Abstract
As células com esfera de capacidade, as células esferóides formando, estão presentes no ascite maligna de pacientes com câncer epitelial de ovário (EOC) e representam um entrave significativo ao tratamento eficaz devido ao seu suposto papel na progressão, metástase e resistência à quimioterapia. Os mecanismos exatos que fundamentam EOC metástase e resistência aos medicamentos não são claras. Compreendendo a biologia de células formadoras esfera pode contribuir para a identificação de novas oportunidades terapêuticas para EOC metastático. Aqui geramos células esferóides de linhas celulares de cancro do ovário humano e câncer de ovário primário. Xenoengraftment de tão pouco como 2,000 dissociado esferóides células em ratinhos imunodeficientes permitiu recapitulação completa do tumor original, ao passo que 10
5 células tumorais parentais permaneceu não-tumorigénica. As células esferóides foram encontrados para ser enriquecido em células com características de células-like-tronco cancerosas, tais como a regulação positiva de genes de células-tronco, auto-renovação, alta proliferativa e potencial de diferenciação e alta atividade de aldeído desidrogenase (ALDH). Além disso, as células esferóides foram mais agressivos no crescimento, migração, invasão, a recuperação do zero, a sobrevivência clonogênica, crescimento independente de ancoragem, e mais resistentes à quimioterapia
in vitro
.
estudos metabólicos 13C-glucose revelou que a glicose células esferóides percurso predominantemente a glicólise anaeróbia e do ciclo das pentoses em detrimento da glicose reencaminhamento para efeitos anabólicos. Estas propriedades metabólicas de células formadoras de esfera parecem conferir um aumento de resistência à apoptose e contribuir para o crescimento de tumores mais agressivos. Colectivamente, demonstramos que as células de esferóide com características semelhantes a células estaminais cancro contribuiu para a geração de tumores, progressão e a resistência à quimioterapia. Este estudo fornece insights sobre a relação entre a disseminação do tumor e atributos metabólicas das células-tronco cancerosas humanas e tem implicações clínicas para a terapia do cancro
Citation:. Liao J, Qian F, Tchabo N, Mhawech-Fauceglia P, Beck A , Z Qian, et al. (2014) As células do cancro do ovário Spheroid com propriedades semelhantes a células-tronco Contribuir para Tumor Generation, metástase e resistência à quimioterapia através do metabolismo hipóxia-resistente. PLoS ONE 9 (1): e84941. doi: 10.1371 /journal.pone.0084941
editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 10 Setembro, 2013; Aceito: 29 de novembro de 2013; Publicação: 07 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Liao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Instituto de Pesquisa Câncer Câncer Grupo de Trabalho ovário Grant, Cancer Vaccine Collaborative Grant, do Instituto de Pesquisa do Câncer e do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer, Anna-Maria Kellen Investigator Award Clínica do Instituto do Câncer Research (KO), Roswell Park Cancer Instituto Alliance Foundation, NIH P30 CA016056; NIH R01CA158318-01A1 e RPCI-UPCI Ovarian Cancer SPORE P50CA159981-01A1. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução câncer de ovário
epitelial (EOC) é a principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas. Existem mais de 23.000 casos por ano nos Estados Unidos, 14.000 mulheres e pode ser esperado que morrem da doença [1]. Apesar das melhorias modestas nas taxas de resposta, livre de progressão ea sobrevida média utilizando adjuvante platina e taxanos quimioterapia após a cirurgia cytoreductive, taxas de sobrevida global para pacientes com EOC avançada e tumores malignos de ovário-like (peritoneal primário) continuam a ser decepcionante [2]. Isto foi atribuído a várias razões. Em primeiro lugar, em contraste com a maioria dos outros tumores sólidos, mais de 75% dos pacientes com doença de AOE presentes estágio avançado (FIGO III ou IV). Em segundo lugar, embora a maioria dos pacientes inicialmente responder a platina e paclitaxel quimioterapia incluindo respostas completas, a taxa de recidiva é de aproximadamente 85%. Dentro de 2 anos de cirurgia cytoreductive e quimioterapia sistêmica, tumores geralmente se repetem e uma vez que ocorre recaída, terapia curativa é difícil. Portanto, é imperativo compreender o mecanismo (s) de EOC metástase e resistência à quimioterapia, a fim de melhorar os resultados clínicos nesta doença.
