, integrando a área entre baseline (força zero) e retrair curva. (Nota:. Isso não tem relação trivial para a energia de adesão Na verdade, a velocidade depende deformação viscosa e plástico da célula e da membrana celular em si contribuem fortemente para o trabalho de desapego longe do equilíbrio termodinâmico).

força de desprendimento [pN] descrevendo o maior valor medido da adesão (máximo global) por curva.

posição de pico [nm] descrevendo a distância entre o ponto de contacto e onde foi detectada a força de adesão desapego.

Todas as forças medida são forças relativas e, portanto, independente da força constante deslocamento (de 5PN) devido ao arrasto hidrodinâmico do sensor de força que viajam à velocidade constante de 3 mm /s.

passos

planalto, para este conjunto de dados aparecem depois um patamar de força de pelo menos 500 nm de comprimento em taxas de carregamento de menos de 2.7pN /s (veja a etapa 2 na Fig. 3A).

em taxas de carga entre 2,7 e 4,0 pN /s o critério não era suficientemente claro para evitar passo em falso discriminação positiva ou negativa.

degraus íngremes, consequentemente, ocorrer após um aumento na força de pelo menos 4,0 pN /s.

Semi-quantitativa Polymerase Chain Reaction (PCR)

O PCR semi-quantitativo foi realizado como descrito em Popov et ai, 2011 [26]. Resumidamente, ARN total foi extraído a partir de células LNCaP e PC3 com RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) e 1 ug de ARN foi utilizado para síntese de ADNc com o kit de AMV da primeira cadeia de síntese de ADNc (Invitrogen). PCR para a integrina α1, α2, β1 e GAPDH (utilizada para normalizar a entrada de ADNc) foi realizada com a Taq ADN polimerase (Invitrogen) num instrumento MGResearch (BioRad, Munique, Alemanha). As sequências dos iniciadores e condições de PCR são descritas em Popov et al, 2011. Todos os resultados de PCR foram reproduzidos três vezes de forma independente.

Análise Estatística

Para ter em conta os conjuntos de dados heterogêneas duas análises estatísticas foram aplicados:

em primeiro lugar, foi utilizado um teste t de Student assumindo variâncias desiguais para analisar a taxa de adesão, o número médio de passos ou a fração de corda semelhante aos passos filopódios-like comparando os meios recolhidos a partir de células individuais entre PC3 e células LNCaP. Cada média de uma célula é marcada como uma cruz vermelha; a média destes meios é indicada como a barra com o erro de média na fig. 4 A B e A Fig. 5. Em segundo lugar, foi aplicado um teste de Kolmogorov-Smirnov não paramétrico, sem hipóteses para comparar a altura dos degraus, a posição da etapa, força de desprendimento e trabalho de desprendimento de todas as curvas força entre PC3 e células LNCaP. As medianas são indicados como bares com quartis. Cada mediana de uma célula é representada por uma cruz vermelha na Fig. 4 C e D. Resultados com um valor-p menor do que 0,05 são marcados como significativo por um asterisco.

(A) Percentagens de curvas força com pelo menos um evento de-adesão. (B) Número de eventos de-adesão dentro de uma curva de adesivo. As barras de erro correspondem ao erro padrão da média. Um valor p significativo a partir de um teste t não emparelhado dos dados PC3 com respeito aos dados de LNCaP é marcado por * (P 0,05). A média de cada célula individual é dada por uma cruz vermelha. (C) As medianas da altura das etapas de-adesão individuais. (D) as medianas da posição destes eventos de adesão-DE. (E) As medianas da força de descolamento. (F) medianas do trabalho de desapego. Quartis são indicados por bandeiras duplas e a mediana de cada célula individual é dada por uma cruz vermelha. dados de força de adesão celular foram adquiridos a partir de 16 PC3 ou 10 células LNCaP que interagem com Col-I (1485 e 760 curvas força respectivamente), e 17 PC3 ou 11 células LNCaP interagindo com monocamadas SCP1 (1526 e 878 curvas força respectivamente).

Meios de o percentual de etapas de-adesão individuais que representam o padrão de força típica de passos filopódios-like (sólidas) e passos amarrar-like (listrado) para o PC3 duas linhas de células e LNCaP. Cada média de uma célula é representada por uma cruz vermelha. As barras de erro correspondem ao erro padrão da média. A p-valor significativo a partir de um t-teste entre os diferentes passos dentro de uma linha de células de carcinoma da próstata é indicado por * (p 0,05).

Resultados

PC3 e LNCaP Adesão e proliferação em co-cultura com SCP1

aderência primeira célula foi analisada por meio de imagens de lapso de tempo de até 12 horas. PC3 CFDA pré-marcado e células LNCaP foram monitorizados numa monocamada SCP1 e, após 4 horas, a maioria das células PC3 pareceu espalhar sobre a monocamada SCP1 enquanto as células LNCaP apareceram pequenos e redondos (Fig. 1A). Como mostrado na Fig. S1, as células PC3 cultivadas em vidro ou vidro-Col I-revestidos têm um factor de forma de planeza inferior em comparação com células LNCaP, indicando uma maior capacidade de se espalhar. No entanto, análise da forma de ambos os tipos celulares cultivadas em monocamadas SCP1 não foram realizados, devido ao risco de medições inexactas de área, diâmetro e volume devido aos corpos celulares subjacentes das células SCP1. Além disso, através da realização de análise quantitativa em 4 e 12 h, poderíamos mostrar que aprox. 90% das células PC3 foram capazes de aderir ao monocamada SCP1 já após 4 h, e que a sua adesão também permaneceu cerca de 90% após 12 h (Fig. 1B). Em contraste, as células LNCaP tiveram menor adesão ao SCP1 (aprox. 25%), que não aumentou significativamente depois de mais tempo de cultivo.

De modo a investigar PC3 e proliferação de células de LNCaP em monocamadas SCP1, foi realizada co- experimentos de cultura para até 8 dias. microscopia de contraste de fase, no Dia 1 e 8 demonstraram a formação e propagação de colónias PC3 em cima dos SCP1cells, enquanto que as células LNCaP formado aglomerados de células pequenas, o que não se expandem mas regrediram durante este período (Fig. 1C).

FIG. FIG.