da arte abstracta

Fundo e Objectivos

Este estudo foi desenhado para identificar e validar assinaturas genéticas que podem prever a sobrevida livre de doença (DFS) em pacientes submetidos a ressecção radical por suas metástases hepáticas colorretais (CRLM).

Métodos

perfis de expressão genética do tumor foram coletados de 119 pacientes submetidos a cirurgia para sua CRLM em o Brousse Hospital Paul (França) e do University Medical Center Utrecht (Holanda). Os pacientes foram divididos em grupos de alto e baixo risco. Um conjunto de treinamento selecionados aleatoriamente foi utilizado para encontrar assinaturas genéticas preditivas. A capacidade das referidas assinaturas de genes para prever DFS foi testada num conjunto de validação independente compreendendo os pacientes restantes. Além disso, 5 pontos de risco clínicos conhecidos foram testados em nossa coorte completa paciente.

Resultado

Sem assinatura gene foi encontrado que predisseram significativamente DFS no conjunto de validação. Em contrapartida, três dos cinco escores de risco clínicos foram capazes de prever DFS em nosso grupo de pacientes.

Conclusões

Sem assinatura gene foi encontrado que pudesse prever DFS em pacientes submetidos à ressecção CRLM. Três dos cinco escores de risco clínicos foram capazes de prever DFS em nosso grupo de pacientes. Estes resultados enfatizam a necessidade de validar os escores de risco em grupos de doentes independentes e sugerir designs melhorados para futuros estudos

Citation:. Snoeren N, van Hooff SR, Adam R, van Hillegersberg R, Voest EE, Guettier C, et ai. (2012) Explorando Assinaturas Expressão genética para prever Sobrevivência livre de doença após a ressecção de câncer de fígado metástases colorretais. PLoS ONE 7 (11): e49442. doi: 10.1371 /journal.pone.0049442

editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de maio de 2012; Aceito: 07 de outubro de 2012; Publicação: 21 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Snoeren et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção holandês Cancer Society 2007-3923. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é o terceiro tipo de câncer mais comum em homens ea segunda em mulheres em todo o mundo, sendo responsável por aproximadamente 608,000 mortes em todo o mundo [1]. O fígado é o local mais comum e muitas vezes apenas de doença metastática. O desenvolvimento de metástases hepáticas em cerca de 50% dos pacientes é o principal determinante da sobrevida em pacientes com câncer colorretal. A ressecção cirúrgica é a melhor opção de tratamento para pacientes com metástase hepática colorectal que oferecem uma sobrevida média de mais de 40 meses após a ressecção em comparação com uma sobrevida média de 18 meses quando tratados com quimioterapia e 6 a 12 meses se os doentes permanecem sem tratamento [2]. Infelizmente, 60% -80% dos doentes vão desenvolver recorrências locais distantes ou após ressecção R0 de metástases do fígado colorrectal [2] – [5]. Os pacientes com recorrência são susceptíveis de beneficiar de quimioterapia adjuvante. Contudo, 20-40% dos doentes não desenvolvem recorrência e provavelmente melhor ser deixada sem tratamento após a ressecção hepática. Desde a quimioterapia está associada com morbidade e mortalidade grave, o risco associado a terapia deve, portanto, ser justificada por uma melhora significativa na sobrevida desses pacientes.

Muitos grupos de pesquisa tentaram definir os fatores preditores de sobrevida livre de doença e sobrevida global (OS) após a ressecção de metástases hepáticas [5], [6]. Recentemente, cinco escores de risco clínicos publicados, combinando fatores clínicos diferentes, foram validadas em uma coorte de pacientes independente demonstrando que dois escores de risco clínicos foram capazes de prever a sobrevida global em um conjunto independente de pacientes [7]. Previsão de sobrevivência (livre de doença) pode ser melhorado através da utilização da expressão do gene que pode capturar propriedades tumorais não reflectidas pelas variáveis ​​clinicopatológicas.