O principal modo de metástases à distância em EOC envolve o derramamento de células do primário do tumor, na cavidade abdominal, seguido de implantação sobre o revestimento mesotelial do peritoneu [3], [4]. Atualmente, existem dados para demonstrar que “as células formadoras esfera” ou “esferóides” são comumente encontrados em ascite e são capazes de tumorigênese
in vivo
, ter uma resposta reduzida aos medicamentos quimioterapêuticos
in vitro,
e pode desempenhar um papel importante na doença metastática [5] – [9]. Como as alterações metabólicas podem conferir uma vantagem sobre a capacidade das células cancerosas para sobreviver, proliferar e invadir [10] – [12], a hipótese de que as células formadoras esfera estão propensos a apresentar atributos metabólicas que promovem sua capacidade de sobreviver e metástase. No presente estudo, geramos células esferóides de linhas celulares EOC e de pacientes com câncer ovariano primário. Nosso
in vivo
e
in vitro
estudos biológicos sugeriu que estes esfera células formadoras são enriquecidas em câncer de células estaminais-like (CSCL) que contribuem de forma crítica a tumorigênese do câncer de ovário, metástase e resistência à quimioterapia. Em seguida, utilizou-base de perfis isótopo dinâmica metabólica [13], [14], para avaliar simultaneamente o fluxo de substrato dentro e entre as principais vias metabólicas de síntese macromolecular e a produção de energia sob várias condições fisiológicas. Descobrimos que as células esferóides aumentar a glicólise anaeróbia e do ciclo das pentoses e diminuir o reencaminhamento de glicose para fins anabolizantes. Este estudo fornece insights sobre a relação entre a disseminação do tumor e atributos metabólicas das células CSCL ovarianos, e tem implicações clínicas para o tratamento do câncer.
Materiais e Métodos
O isolamento de células tumorais de câncer de ovário humano
amostras tumorais e ascite foram obtidas de pacientes submetidos tumor debulking cirurgia para câncer de ovário (EOC) em Roswell Park cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY. Todas as amostras foram recolhidas ao abrigo de um protocolo aprovado CIC 15/02 do Conselho de Revisão Institucional da RPCI e consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente. As células tumorais de ascite foram obtidos a partir de sedimentos de células centrifugadas de fluido ascítico. Os sedimentos foram lavados duas vezes em PBS, colocados em gradientes de densidade de Ficoll-Hypaque e centrifugou-se novamente para células tumorais colheita. Para obter células de tumor a partir de tecido de tumor sólido, as amostras de tumor foram finamente picados em meio de cultura de células e de suspensões de células individuais foram lavadas duas vezes em PBS seguido por purificação de Ficoll-Hypaque.
Cultura celular
EOC primária As linhas celulares foram estabelecidas a partir de tumores sólidos e ascite por a cultura de células em condições diferentes 13 [15], [16] a partir de 30 pacientes EOC ao longo de um período de 2 anos. células esferóides foram gerados a partir de novas linhas de células EOC e a partir de uma linha celular estabelecida de cancro do ovário, OV2774, que foram obtidos a partir de Sloan Kettering Institute, Nova Iorque, NY (cortesia de J. Lloyd Old, Ludwig Institute for Cancer Research, NY, EUA), por o método tal como descrito [17] com modificações por ressuspensão 8 × 10
4 células com livre de soro de DMEM /F12 suplementado com 10 ng /fator mL humana recombinante de crescimento epidérmico (EGF; Invitrogen), 10 ng /mL de crescimento básico de fibroblastos fator (bFGF; Invitrogen) e N2 suplemento-a (stemcell Technologies Inc) em baixa de fixação 6 bem-placas Ultra (Corning) e da organização posterior em esferas
In vivo
Experimentos xenoenxertos.
