Abstract

carcinoma de células transicionais (TCC) da bexiga urinária é o câncer mais comum do trato urinário. A maioria dos casos de CTP são do tipo superficial e são tratados com ressecção transuretral (TUR). No entanto, a taxa de recorrência é elevado e os tratamentos correntes apresentam a desvantagem de induzir forte toxicidade sistémica ou causar cistite dolorosa. Portanto, seria de valor terapêutico para o desenvolvimento de novos conceitos e identificar novas drogas para o tratamento de cancro da bexiga. Ki-67 é uma grande fosfoproteína nucleolar cuja expressão está firmemente ligada à proliferação celular, e curcumina, um fitoquímico derivado do rizoma

Curcuma longa,

tem sido demonstrado que possuem poderosas propriedades anticancerígenas. Neste estudo, foi avaliada a eficácia combinada de curcumina e um siRNA contra Ki-67 mRNA (Ki-67-7) em rato (AY-27) e humano (T-24), as células de câncer de bexiga. Os efeitos anti-cancerígenos foram avaliados através da determinação da viabilidade das células, a apoptose e a análise do ciclo celular. Ki-67-7 (10 nM) e curcumina (10 uM), quando tratado de forma independente, foram moderadamente eficazes. No entanto, na sua presença combinada, a proliferação de células cancerosas da bexiga foi profundamente ( 85%) inibida; a taxa de apoptose na presença combinada de curcumina e Ki-67-7 (36%) foi maior do que devido a Ki-67-7 (14%) ou curcumina (13%) sozinho. Também foi observada uma sinergia semelhante entre curcumina e Ki-67-7 na indução de parada do ciclo celular. análise de Western blot sugeriram que o pré-tratamento com células de câncer de bexiga Ki-67-7 sensibilizados para a apoptose e ciclo celular prisão mediada por curcumina por mecanismos de p53 e independente de p21. Estes dados sugerem que uma combinação de anticorpo anti-Ki-67 siRNA e curcumina pode ser um tratamento viável contra a proliferação de células cancerosas da bexiga

citação:. Pichu S, S Krishnamoorthy, Shishkov A, Zhang B, P McCue , Ponnappa BC (2012) Knockdown de Ki-67 por células Dicer-Substrato pequeno RNA de interferência sensibiliza cancro de bexiga à inibição de tumores induzidos pela curcumina. PLoS ONE 7 (11): e48567. doi: 10.1371 /journal.pone.0048567

editor: Bharat B. Aggarwal, da Universidade do Texas M. D. Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Agosto, 2012; Aceito: 28 de setembro de 2012; Publicação: 12 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Pichu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pela National Institutes of Health subvenção AA016551. A agência de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de bexiga é o câncer urológico mais comum em. sudeste da Ásia e da segunda neoplasia urológica mais comum na América do Norte [1]. carcinoma de células transicionais (TCC) é responsável por mais de 90% dos pacientes diagnosticados com câncer de bexiga [2]. Mais de 70% dos tumores de CTP são tumores superficiais confinados a mucosa da bexiga e da lâmina propia -ta ou T1 encenado tumores e os restantes são do tipo invasivo. A incidência de cancro da bexiga urinária aumentou continuamente durante as últimas duas décadas [3]. Um tratamento de preferência para tumores superficiais é a ressecção transuretral (TUR), mas o risco de recorrência (60-70%) devido à religação de células tumorais libertados e morte por doença (10-30%) é elevada [4]. A primeira abordagem para evitar a recorrência do tumor, após TUR, tem sido a terapia instilação intravesical (IVI), utilizando fármacos quimioterapêuticos [5], [6], mas os efeitos citotóxicos das drogas são motivo de preocupação. Devido à sua maior eficácia, a imunoterapia intravesical usando

Bacillus Calmette Guerin

(BCG) tornou-se o tratamento de escolha durante as últimas três décadas. No entanto, a indução de cistite e toxicidade sistémica são alguns dos seus efeitos secundários graves [2]. Apesar das terapias agressivas, os pacientes com câncer de bexiga têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas cerca de 50% [7]. Além disso, um número substancial de pacientes com câncer de bexiga são resistentes à terapia intravesical convencional e, portanto, é necessário desenvolver e de preferência abordagens menos tóxicos mais recentes para combater a doença.