Genoma ampla perfil de expressão de genes tem sido utilizada para prever o resultado da doença ou resposta à terapia em muitos tipos de tumores diferentes [8], [9] também tem sido demonstrado que o perfil de expressão pode ser utilizado para identificar tumores colo-rectais com diferente agressividade e potencial metastático [10] – [13]. Nenhum estudo, no entanto, foi publicada em que a expressão do gene foi utilizado para prever a sobrevivência livre de doença após a ressecção de metástases hepáticas colorrectal. Identificação de uma assinatura gênica capaz de identificar metástases hepáticas colorretais recorrência propenso no momento da ressecção abriria o caminho para a seleção de pacientes que são susceptíveis de beneficiar de uma terapia agressiva após a ressecção, enquanto retendo outros tratamentos desnecessários.

Resultados

pacientes e amostras de tumor

Cem quarenta e oito pacientes preencheram a expressão critérios de exclusão dentro e. Perfis foram obtidos com sucesso para 119 pacientes. As características de linha de base de 119 doentes incluídos, apresentados na Tabela 1, não diferiu significativamente entre o alto em relação grupo de baixo risco, com a excepção de a administração da quimioterapia. Pacientes de alto risco receberam quimioterapia neoadjuvante com mais frequência e quimioterapia adjuvante com menos frequência do que os pacientes de baixo risco. As amostras dos pacientes tinha uma percentagem de células tumorais média de 45% (IC 95% 40,75-49,60), necrose de 19% (IC 95% 16,19-22,47) e fibrose 20% (IC 95% 16,44-22,71). A média de acompanhamento foi de 26,7 meses. Uma comparação entre as características de linha de base de 119 a 29 incluídos e excluídos pacientes está apresentada na Tabela S1.

Os pacientes são divididos em um alto e um grupo de baixo risco de predição com base na previsão de risco de as assinaturas diferentes genes. assinaturas de genes foram descobertos definir alto risco como DFS ≤1 ano e de baixo risco como DFS 1 ano salvo indicação em contrário. A taxa de risco da previsão gene assinatura é mostrado com o intervalo de confiança de 95% entre parênteses. O valor p do teste de log-rank também é mostrado, com o valor p ajustado para múltiplos testes entre parênteses. A: As curvas de sobrevida para pacientes em conjunto de treinamento. gene assinatura foi descoberto usando o mesmo conjunto de treinamento. B: As curvas de sobrevida para os pacientes no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando o conjunto de treinamento completo. C: As curvas de sobrevida para os pacientes no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando o conjunto de treinamento completo que define alto risco como DFS ≤6 meses e baixo risco, conforme DFS 2 anos. D: As curvas de sobrevida para os pacientes UMC Utrecht no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando o subconjunto UMC Utrecht do conjunto de treinamento. E: As curvas de sobrevida para os pacientes Paul Brousse no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando o subconjunto Paul Brousse do conjunto de treinamento. F:. E como, mas incluindo apenas os pacientes Paul Brousse que receberam quimioterapia neoadjuvante (formação e conjunto de validação)

configuração original do estudo: Modelo supervisionado dividindo pacientes com DFS ≤1 ano contra pacientes com DFS 1 ano. A assinatura gene foi descoberto usando o conjunto de treinamento e, posteriormente testado no conjunto de validação independente. B: semelhante a um, usando um modelo supervisionado dividindo pacientes com DFS ≤6 meses versus doentes com DFS 2 anos. C: semelhante a um, incluindo somente pacientes tratados em Paul Brousse. D: Semelhante ao A, incluindo somente pacientes tratados em UMC Utrecht. E:. Semelhante a um, incluindo somente pacientes tratados em Paul Brousse tratados com quimioterapia neoadjuvante