Todos os estudos com animais aderiram aos protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal de RPCI. esferóides de células tumorais dissociadas ou pai foram contadas, ressuspensas em 50 uL de RPMI 01:01 /Matrigel (BD Biosciences), e injectado por via subcutânea (sc) nas pernas direita de 3- a ratinhos SCID fêmea de 4 semanas de idade (CB-IGH -1blcrTac-Prkdcscid /Ros) fornecido pelo Facility RPCI animal (originado de Taconic Farms, Hudson, NY). camundongos enxertados foram inspecionados a cada duas semanas para o aparecimento do tumor através da observação visual e palpação, e latências de tumor foram determinados. Os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical a um diâmetro do tumor de 1 cm ou 6 meses pós-transplante. tumores de xenoenxerto foram ressecados, fixadas em 10% neutra de formalina, tamponada, e embebido em parafina para seccionamento (5 ^ M) num micrótomo rotativo, seguido por diapositivo de montagem, com H E de coloração, e a avaliação histológica por um patologista para o tipo de tumor, grau e palco. Para determinar recapitulação xenoenxerto do fenótipo do tumor parental, o mesmo processo foi realizado em tumores humanos. Para avaliar a formação de tumores do ovário no seu ambiente nativo, os ratinhos IDCG foram injectados por via intraperitoneal (ip) com várias quantidades de células esferóides-derivado ou os seus tumores pai, monitorizado a cada duas semanas para a mudança de peso e formação de ascite, e sacrificados após distensão abdominal excessiva ou tumor palpável crescimento.
stem marcador de células gene Expression Profiling
array placa cDNA marcador de células estaminais humanas de Signosis foi usado para examinar a expressão de genes relacionados com células-tronco em células esferóides e células-mãe, de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, o ARN total isolado a partir de células de tri Reagent (Molecular Research Center, Inc.) foi transcrito de modo reverso em ADNc, o qual foi hibridado com oligonucleótido específico para o gene de pré-revestido em cavidades individuais. O nível de expressão de genes foi detectado por sinais quimioluminescentes por um leitor de placas.
Quantitative PCR
O RNA total foi exigido de esferóides ou não esferóides células usando da Qiagen RNeasy Mini Kit por procedimento de fabricação e reverso transcrito em cDNA por Kit iScript de síntese de ADNc a partir de Bio-Rad. Quantitativa PCR em tempo real foi realizada por meio da Bio-Rad iQ SYBR Green Supermix por protocolos da empresa em um sistema iQ iCycler também da Bio-Rad. sequências de iniciador de PCR em tempo real são mostrados na Tabela 1. ciclagem térmica foi realizada por um passo de desnaturação inicial a 95 ° C durante 3 min, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 10 seg, depois 60 ° C durante 1 min durante recozimento e coleta de dados. análise derreter-curva foi realizada imediatamente após o protocolo de amplificação sob as seguintes condições: 80 ciclos de incrementos de 0,5 ° C (10 segundos cada), com início em 57,5 ° C (passo de recolha de dados). Cada experiência foi efectuada em triplicado, com normalização para o gene da proteína ribossomal L4 (RPL4) como um nível de controle de expressão do gene alvo e interno foi calculada pela ΔΔC
método T usando software de análise de Bio-Rad IQ5 PCR quantitativo.
ALDH Activity Analysis
O kit ALDEFLUOR (StemCell Technologies, Vacouver, Canadá) usa um substrato fluorescente que se acumula dentro das células após oxidados pela enzima ALDH. As células em uma concentração de 2 x 10
5 /ml foram coradas pelo reagente ALDEFLUOR 5 ul a 37 ° C durante 45 min. Em cada experiência, uma amostra de células foi corada sob condições idênticas com dietilaminobenzaldeído inibidor da ALDH específica (DEAB) como controlo negativo para a criação de citometria de fluxo portão. O kit BioVision ALDH Ensaio de Actividade (BioVision) quantifica a actividade enzimática da ALDH por leitura da absorvância a 450 nm. O acetaldeído é oxidado por ALDH gerando NADH, que, em seguida, reduz uma sonda incolor num produto colorido. esferóides de células ou células parentais (1 × 10
6) foram lisadas em 200 ul de tampão de ensaio de ALDH e 10 ul de lisado de células foram usadas para o ensaio. OD450s foram lidas a intervalos de 10 min e 1 hora e as actividades de ALDH foram calculados de acordo com o protocolo do fabricante. Todos os testes foram realizados em duplicata.