Uma das abordagens mais recentes para suprimir a progressão do tumor é de o uso de drogas específicos do gene, tais como, os oligonucleótidos anti-sentido (AsODNs) ou pequenos ARN interferentes (siRNAs) contra ARNm de proteínas específicas do tumor. Na sequência da descoberta de interferência de RNA (RNAi) numa variedade de espécies de [8] – [10], tem havido um interesse tremendo em aproveitar o potencial terapêutico de ARNsi no tratamento de várias doenças [11], incluindo o cancro [12] e doenças inflamatórias [13]. Ki-67 é uma grande fosfoproteína nucleolar cuja expressão está firmemente ligada com o ciclo celular e está estreitamente associada com a proliferação de células [14]. É uma proteína de ligação ao ADN com um papel principal na manutenção da estrutura de ordem superior para o ADN durante o processo de mitose. A análise do ciclo celular detalhada revelou que o antigénio Ki-67 está presente nos núcleos de proliferação (G1, S, G2 e fase de mitose), mas não nos núcleos das células quiescentes ou de repouso (fase G0-) [15]. Isto sugere que os inibidores de Ki-67 pode ter especificidade relativa para células malignas. YOA et al., [16] relatou que entre muitos dos genes relacionados ao câncer testadas, a de Ki-67 foi um dos mais elevados em tumores de bexiga de rato, atingindo cerca de 20 vezes maiores níveis em comparação com o tecido normal. Assim, Ki-67 tem sido um dos genes de interesse a tratar, utilizando AsODNs [17], [18] ou os siRNAs [19], [20]. No relatório mais recente, AsODN contra Ki-67 foi utilizado em ensaios clínicos de Fase-I para o tratamento de cancro da bexiga humana [21]. Embora, a eficácia de AsODNs demonstrar a prova do princípio, sabe-se que os siRNAs são pelo menos uma ordem de magnitude mais sensível do que AsODNs [22], [23] e, por conseguinte, muito menor quantidade da droga precisa de ser utilizado para eficácia semelhante. Além disso, tem sido demonstrado que os (27 pb) siRNAs Dicer-substrato mais longos (DsiRNAs) são mais sensíveis do que os siRNAs padrão 19-21 bp [24]. Assim, siRNAs /DsiRNAs fornecer uma ferramenta melhor do que AsDONs para atingir genes específicos do tumor.

Além das moléculas anti-sentido, nos últimos anos, as drogas de origem vegetal também têm recebido muita atenção devido ao seu enorme potencial em a prevenção e tratamento de cancro [25]. A curcumina é um fitoquímico polyphenolic derivado do rizoma,

Curcuma longa

. Por causa de sua poderosa antiproliferativa e efeitos anti-inflamatórios, que tem atraído muita atenção por parte dos pesquisadores da área do câncer. Até à data, existem mais de 70 ensaios clínicos em vários estágios de finalização, testando a eficácia da curcumina contra muitas doenças (www.clinicaltrials.gov). O papel da curcumina na medicina moderna tem sido recentemente revista [26] – [28]. O potencial anti-cancro da curcumina deriva da sua capacidade para suprimir a proliferação de uma grande variedade de células tumorais, através da expressão de genes em proliferação COX2 tais como, MMP-9, quimiocinas, ciclina D1 e do factor nuclear kB-regulação para baixo (NF- kB) [29]. Tharakan et al., [30] utilizando um modelo de ratinho de cancro da bexiga ortotópico, relataram que a curcumina aboliu a activação constitutiva do NF-kB, no tecido tumoral, a apoptose induzida e diminuição da expressão de COX-2. No entanto, na presença do fármaco quimioterapêutico, gemcitabina, baixas concentrações de curcumina potencia os efeitos da droga através da modulação da via de sinalização de NF-kB [31]. Estas observações demonstram claramente o potencial terapêutico da curcumina no tratamento de cancro.