Gene Expression Assinatura

Usando o conjunto de treinamento de 75 pacientes de ambos os centros, um gene assinatura foi descoberto que consiste em 20 genes (Tabela S2). Este foi o assinatura gene mais preditiva como medido no conjunto de treino, capaz de prever a sobrevivência livre de doença com elevada significância estatística (Figura 1A). Quando utilizado para prever o risco para os pacientes no conjunto de validação independente de 44 pacientes, no entanto, este gene assinatura foi incapaz de prever DFS significativamente (Figura 1B). Isto aponta para overfitting nos pacientes conjunto de treino, um fato sublinhada pela área sob a curva (AUC) de 0,508 (IC 95% 0,482-0,534) alcançada durante o assinatura descoberta (ver Métodos). O poder do teste log-rank usado é mostrado na Figura S1. Uma análise para encontrar o enriquecimento funcional para os 20 genes na assinatura não conseguiu encontrar qualquer enriquecimento significativo. Tendo falhado em encontrar um gene assinatura preditiva, examinamos se uma definição mais rigorosa dos grupos de alto e baixo risco resultaria em um gene assinatura melhor dividindo-se o conjunto de treinamento em um grupo de alto risco dos pacientes com um DFS menos de 6 meses e uma grupo de risco baixo com um DFS de pelo menos 2 anos (Figura 2B). Embora os resultados de validação deste gene assinatura parecia mostrar uma tendência positiva também não atingiu significância (Figura 1C).

Os pacientes são divididos em um alto e um grupo de previsão de baixo risco com base na previsão de risco da assinaturas diferentes genes. assinaturas de genes foram descobertos definir alto risco como DFS ≤1 ano e de baixo risco como DFS 1 ano salvo indicação em contrário. Em toda a formação define a proporção de pacientes tratados com quimioterapia neoadjuvante para pacientes não tratados no grupo de alto e baixo risco foi mantido tão iguais quanto possível para impedir qualquer distorção do tratamento. A taxa de risco da previsão gene assinatura é mostrado com o intervalo de confiança de 95% entre parênteses. O valor p do teste de log-rank também é mostrado, com o valor p ajustado para múltiplos testes entre parênteses. A: As curvas de sobrevida para os pacientes no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando o conjunto de treinamento integral controlado para o viés de tratamento neoadjuvante. B: As curvas de sobrevida para os pacientes no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando o conjunto de treinamento completo que define alto risco como DFS ≤6 meses e baixo risco, conforme DFS 2 anos e controlar o viés tratamento neoadjuvante. C: As curvas de sobrevida para os pacientes UMC Utrecht no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando o subconjunto UMC Utrecht do conjunto de treinamento controlado para o viés de tratamento neoadjuvante. D: As curvas de sobrevida para os pacientes Paul Brousse no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando o subconjunto Paul Brousse do conjunto de treinamento controlado para o viés de tratamento neoadjuvante.

Os pacientes são divididos em um alto e um grupo de previsão de baixo risco com base na previsão de risco do gene diferente assinaturas. assinaturas de genes foram descobertos definir alto risco como DFS ≤1 ano e de baixo risco como DFS 1 ano salvo indicação em contrário. Ambos os conjuntos de treinamento e validação foram separados em neoadjuvante tratado e pacientes não tratados. Os resultados são apresentados apenas quando os conjuntos de treinamento contido pacientes de alto e baixo risco suficientes para fazer a descoberta de assinatura possível. A taxa de risco da previsão gene assinatura é mostrado com o intervalo de confiança de 95% entre parênteses. O valor p do teste de log-rank também é mostrado, com o valor p ajustado para múltiplos testes entre parênteses. A: As curvas de sobrevida para os pacientes no conjunto de validação. assinaturas de genes foram descobertos usando o conjunto de treinamento completo estratificada por tratamento neoadjuvante. B: As curvas de sobrevida para pacientes não tratados UMC Utrecht no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando pacientes UMC Utrecht não tratados no conjunto de treinamento. C: As curvas de sobrevida para neoadjuvante pacientes tratados com Paul Brousse no conjunto de validação. assinatura gene foi descoberto usando neoadjuvante pacientes tratados com Paul Brousse do conjunto de treinamento.