Ensaio de Proliferação
células EOC dos Pais e esferóides foram cultivadas em meio completo (CM, 10% FBS + RPMI) ou RPMI não suplementado por 24 h. Em seguida, as mesmas quantidades de células foram semeadas em placa de cultura de tecido com CM, metade do meio foi trocado a cada 3 dias e o crescimento celular foi detectada por CellTiter-Glo Luminescent Viabilidade Celular ensaio como descrito [18] (Promega Corp). Os ensaios de proliferação foram realizados em triplicado.
Migration Assay
células EOC dos Pais e esferóides foram tratadas com RPMI não suplementado por 24 h. Numa placa transwell, 2 × 10
5 /poço as células foram colocadas em pastilha com meio RPMI-BSA 0,2%, a câmara não tem células excepto meio RPMI com 2,5% de FBS. Depois da cultura durante 1, 2, e 3 dias, o número de células que passaram através da membrana, bem como células de cair para dentro da câmara foram calculadas sob o microscópio após 10% de formaldeído, que fixa, durante 20 min, seguido por 0,1% de coloração com azul de cristal durante mais 20 min tanto à temperatura ambiente (TA). Todos os testes foram realizados em duplicata.
Wound Healing (zero) Ensaio
células EOC dos Pais e esferóides foram cultivadas em CM por 24 h. Em seguida, as células foram semeadas em placas de 6 poços até 80-90% de confluência e a monocamada celular foi riscada em linha recta com uma ponta de pipeta de 200 uL para criar um “zero”. Detritos foi removido com PBS e, em seguida, a cultura foi re-alimentadas com meio fresco. As imagens foram tiradas em 0 e 24 horas após a zero para calcular a taxa de migração celular.
Invasion Ensaio
células EOC dos Pais e esferóides foram tratadas com RPMI único meio para 24 h. Numa placa transwell, 40000 /poço as células foram colocadas em inserto que é revestida com Matrigel em meio RPMI-BSA a 0,2%, a câmara não tem células excepto meio RPMI com 5% de FBS. Depois da cultura durante 1, 2, e 3 dias, as inserções foram recolhidas e a superfície de membranas foram limpas, as células em Matrigel foram fixados em 10% de formaldeído, durante 20 min RT e os números de células que invadiram em Matrigel foram determinadas após coloração com 0,1 % cristal azul 20 min RT. Todas as experiências foram feitas em duplicado.
Anchorage-ensaio de crescimento independente
Quinhentos células foram semeadas em triplicado em placas de 6 poços contendo uma camada superior de agar mole de 0,3% e um 0,5% de agar de base em DMEM, FBS a 10%. Vinte e quatro horas mais tarde, o número médio de células semeadas por campo foi determinado por contagem de células em 5 campos diferentes sob o microscópio de luz. As colónias formadas ( 0,1 mm de diâmetro) após 3 semanas de crescimento em agar mole foram contadas; 10 campos diferentes por poço foram quantificadas e foi calculado o número médio de colónias por campo. O índice AIG (crescimento independente de ancoragem) foi expressa relativamente ao número de células semeadas.
A quimioterapia Resistência Ensaio
esferas foram dissociadas por tripsinização e pipetagem e as células foram semeadas a 5000 células por poço (placas de 96 poços; Corning) em meio de 200 mL cm. Todas as células foram tratadas durante 24 h com de 0 a 6 ug /mL de cisplatina (BD Biosciences) ou 0 e 18 ug /mL de Paclitaxel (Sigma; n = 5 por dose de fármaco). o número de células relativas foram determinadas por CellTiter-Glo Luminescent celular Viabilidade Ensaio [18]. experiências de dose-resposta foram realizadas em duplicado. Percentagem de sobrevivência de células é expressa relativamente ao controlo não tratado. citotoxicidades drogas célula esferóides foram comparadas após 48 horas de tratamento com cisplatina (4 mg /mL). Após os tratamentos de drogas, as células foram incubadas durante 8 dias em colônias de médio e celulares CM livre de drogas foram examinadas sob microscopia.
clonogênica Survival Ensaio
As células foram tratadas com várias quantidades de cisplatina para 24 h . Após a remoção da droga, as células foram lavadas com PBS, colhidas e 300 de sobreviver células /cavidade foram re-alimentadas com meio CM em placa de 6 poços. 10-14 dias mais tarde, as colónias foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e contadas.