Desde curcumina inibe a proliferação de células tumorais, segmentando vários locais nos apoptóticas e proliferação vias, a hipótese de que a sobreposição de curcumina multi-alvo seguinte inibição molecular de Ki-67, que tem um efeito inibidor maior sobre o crescimento tumoral. Com efeito, nossos dados mostram, pela primeira vez, que o pré-tratamento de células cancerosas da bexiga com DsiRNA contra Ki-67 ARNm promove a paragem do ciclo celular e sensibiliza as células para a apoptose induzida por curcumina. Os alvos moleculares putativos de curcumina e Ki-67 DsiRNA são discutidos.

Materiais e Métodos

SiRNA Design by

Um total de três duplexes DsiRNA dirigido contra rato Ki-67 mRNA foram concebidos (Tecnologia de ADN integrado, Coralville, IA, EUA). As sequências dos três DsiRNAs são como se segue; 1) Ki-67 -2; sequência com sentido 5 ‘- CGA ACA AAG UCA UCA GAC ACA GUG A-3′; sequência anti-sentido 5’- UCA CUG UGU CUG agosto ACU UUG UUC GUU-3 ‘; 2) Ki-67-7; sequência com sentido 5 ‘- GAG CAA GGG UGA AGU UUU GCC GAA G-3’; sequência anti-sentido 5 ‘- AGG CAC CAA CUU CUC CCU ACU GUU CUU -3′ e 3) Ki-67-9; sequência sentido 5’- CCA CCA GAG CCA AUA GAU ACU UCA G-3 ‘e sequência anti-sentido 5′- CUG AAG UAU CUA UUG GCU CUG GUG GUG-3’. Um DsiRNA irrelevante, a seguir referida como “controle” DsiRNA foi projetado e tem a seguinte sequência; sequência sentido 5′- CAA GAG UGA GGG AGU GCC UUU GAA G-3 ‘; sequência anti-sentido 5 ‘- AGG CAC CAA CUU CGG CUU AUC ACU GUU-3’. Embora a abreviatura “DsiRNA” é inicialmente usado para enfatizar o fato de que os siRNAs mais longos foram utilizados no estudo atual, o termo genérico “siRNA” é utilizado alternadamente ao longo do texto.

Cultura de Células

TCC células derivadas de rato transplantáveis ​​(células AY-27) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Ronal Moore (Universidade de Alberta, Canadá). A caracterização de um modelo de tumor da bexiga utilizando esta linha de células transplantáveis ​​tem sido relatada [32]. As células foram mantidas em monocamadas, em meio de cultura consistindo em meio RPMI-1640 (Gibco-BRL), suplementado com 10% FBS, HEPES 30 mM (pH 7,3), piruvato 1 mM, penicilina-estreptomicina e 2,0 g /l de NaHCO

3. As células foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2 e 95% de ar através do método de Xiao

et al [32]. AY-27 células foram passadas quando confluentes por tripsinização padrão e procedimento reculturing. Onde indicado, para fins comparativos, humano derivados de T-24 linhas celulares de cancro da bexiga (American Type Culture Collection) também foram utilizados neste estudo e mantidas em cultura de tecidos como descrito para as células AY-27.

Transfection siRNA

O dia antes da transfecção, as células foram tratadas com tripsina, diluídas com meio fresco e transferidas para placas de 12 poços (10 × 0,8-1,0

5cells /poço). DsiRNAs foram transfectadas utilizando o reagente especificamente concebido para ARNsi transfecção (Lipofectamine ™ RNAiMax) de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, EUA). Rotineiramente, a transfecção foi efectuada em confluência celular de 8-10%.