Alguns dos fatores clinicopatológicos diferiu significativamente entre os pacientes do Hospital Brousse Paulo e do Centro Médico da Universidade de Utrecht ( tabela S3). Para explorar a possibilidade de que a falha anterior para encontrar um gene assinatura preditiva pode ter sido causada por estas diferenças, a descoberta gene assinatura foi repetido para as amostras UMC Utrecht e as amostras Paul Brousse separadamente. A assinatura gene derivado dos dados UMC Utrecht sozinho não exerce qualquer poder preditivo quando validado (Figura 1D). Validação da assinatura gene Paul Brousse, no entanto, mostrou uma tendência positiva (Figura 1E). O resultado de uma regressão de Cox multivariada, no entanto, sugere que o gene assinatura não é um factor de previsão independente (Tabela 2). Estágio do tumor primário e a administração de quimioterapia neoadjuvante parecia suficiente para predizer DFS dentro do conjunto de validação. É possível que a quimioterapia neoadjuvante, o qual é administrado antes da recolha da amostra, tinha um efeito sobre o padrão de expressão do gene e, portanto, era um factor que interfere na montagem experimental. Isto é confirmado pela ausência de poder preditivo quando a descoberta de assinatura foi realizada exclusivamente em pacientes Paul Brousse, que não receberam quimioterapia neoadjuvante (Figura 1F). Além disso, uma análise dos genes diferencialmente expressos entre os pacientes tratados com quimioterapia neoadjuvante e pacientes não tratados revelou 875 genes que foram significativamente para cima ou regulados negativamente (Tabela S4), sugerindo que a quimioterapia neoadjuvante induz uma mudança considerável na expressão do gene medido. Para investigar se a ausência de uma assinatura preditiva foi causado pelo viés tratamento neoadjuvante no grupo de alto risco a descoberta de assinatura foi repetido utilizando conjuntos de treinamento foram este viés foi removido (Figura 3), bem como analisando o neoadjuvante tratados e não tratados pacientes separadamente ( A Figura 4). Os resultados sugerem fortemente que a ausência de uma assinatura preditiva é independente dos efeitos de tratamento neoadjuvante, adicionando a ressalva de que, em algumas destas comparações do tamanho da amostra é baixa. Tabela S5 mostra o desempenho preditivo de todas as assinaturas de genes descritos acima, quando usado para prever DFS redefinida como uma variável dicotômica.

As curvas de sobrevida com base em todos os 119 pacientes em uso de preditores clínicos conhecidos. A taxa de risco do preditor de risco clínico é mostrado com o intervalo de confiança de 95% entre parênteses. O valor p do teste de log-rank também é mostrado, com o valor p ajustado para múltiplos testes entre parênteses. A: Iwatsuki (alta ≥3 risco, baixo risco 3). B: Basingstoke (alto risco ≥10, baixo risco 10). C: Fong (alto risco ≥3, baixo risco 3). D: Mayo (alto risco ≥2 baixo risco 2). E: Nordlinger (alto risco ≥4, baixo risco 4)

Validação de escalas de risco clínico

Os resultados da análise de sobrevivência univariadas para todos os fatores clínico-patológicos estão representados na Tabela 3. . em um modelo de regressão de Cox multivariada, contendo os fatores que apresentaram valores de p inferior a 0,1 na análise univariável, maior estágio do tumor primário (p = 0,006, HR = 1,444, IC 95% = 1,110-1,877), maior ressecção ( p = 0,005, HR = 2,190, IC 95% = 1,268-3,784), o número de metástases hepáticas (p = 0,031, HR = 1,142, IC 95% = 1,012-1,289) e a administração de quimioterapia adjuvante (p 0,001, HR = 0,382, IC = 0,237-0,617) 95% foram consideradas fatores de risco independentes para pobres DFS.

Todos os itens dos escores de risco clínicos foram documentados exceto para o estado dos gânglios linfáticos hepatoduodenal, o que fez impossível para o escore de risco de Zakaria ser maior do que 2. Porque nós não incluiu pacientes com doença extra-hepática neste estudo, o escore de risco Basingstoke não estava completa. Três em cada cinco pontuações de risco clínico previsto DFS com precisão em nossos pacientes, incluindo os escores de risco Basingstoke, Fong e Nordlinger (Tabela 3). Destes, a pontuação por Fong teve o melhor desempenho. As curvas de Kaplan Meier para alto e baixo risco previsto pacientes, com base nos diferentes escores clínicos, estão representados na Figura 5.