A imuno-histoquímica
espécimes de tumor foram fixadas com formalina tamponada e embebidos em parafina. Secções (5 uM) foram colocados em lâminas de vidro, aquecida a 60 ° C durante 20 minutos, e, em seguida, desparafinadas com xileno e etanol. Para a recuperação de antigénio, fragmentos tumorais montadas em lâminas de vidro foram imersos em solução de recuperação de antigénio de pré-aquecido (solução de pH elevado DAKO; DAKO, Carpinteria, CA) durante 20 min e deixou-se arrefecer durante 20 min à temperatura ambiente. Após a inactivação da peroxidase endógena, purificado CA125 anticorpo monoclonal específico (OV 185:1, Novocastra) (1:200 diluição) e CK7 (Dako) (diluição de 1:20 ou 75 ug /ml) foram então adicionados e incubados durante a noite a 4 ° C. O anticorpo primário foi detectado com uma IgG anti-ratinho biotinilado (Dako). tetracloridrato de diaminobenzidina foi então adicionado para o desenvolvimento durante 10 min, seguido de contracoloração com solução de hematoxilina.
Análises bioquímicas
O uso de [U-
13C
6] traçador glicose em combinação com espectrometria de massa permite a avaliação do fluxo metabólico através das principais vias que facilitam a produção de energia e metabolismo biossintético da célula. células ovarianas normais (RPNLOv78) foram gentilmente cedidas pelo Dr. T Pejovic [19]. As células foram cultivadas em mistura 1:01 de RPMI e DMEM (sem glicose) + 10% de FBS 10 ug /ml de insulina 10 ng /ml de EGF + 0,1% de gentamicina + [U-
13C
6] de glucose (180 mg /ml). As células-mãe (RP-OV17534) foram cultivadas em meio RPMI (sem glicose) + 10% de FBS + [U-
13C
6] glucose (180 mg /ml). células esferóides RP-OV17534 foram cultivadas em DMEM /F12 (sem glicose) + N2 Suplemento-A + EGF 10 ng /ml + bFGF 10 ng /ml + [U-
13C
6] glucose (180 mg /ml). Após 24 horas de incubação, as células foram centrifugadas (1500 rpm durante 5 minutos) e foram obtidos meio de incubação e os sedimentos celulares. As concentrações médias de glucose e lactato de incubação foram determinados como anteriormente descrito [20]. O lactato a partir do meio de cultura de células foi extraído por acetato de etilo após acidificação com HCl. O lactato foi derivatizado para a sua forma propilamida-heptafluorobutírico e o
m /z
330 e 331 (2-3 carbonos de lactato, ionização química) foi monitorizada para a detecção de
m2
(
13C lactato de marcação dupla) e
m3
(lactato triple-rotulados) para o cálculo de atividade do ciclo das pentoses contra glicólise anaeróbia [21]. O glutamato foi separada a partir do meio utilizando cromatografia de permuta iónica [22]. Glutamato foi convertido na sua
n
-trifluoroacetyl-
n
butil derivado e os agregados iônicos
m /z
198 (carbonos 2-5 de glutamato, ionização por impacto de electrões ) foram monitorizados.
13CO
2 de libertação foi medida por um espectroscópio de massa de razão Finnegan Delta-S iónica e foi utilizado para estimar a utilização de carbono através da oxidação de glucose por linhas celulares [23]. análises de espectrometria de massa foram realizadas por três injeções automáticas independentes pelo amostrador e só aceita se o desvio padrão da amostra foi . 1% da intensidade de pico normalizada
Análise de Dados e Métodos Estatísticos
as análises estatísticas foram realizadas utilizando o, amostra independente paramétrica não pareado bicaudal
t
teste com intervalos de confiança de 99%.