Tratamento Curcumina

Quando indicado, as células tumorais foram tratadas com várias concentrações de curcumina (Sigma-Aldrich, EUA), quer isoladamente ou em combinação com DsiRNA. A curcumina foi dissolvido em DMSO e, em qualquer dada experiência, a concentração final de DMSO foi sempre inferior a 0,1% em volume.

crescimento celular Curva

Para avaliar a proliferação do tumor, crescimento de tumor foi avaliada através da medição do número total de células em vários estágios. Em cada fase, as células foram descoladas por tripsinização, lavadas com PBS, coradas com azul de tripano e as células vivas foram contadas usando um hemocitómetro. Cada condição experimental foi repetido três a seis vezes.

Ensaio MTT

Os efeitos antiproliferativos de ARNsi contra Ki-67 na presença ou ausência de curcumina foi determinada pelo ensaio do MTT. O ensaio foi baseado na capacidade das mitocôndrias para reduzir 3- (4, 5 dimethylthiaol-2-il) -2, 5-difeniltetrazólio (MTT) corante no rato (AY-27) e humano (T-24) o cancro da bexiga células como detalhado por Plumb [33]. Resumidamente, após a exposição das células a várias condições de tratamento, o meio foi removido, lavado com PBS, e adicionou-se solução de MTT (5 mg /mL em meio RPMI) e incubada durante 37 ° C durante 3 horas. Subsequentemente, o meio foi removido e substituído com um ácido-isopropanol solvente para dissolver o precipitado. Os conteúdos foram colocados num agitador durante 5 min e a absorvância medida a 570 nm.

quantitativa PCR em tempo real (qPCR)

Após a transfecção com ARNsi e /ou tratamento com a curcumina, as células eram colhida no intervalo adequado e o RNA total foi preparado por PureLink ARN Mini kit (Invitrogen, EUA). Para a síntese de ADNc, 1 ng de RNA total foi transcrito de forma inversa para ADNc em 20 uL reacções utilizando o kit de transcrição reversa Quantitect (Invitrogen, EUA). qPCR foi realizado com o sistema de detecção de luz cycler® 480 (Roche, EUA) utilizando o QPCR Brilliant® SYBR® verde Master Mix protocolo (Stratagene, EUA). Resumidamente, 2 ul de ADNc foi amplificado por PCR em reacções de 25 ul contendo 12,5 uL de reagentes verde SYBR 2 × e 0,2 uM de cada um dos iniciadores. A incubação inicial durante 10 min a 95 ° C foi seguido por 40 ciclos a 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 1 min. Cada experimento foi realizado em triplicado

Ki-67 Protein Expression:. Imunofluorescência Coloração

As células foram cultivadas em lamelas de vidro de 25 mm de placas de 6 poços. Após a exposição ao ARNsi e /ou curcumina sob várias condições, as células foram lavadas com PBS frio e fixadas com formaldeído a 4%. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpo primário Ki-67 (M19, Santa Cruz Biotechnology Inc.,) (1:100) durante 3 horas e lavada três vezes com PBS. As lamelas foram então incubadas com o anticorpo secundário marcado com FITC (1:400) no escuro durante uma hora à temperatura ambiente, lavou-se com PBS e coradas durante 10 min com uma solução de iodeto de propídio (PI). As lamelas foram então lavadas com PBS e montadas em uma corrediça, na presença de meio de montagem (solução Antifade, Invitrogen, EUA). As lâminas foram então visto sob sistema de Bio Rad Radiance 2001 acoplado a um microscópio Olympus IX70 com 60 × e 40 × objetivos de imersão em óleo (UAp0340, NA 1.35). A linha dupla fonte de laser de iões Kr /Ar foi usada para geração de imagens com as configurações de excitação de 488 nm para FITC e 588 nm para o PI.