Discussão

Este estudo foi desenhado para identificar e validar um classificador com base expressão gênica que prevê DFS. Infelizmente, não fomos capazes de encontrar uma assinatura gene que poderia prever significativamente DFS em um conjunto de validação independente. Uma assinatura gene desenvolvido usando apenas Paul Brousse amostras dos pacientes mostrou uma tendência positiva em cima de validação. No entanto, em um modelo de regressão multivariada de Cox, a assinatura não provar ser um fator independente para DFS. Em vez de reflectir a biologia do tumor, a assinatura do gene pareceu ser influenciada por um viés de administração antes da quimioterapia, uma possibilidade que deverá ser tido em conta na condução de estudos futuros. Esta opinião foi reforçada tanto pela ausência de poder de previsão em um gene assinatura projetado em um subconjunto incluindo apenas pacientes Paul Brousse submetidos a quimioterapia neoadjuvante, bem como uma análise da expressão gênica diferencial entre os pacientes tratados com quimioterapia neoadjuvante e os pacientes não tratados que mostrou 875 genes diferencialmente expresso. Para excluir que a ausência de um gene assinatura preditiva foi causado pela polarização tratamento neoadjuvante no grupo de doentes de alto risco, a descoberta assinatura foi repetido utilizando conjuntos de treino eram o viés neoadjuvante foi removida, bem como analisando tratada a neoadjuvante e os pacientes não tratados separadamente . Semelhante aos resultados anteriores deste estudo as assinaturas genéticas resultantes não foram preditivos de DFS no conjunto de validação, indicando que a super-representação de tratamento neoadjuvante no grupo de pacientes de alto risco não explica a falta de resultados positivos.

Nós também testado cinco escores de risco clínicos conhecidos e descobriu que Basingstoke, Fong e Nordlinger predisseram significativamente DFS em nosso grupo de pacientes. O fato de que três dos cinco contagens foram preditivos é notável dado o fato de que esses escores de risco clínicos (CRS) foram desenvolvidos em uma época onde a quimioterapia uso em CRC primária era raro [14] – [18]. Os mesmos cinco escores de risco clínicos foram recentemente validado por Reissfelder e colegas. Eles descobriram que as pontuações Fong e Iwatsuki foram capazes de prever a sobrevida específica da doença em seus pacientes, mas não Nordlinger eo índice de Basingstoke [7]. É notável que apenas a pontuação Fong foi preditiva em ambos os estudos. A correlação não-significativa da pontuação Iwatsuki com DFS pode ser devido ao fato de que a maior pontuação não pôde ser calculado, uma vez que não registrar o status dos linfonodos hepatoduodenal. A questão permanece: por que nós não encontrou uma assinatura prevendo DFS após a ressecção de metástases hepáticas colorretais? Dificuldades em prever a sobrevida (livre de doença) com perfil de expressão gênica foram relatados recentemente. Lauss et al avaliou o desempenho de 8 assinaturas genéticas publicadas na previsão de recorrência do câncer de bexiga dos quais nenhum sobreviveu a validação [19]. Uma revisão avaliar assinaturas genéticas desenvolvidas para predizer a sobrevida no câncer de pulmão em 16 estudos foram todos considerados inadequados para o uso na prática clínica por causa da falta ou validação insuficiente. Nestes estudos, quer a assinatura não superar fatores clínicos ou os autores não abordou a influência de qualquer um dos fatores clínicos [20].