resultados
Geração de células Spheroid do ensino primário do cancro do ovário amostras e linhas celulares estabelecidas EOC
linhas de células estáveis foram estabelecidas a partir de 3 de 30 (10%) culturas iniciadas a partir de amostras EOC primários durante um período de 2 anos. RP-OV15526 foi derivada de tumor sólido enquanto RP-OV17534 e RP-OV313777 foram derivadas a partir de ascites de AOE. Estas células foram cultivadas
in vitro Compra de 465, 312, e 125 dias com 68, 65 e 17 passagens, respectivamente. Todas as linhas foram de tarde-estágio (IIIC ou IV) pacientes com câncer adenocarcinoma seroso do ovário. Confluente em monocamada de células humanas primárias EOC representado morfologia típica de paralelepípedos epitelial com uma crescente 3-dimensional para cima nas zonas condensadas de células (Fig. 1a). Exame de marcadores epiteliais CK-7 e CA-125 confirmou adicionalmente a natureza epitelial destas linhas celulares primárias (fig. 1C). De modo a gerar células esferóides, linha celular de cancro do ovário ou células OV2774 EOC primários foram dissociadas enzimaticamente e inoculadas em placas ultra-baixas cultura de fixação em meio isento de soro com EGF, bFGF, e N2 suplemento-A. Nesta condição cultura algumas células morreram de fome no soro, enquanto outros foram forçados a suspensão e agregados formados. Três semanas após o plaqueamento, alguns agregados compactado em esferas que não poderia ser dissociados por pipetagem. Algumas das esferas também agregados para formar aglomerados esfera. Flutuação esferas e aglomerados foram dissociadas por pipetagem, e novamente plaqueadas duas vezes por semana, com as células resultantes gerar esferas secundárias, aparecendo esferóides prototípicas como distintos (Fig. 1B, 1E), semelhantes aos encontrados em ascites de pacientes [5], [6] . Utilizando esta abordagem, obtiveram-se os esferóides sustentáveis de linha de células estabelecida OV2774 (Fig. 1D e 1E) e células EOC RP-OV17534 primário (Figs. 1A e 1B), sob condições tronco-selectiva. Temos cultivadas do OV2774 e células RP-OV17534 como esferóides durante 6 meses, demonstrando a capacidade de auto-renovação das células esferóides.
Três linhas de células primárias (A) gerados a partir de pacientes EOC mostrar morfologia células epiteliais. (B) Uma das linha de células primária EOC gerado células esferóides 3-D independentes, auto-renovação sob mídia selecção de células-tronco. (C) As linhas celulares primárias de carcinoma expressam ovário marcador CA-125 e marcador epitelial CK-7, como mostrado por IHQ para RP-OV17534. (D) A linha de células OV2774 EOC é capaz de gerar células OV2774 esferóides (E). Todos unidade de barra de escala nesta figura e seguintes figuras estão em um.
Células Spheroid tumorigenicidade e metástase em imuno-deficientes Mice
Em seguida, foi investigada a tumorigenicidade de células formadoras de esfera . Foi examinado se os números exponencialmente mais pequenas (em comparação com as células cancerosas parental) foram capazes de tumorigénese, como mostrado anteriormente por outros cancerosas iniciar células epiteliais (AIC) [24] – [28]. esferóides de células ou células de tumor correspondentes em massa parental foram injectados s.c. em pernas direitas dos ratinhos SCID. Com injecções de apenas 2.000 células por ratinho, células esferóides foram tumorigénico em 4 de 4 ratinhos SCID para células esferóides RP-OV17534 e 2 de 2 para células esferóides OV2774, como evidenciado por tumores palpável no local de injecção (Fig 2A;. Tabela 2 ). O tempo médio de latência do tumor neste grupo foi de 31 a 90 dias para esferóide RP-OV17534 e 50 a 57 por esferóide OV2774, semelhantes ou inferiores a AIC de outros tumores malignos [24] – [27]. Correspondentemente, as injecções de 5.000 e 10.000 células esferóides RP-OV17534 também foram tumorigénico em três de três ratinhos com tumores menores latências (Figura 2A;. Tabela 2). Sem selecção esferóide não aderentes, as células tumorais em massa falhou para formar tumores mesmo a 40000 células por enxerto RP-OV17534 (Tabela 2). Todos os tumores de xenoenxertos subcutâneos derivados de células de esferóides foram categorizados como adenocarcinomas serosos de moderada fraca diferenciação /(grau 2 /grau 3), semelhante aos tumores primários do paciente parentais (H E secções coradas; A Fig. 2C). Não foram observadas diferenças de arquitetura /citológica entre tumores primários e enxerto.