Detecção de apoptose por anexina V Ensaio

A apoptose foi medida usando PE Anexina V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, após a exposição ao siARN com ou com a curcumina, as células foram lavadas com PBS frio e, em seguida, ressuspensas em tampão de ligação, seguido pela adição de PE Anexina V e 7-amino-Acitomycin (7-AAD) e analisados ​​em Epics da Beckman Coulter XL-MCL ™ Citómetro de fluxo, (EUA). Rotineiramente, a fluorescência média derivada de 20.000 contagens de células por amostra foi registrada.

ciclo celular Análise

Para determinar o efeito de anti-Ki DsiRNA 67 e /ou a curcumina nas fases do ciclo celular, células AY-27 foram expostos a diferentes condições experimentais, removeu os meios e as células foram destacadas por tripsinização. As células foram então lavadas com PBS e fixadas em gelo frio de 70% de etanol durante 2 horas a -20 ° C. As células foram então lavadas uma vez com PBS, ressuspensas em 300 ul de uma solução arrefecida com gelo modificado PI (solução PI 50 ug /mL, 0,1% de Triton X-100, e 0,1% de citrato de sódio, em PBS) e incubada durante 30 min antes da análise. fluorescência de PI foi medida por Coulter Epics de Beckman XL-MCL ™ Citómetro de fluxo, (EUA). Rotineiramente, a fluorescência média derivada de 20.000 contagens de células por amostra foi registrada. As células foram pontuadas como percentagem de células em cada uma das fases do ciclo celular (L

O /L

1, S e G2 /M).

Análise Western Blot

bexiga células cancerosas, após a exposição a curcumina e DsiRNA sob várias condições, foram tratadas com tripsina, lavadas com PBS, e lisadas com RIPA (Sigma-Cat # R0278) de tampão gelado. Os lisados ​​foram mantidas em gelo durante 20 min, vortex 3-4 vezes, e depois centrifugou-se numa microcentrífuga a 12000 rpm durante 15 min a 0-4 ° C. Os sobrenadantes foram removidos e analisados ​​quanto ao teor de proteína. -Se alíquotas (40 ug) de proteína de cada amostra foram dissolvidos em 4 × NuPage sulfato de lítio-dodecilo (LDS) e sujeitos a SDS-PAGE sob condições redutoras. As proteínas separadas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e bloqueadas em qualquer albumina 5% de soro de bovino (BSA) ou 5% de leite seco não gordo em uma solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween-20 (TBST) por procedimentos padrão. As membranas foram então incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários contra antigénios seguintes: β-actina, ciclina E, e p53 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EUA). Outros anticorpos usados ​​foram Caspase3 clivado, fosforilado-RB (PRB-P) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), ciclina D1, (BD Bioscience, San Jose, CA), Ki-67, NF-kB (p65 subunidade), p27 /Kip e p21 (Abcam, Cambridge, MA). As manchas foram então lavadas exaustivamente com TBS-T e incubadas com peroxidase de rábano apropriado conjugado anti-ratinho ou anti-coelho (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) em diluições anticorpos secundários 1:15,000 e, respectivamente, para 1:20,000 2 h à TA antes da lavagem final com TBST. As bandas de proteína foram detectadas pelo sistema de quimioluminescência melhorada usando SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). A imagem KODAK Estação 440CF (Kodak Sistemas de Imagem Científica, New Haven, CT) foi usado para visualizar e quantificar a intensidade líquida de bandas de sinal. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. blots representativos são mostrados.

Protein Assay

O teor de proteína nos lisados ​​celulares foi medida utilizando o kit de ensaio de proteína Micro BCA ™ (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) usando albumina sérica bovina como o padrão interno.