Acreditamos que o design do nosso estudo era de qualidade suficiente para poderá encontrar um gene assinatura para prever DFS. No entanto, não pode ser excluído que um gene assinatura utilizável existe, mas não foi encontrado devido a factores limitantes no nosso estudo. Estes factores potenciais incluem a definição de pacientes de alto e baixo risco na descoberta de assinatura, o número de pacientes incluídos no estudo, especialmente à luz da heterogeneidade do grupo de doentes, a inclusão de doentes a partir de apenas dois centros médicos, a existência de um efeito do tratamento prévio e limites para a sensibilidade dos microarrays.

as metástases hepáticas são, pela sua natureza inclinado para um subgrupo mais agressiva da CRC. Por conseguinte, poderia ser especulado que os padrões de expressão de genes que caracterizam rapidamente recorrentes metástases hepáticas são muito sutis para ser descoberto usando o tamanho da amostra utilizada neste estudo. Além disso, a recorrência após ressecção de metástases do fígado pode não ser dependente das características da própria metástases do fígado, mas na presença de micrometástases no momento da ressecção hepática.

Embora não possamos excluir a existência de um gene preditivo assinatura, não há benefícios adicionais de assinaturas de expressão do gene para a predição da sobrevivência livre de doença em doenças colo-rectal metastático poderia ser estabelecida com base nos resultados deste estudo. Finalmente, o escore de risco clínico Fong, já validado por Reissfelder et [7] al, é o escore de risco mais poderosa para a previsão de DFS de pacientes com CRLM ressecado dos cinco escores de risco testados em nosso estudo. Esta pontuação de risco clínico deve ser usado para a estratificação em estudos clínicos prospectivos que examinam o possível benefício de terapias adjuvantes em pacientes submetidos à cirurgia para CRLM.

Materiais e Métodos

Amostras de Pacientes

amostras de tumores congelados de 148 pacientes foram obtidos no Hospital Brousse Paulo em Villejuif, França e UMC Utrecht, na Holanda, entre Novembro de 2000 e agosto de 2010. o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética médica (MEC) do University Medical Center Utrecht como reconhecido pelo artigo 16 da OMM (lei holandesa sobre a investigação médica com seres humanos). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. As amostras foram incluídos de pacientes com 18 anos ou mais submetidos à ressecção curativa para confirmação histológica metástases hepáticas de CRC. Foram excluídos os pacientes com história de doença maligna não-colorretal, doença extra-hepática ou doença residual macroscópica (R2) após a cirurgia. Os doentes que receberam a terapia ablativa local ou quimioembolização sozinho ou em combinação com ressecção foram excluídos. Apenas foram incluídas amostras que foram rapidamente congelados em azoto líquido dentro de 30 minutos após a ressecção e foram armazenados em -80 ° C. A quantidade de estroma, de tumor, as células de fígado benignos e necrose foi determinada por dois patologistas estudo (C.G e P.J.vD). Nos doentes em que as amostras continham tecido de fígado benigno ou células tumorais insuficientes foram excluídos do estudo. ultra-sonografia intra-operatória do fígado foi realizada em todos os pacientes para avaliar o tamanho ea localização das metástases hepáticas. O tamanho do conjunto de dados foi determinado pelas amostras de tumor do paciente disponíveis nas duas instituições participantes que preencheram todos os critérios de entrada e de exclusão. -Paciente, características tumor-e cirúrgicos foram extraídos de nossas bases de dados coletados prospectivamente. A definição de metástase hepática síncrona (diagnóstico no prazo de dois meses após o diagnóstico inicial) foi baseado no fornecido pelo Instituto Nacional do Câncer dos EUA.

Follow-up

Todos os pacientes receberam norma acompanhar com espiral CT do abdómen e peito a cada 3 meses para monitorar as recorrências. sobrevida livre de doença foi definido como o tempo de ressecção para a hora do primeiro sinal de recorrência em tomografia computadorizada. Todos os pacientes foram censurados no momento da morte ou do último follow-up. O tempo de sobrevida foi determinada utilizando a função de sobrevivência de Kaplan-Meier.

Gene Expression Profiling

isolamento do RNA.