(A) uma quantidade diferente de células esferóides s.c. injectada em ratinhos SCID formado tumores. (B) As células Spheroid i.p. injectado em ratinhos SCID formado ascite sangrenta e tumores em diferentes órgãos, tal como indicado pelas setas. (C) representativas H E secções de coloração (painel superior) mostra tumor RP-OV17534 primário, tumores do enxerto subcutâneo de esferóides, tumor de enxerto intraperitonial de esferóides, e tumor de enxerto intraperitonial de série a partir de ascites de ratinho SCID. A análise histológica (painel inferior) mostra metástases frequente de células tumorais em vários órgãos de células destinatários esferóides.
Uma das principais limitações dos estudos de CICs é o enxerto em microambientes não nativos [29], [30]. Para estabelecer que os CIC fielmente recapitular a progressão bem estabelecido de cancro do ovário, na sua configuração nativa, as experiências foram conduzidas com intra-peritoneal (i.p.) injecções. O i.p. injecção de apenas 10000 células por ratinho de células esferóides RP-OV17534 resultou no desenvolvimento de ascite ensanguentadas em 4 de 4 ratinhos SCID (Fig 2B;. Tabela 2), com latências de tumor de 75 a 84 dias, semelhantes ou inferiores a AIC de outros tumores [17]. Correspondentemente, i.p. injecções de 20000 e 40000 células esferóides também foram tumorigénico em três de três ratinhos com tumores menores latências (Tabela 2). Sem selecção esferóide não aderentes, as células tumorais em massa não conseguiu formar ascite sangrentas e tumores, mesmo em 80.000 células por injecção, enquanto que um de um e 3 de 3 ratinhos i.p. injetados, respectivamente, com 1,7 × 10
7 e 2 × 10
7 células EOC primária parentais foram tumorigénico, embora com latência extendida (92-105 dias; Tabela 2). I.p. injecção de células formadoras de esfera resultou no desenvolvimento de ascite sangrenta e metástase peritoneal para o omento, fígado, cólon, estômago e rins (Fig. 2B), e a histologia do tumor intraperitoneal semelhante para ambos xenoenxerto subcutâneo e tumores primários do paciente (Fig. 2C ). Consistente com os resultados para RP-OV17534, também observamos maior tumorigenicidade de células esferóides OV2774 em comparação com as suas células-mãe, i.p. semelhante enxerto animais experimentos usando OV2774 derivados de células (Tabela 2).
Outro critério essencial para CICs é sua capacidade de se propagar em série tumores em animais consecutivamente enxertados [31]. Para examinar esta característica stemness definitiva, serial engraftments de xenoenxertos foram realizadas. 2 × 10
4 de células esferóides foram i.p. injectado em ratinhos SCID e ascite desenvolvidos como esperado em 3 dos 3 ratos em aproximadamente 60 dias. Transplante de 8 × 10
4, 1 × 10
5, e 5 × 10
5 tais células de ascites em ratinhos SCID resultou em ascites e tumores, com uma latência significativamente mais curto do que as células tumorais do doente parentais ( 66/63/49 dias, respectivamente para a passagem 2 xenotransplantes versus nenhum desenvolvimento do tumor de células tumorais pai de 8 × 10
4 transplante em 0 out of 3 ratos SCID). A patologia da massa omental foi semelhante ao do s.c. tumores (Fig. 2C). Estes resultados indicam que as células formadoras de esfera são mais tumorigénico do que as suas células de tumor progenitoras, demonstrando que uma subpopulação altamente tumorigénicas das células estão presentes dentro das células formadoras de esfera, e pode residir dentro de neoplasmas do ovário. Dado que as células de esferóide RP-OV17534 e células OV2774 esferóides demonstrou características similares, os seguintes resultados são apresentados para as células derivadas de RP-OV17534 com observações semelhantes para células OV2774.