Análise estatística

Quando indicado, os valores são apresentados como média ± sE de (n) determinações. Os dados foram submetidos à análise estatística pelo teste t de Student emparelhado utilizando o programa Microsoft Excel e os valores com P . 0,05 foram considerados estatisticamente significativa

Resultados

A inibição da Ki-67 Gene expressão e proliferação celular por DsiRNA

O

in vitro

eficácias de três DsiRNA constrói alvejado a delatar mRNA Ki-67 foram testados como descrito acima em células AY-27. Como mostrado na Figura 1A, para fora dos três DsiRNAs (Ki-67-2, -7, -9), Ki-67-7 mostrou inibição máxima. A expressão de ARNm, analisadas por qPCR, mostrou um 39%, 50% e 28% de diminuição na expressão de ARNm de Ki-67 por Ki-67-2, 67-7-Ki e Ki-67-9, respectivamente, quando comparadas com células tratou-se com reagente de transfecção sozinho. Da mesma forma, a viabilidade celular pelo ensaio de MTT mostraram que o tratamento de Ki-67-7 foi o mais eficaz dos três (Fig. 1B). Assim, Ki-67-7 foi escolhido como o DsiRNA mais eficaz contra ARNm de Ki-67 para estudos subsequentes. Além disso, os estudos de dose-resposta mostrou que o Ki-67-7 era mais eficaz na concentração de 10 nM (1c). Sob as nossas condições experimentais, um aumento adicional na concentração de Ki-67-7 não aumentar o efeito anti-proliferativo do siARN.

× 10

5 células /poço) tal como descrito em Materiais e Métodos. Após 24 h, foram transf ectadas com cada uma das construções de siRNA (Ki-67-2, 67-7 e Ki-Ki-67-9) dirigidas contra ARNm de Ki-67. Após 48 h, o RNA foi extraído e os níveis de ARNm foram determinadas por PCR quantitativa, como descrito em Métodos. As células tratadas com o reagente de transfecção sozinho foram usadas como controlo. A taxa de expressão de ARNm de Ki-67 foi normalizado para a expressão de β-actina. Os valores representam os dados a partir de uma (de dois) experimento usando a média de determinações em triplicado. b) células AY-27 foram cultivadas em 12 poços (0,8 x 10

5 células /poço) as placas durante 24 horas e transfectadas com várias construções de ARNip conforme descrito em Métodos. A viabilidade celular foi determinada 48 h após a transfecção por teste MTT. As células tratadas com o reagente de transfecção sozinho serviram como o controlo (= 100%). As barras indicam valores que são as médias ± S.E. de três determinações. (

* P 0,05). c) células AY-27 foram cultivadas em placas de 12 poços (0,8 x 10

5 células /poço) tal como descrito em Métodos. Quarenta e oito horas após a transfecção siRNA, o efeito de várias concentrações de Ki-67-7 sobre a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. As células tratadas com o reagente de transfecção sozinho serviram como o controlo. valores de viabilidade celular são expressos como percentagem de controlo e são as médias ± SE de 3-8 determinações (

* P 0,05,

*** P 0,005).

Efeito do a curcumina sobre a proliferação do tumor: Sinergia com Ki-67-7

Os efeitos da curcumina e Ki-67-7 foram testados em ambos (T-24) e derivados de rato (AY-27) da bexiga de origem humana células cancerosas. Comparações de sequências mostraram que houve 80% de homologia na sequência alvo de Ki-67-7 entre ratos e humanos Ki-67 mRNAs. Em estudos de dose-resposta, observou-se que o crescimento de células de tumor foi inibido por curcumina de uma forma dependente da dose (FIGS. 2A e 2B) em ambos os tipos de células, mas, T-24 As células foram mais sensíveis a curcumina do que AY-27 células em 20 ^ M e acima. No entanto, a 10 μ M, o grau de inibição (25-30%) foi semelhante em ambos os tipos de células. Em ambos os casos, foi observada uma redução drástica (60-85%) na viabilidade celular entre 10 curcumina e 20 uM. No entanto, para fins de comparação dos efeitos combinatórias de DsiRNA e curcumina (CusiRNA), a dose mais baixa (10