O RNA total foi isolado de amostras de tecido individuais, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo o protocolo do fabricante. O RNA foi purificado utilizando o RNeasy mini kit (Qiagen) e foi submetido a tratamento com DNase usando o kit Qiagen de ADN-livre. O rendimento ea qualidade de RNA total foi verificada por espectrofotometria e pela Agilent Bioanalyzer (Agilent). Treze amostras foram excluídas com base no rendimento de ARN e um rendimento de ARNc (número de integridade do ARN [RIN] 6). Oito amostras foram excluídos devido a falhas de amplificação, e mais 8 amostras não satisfazem os critérios de rotulagem, resultando em dados de 119 amostras.

síntese de cRNA e rotulagem fluorescente.

Todos os procedimentos de amplificação e de rotulagem foram realizados em placas de 96 poços (4titude, Bioke) em um personalizado SciClone ALH 3000 Workstation (Caliper Life Sciences), com uma PCR PTC-200 (Bio-Rad Laboratories), SpectraMax 190 espectrofotómetro (Molecular Devices), e um rebordo localizador magnético (Beckman). produtos de ARNc foram purificados e concentrados com RNAClean (Agencourt, Beckman) de acordo com o protocolo do fabricante. ARNm foi amplificado por transcrição in vitro utilizando um primer ancorado e T7 ARN polimerase em 1 ug de ARN total. Primeiro, um molde de ADNc de cadeia dupla foi gerado incluindo o promotor de T7. Em seguida, este molde foi utilizado para a transcrição in vitro com o kit T7 MEGAscript (Ambion) para gerar ARNc. Durante a transcrição in vitro, 5- (3-aminoallyl) -UTP (Ambion) foi incorporada na única cadeia de ARNc. As amostras com um rendimento de menos de 2000 ng ou com fragmentos pequenos de cRNA (mediana inferior a 500 nt) não foram usadas. Cy3 ou Cy5 fluoróforos (GE Healthcare) foram acoplados a cRNA. Foram aplicados critérios de RNA total e cRNA de controle de qualidade de acordo com o tumor Análise Best Practices Grupo de Trabalho [21]. A incorporação de rendimento e rótulo do cRNA cy-marcado foi verificada usando espectrofotometria. Somente amostras com entre 1,5% e 3% Cy-incorporação foram incluídos. Antes de hibridação, 300-1000 ng de cRNA Cy-rotulados de uma biópsia foi misturado com uma quantidade igual de material de cor inversa Cy marcado a partir da amostra de referência.

hibridação Microarray.

Para cada amostra, dois perfis de expressão em experiências com corante de swap foram gerados. As amostras foram comparadas contra uma referência comercial (catálogo Universal Human RNA Referência # 740000, Stratagene). A Human matriz-Ready Oligo set (versão 2.0) foi adquirida da Qiagen e viu em lâminas CodeLink (GE Healthcare) em uma poeira filtrada e umidade controlada sala limpa. Os microarrays continha 70-mer oligo-nucleótidos que representam 21.329 genes humanos e de marcadores de sequências expressas (ESTs), bem como 3871 pontos adicionais para fins de controlo. anotações gene foram actualizado por análise BLAST de todas as sequências de função usando ENSEMBL 55. construir matrizes foram hibridadas sobre uma estação de hibridação Tecan HS4800PRO, utilizando o protocolo descrito anteriormente [22]. lâminas hibridadas foram digitalizados em um scanner Agilent (G2565BA) a potência do laser de 100% e 60-90% PMT. Após a extração automática de dados usando Imagene 8.0.1 (BioDiscovery), printtip Loess normalização foi realizado em intensidades local médios [23]. Tingir viés foi corrigido com base em uma estimativa dentro do set [24].

acessibilidade dos dados.

De acordo com a proposta Miame (informação mínima sobre uma experiência microarray) padrões, dados primários e processados ​​como bem como os protocolos foram depositados na matriz Express (https://www.ebi.ac.uk/microarray-as/aer) sob o número de E-TABM-1112.