tumor ovariano células formadoras de Sphere expressar genes Stem Cell
para examinar a expressão de genes específica para células estaminais embrionárias, o ARN total a partir de células de esferóide e células parentais foram analisados por uma célula estaminal de ADNc do marcador placa de matriz humana. Entre os 32 genes testados, células esferóides upregulated Notch1, Nanog, CDCP1, CD34, e myc (Fig. 3A). Cada um destes genes é essencial para os processos de desenvolvimento (embriogénese, neurogénese, a expansão das células estaminais, e a hematopoiese [32] – [34]). Estes resultados foram confirmados por dados em tempo real quantitativa de PCR. Os níveis de expressão de Notch1, Nanog, CDCP1, CD34, e Myc em células esferóides foram de aproximadamente 10-2000 vezes mais elevada do que a de células não-esferóides detectados por PCR em tempo real (Fig. 3B, barra vermelha). Quando as células foram cultivadas em esferóides CM, sem fatores de crescimento, uma condição de diferenciação, as células flutuantes aderiu e cresceu em células epiteliais. Em seguida, compararam os mesmos conjuntos de nível de expressão do gene por PCR em tempo real em células esferóides, a cultura em condições tanto de células estaminais-selectiva ou diferenciação durante 14 dias. A expressão de CD34 e Nanog eram aproximadamente 1 vezes da das células não-esferóides, CDCP1 e Myc diminuído para 9 e 500 vezes, respectivamente. nível de expressão em células de Notch1 esferóides ficado em 12 vezes da das células não-esferóides após a cultura em CM durante 14 dias (Fig. 3B, uma barra verde). -Tronco do receptor do factor de células CD117 (c-kit) tem sido relatado em estudos anteriores sobre progenitores tumorais do cancro do ovário [17], [35]. Portanto, examinámos por FACS CD117 expressão nestas células esferóides. Consistente com relatórios anteriores, nós também detectado CD117-regulação em células esferóides em comparação com células-mãe. células Uma vez que um grande número de células esferóides mortos por medicamentos de quimioterapia foram diferenciados de células não estaminais, enquanto caule como sobreviveram (ver abaixo), verificou-se que a expressão de CD117 ainda aumentada em células esferóides, após tratamento com cisplatina durante 24 horas (FIG. 3C) . Estes dados indicam que as células de cancro do ovário esferóides sobre-expressam genes de células estaminais em condições de células-tronco e selectiva perder ou diminuir estas expressões gene sob condições de diferenciação.
(A) RNA total isolado a partir de células de esferóide e células parentais foram examinados para a sua expressão do gene por uma matriz de ADNc de marcadores de células estaminais humanas e stem Cell-genes apresentaram maiores níveis de expressão em células de esferóides de células não-esferóides. (B) Os níveis de sobre-expressão de Notch1, Nanog, CDCP1, CD34, e Myc em células de esferóides, em comparação com células não-esferóides foram confirmadas por quantitativa PCR em tempo real. expressão ‘Estas células-tronco genes foram perdidos ou regulada para baixo quando as células esferóides foram diferenciados por cultura em CM, sem fatores de crescimento durante 14 dias. Os níveis de expressão são representados como alterações de dobragem em comparação com estes de células não-esferóides. (C) análise FACS da expressão de CD117 nas células esferóides e células-mãe com elevada expressão em células CD117 esferóides. Algumas células esferóides foram tratados com cisplatina por 24 horas antes da coloração da superfície por CD117 Abs. As barras de erro: SD, N = 3. *:. p 0,05
O aumento da atividade ALDH em Células Spheroid
ALDH desempenha um papel vital na desintoxicação celular. Estudos recentes mostram que o aumento da actividade de ALDH leva a várias tipos de doenças malignas, serve como um marcador de células estaminais do cancro e correlacionada com prognóstico pobre [36] – [39]. O nosso ensaio ALDEFLUOR mostrou mais ALDH
+ células em células esferóides na ausência de inibidor da ALDH DEAB (Fig. 4A). O aumento da função da ALDH em células de esferóide foi confirmada por um ensaio colorimétrico a actividade da ALDH, que mostra actividade aumentada significativa em células esferóides (Fig. 4B).
(A) O kit ALDEFLOUR etiquetas da população com uma actividade enzimática elevada ALDH em células esferóides. Uma alíquota de cada amostra de células foi tratada com DEAB inibidor da ALDH como controlo negativo para a definição portão FACS. (B) O ensaio colorimétrico BioVision ALDH detectada atividade ALDH reforçada no lisado celular esferóide. As barras de erro: SD, N = 2 *:. p 0,05
Células Spheroid têm alta proliferação e migração potencial do que suas células parentais
A relação da formação esferóide e crescimento celular potencial foi examinada num ensaio de proliferação de células cinética.