Identificação de uma recorrência Assinatura

A coorte foi dividida aleatoriamente em um conjunto de treinamento (n = 75) e um conjunto de validação (n = 44). Este último não estava envolvido na seleção de genes para evitar um viés de seleção. Para efeitos de descobrir o gene assinatura, os pacientes foram inicialmente divididas em um alto risco e um grupo de baixo risco. pacientes de alto risco foram definidos como aqueles com recorrência dentro de 1 ano (Figura 2). Este limite foi baseado na observação de que uma DFS 1 ano é preditivo da sobrevivência global adverso, tal como descrito por Fong et al [14]. Uma divisão com base em DFS ≤6 meses (de alto risco) e DFS 2 anos (baixo risco) também foi aplicado (Figura 2B). Usando o conjunto de treinamento, os genes foram classificados com base em três métricas diferentes (signal-to-noise-relação, a estatística t-teste e de razão de riscos proporcionais de Cox). Esta classificação foi feita usando uma abordagem de amostragem múltipla seleccionando 2/3 das amostras em cada iteração. Os 75 melhores classificados genes foram usados ​​para predizer a classe de risco das amostras em relação ao restante 1/3 de amostras utilizando a classificação média mais próxima [9] e deixá-one-out validação cruzada (LOOCV). Usando estas previsões para uma área combinada sob a curva para 1000 iterações foi calculada dando uma indicação do poder de previsão agregada das assinaturas genéticas 75, em que um valor significativamente acima de 0,5 pontos para o verdadeiro poder preditivo. O ranking dos genes foram calculados para o conjunto de 1000 iterações [25]. A partir da lista ordenada resultante, o gene assinatura com o mais forte poder prognóstico (medido como precisão global de previsão) foi determinada utilizando mais próximo de classificação média e LOOCV a partir do gene melhor classificado e posteriormente adicionar o gene próxima classificação mais alta em cada iteração (forward selection ) [9]. Uma medida independente da capacidade de previsão foi obtido utilizando o gene assinatura resultante para prever o risco classe das amostras no conjunto de validação (mais próxima significativo, LOOCV). Kaplan-Meier análises foram utilizados para estimar DFS e sobrevivência curvas para as duas classes de risco previstos foram comparadas pelo teste de log-rank de Mantel-Cox. A análise de poder para o teste de log-rank foi feita usando o programa PS [26]. análise de conjunto enriquecimento gene funcional foi realizada utilizando o Babelomics 4.2 suite de análise baseada em web, incluindo todos os bancos de dados disponíveis para a análise de enriquecimento [27].

Análise do Gene Expression Diferencial

A expressão gênica em pacientes tratados com quimioterapia neoadjuvante foi comparada com a expressão em pacientes não tratados utilizando a ANOVA [28]. Em uma análise de efeito fixo, amostra, array e os efeitos de corantes foram modelados. Os valores de P foram determinados por um F2-teste de permutação em que os resíduos foram embaralhadas 5000 vezes globalmente.

escores de risco clínicos

Um modelo de riscos proporcionais de Cox univariada foi utilizada para estimar as taxas de risco de cinco escores de risco clínicos que foram calculados para cada paciente [14] – [18]. a análise multivariada foi também realizada inserindo os fatores com valores de p abaixo de 0,1 na análise univariada

Testing Statistical Software e

Todos os testes estatísticos foram em frente e verso e a significância estatística foi considerada para valores de p inferior a 0,05. Se for caso disso, os valores de p foram ajustados para a sua taxa de detecção falsa usando o método de Hochberg-Benjamini [29]. As análises estatísticas foram realizadas em R 2.7.0 com pacotes Bioconductor adicionais e SPSS para Windows versão 15.0 (SPSS, Chicago, Illinois, EUA).

Informações de Apoio

Figura S1.

poder do teste log-rank. O poder estatístico do teste log-rank em função da taxa de risco da previsão de assinatura gene no conjunto de validação

doi:. 10.1371 /journal.pone.0049442.s001

(TIF)

Tabela S1.

-paciente e características do tumor dos pacientes internados e excluídos

a

doi:. 10.1371 /journal.pone.0049442.s002

(DOC)

Tabela S2. A análise de regressão

univariada de Cox para os genes de assinatura

a

doi:. 10.1371 /journal.pone.0049442.s003

(DOC)

Tabela S3.