Abstract

O regulador gênica global Especial AT-rich protein-1 (SATB1) foi relatado para induzir mudanças EMT-like e ser associado com mau resultado clínico em vários tipos de câncer de ligação sequência. Este estudo tem como objetivo avaliar se SATB1 afeta os comportamentos biológicos de carcinoma de células transicionais da bexiga (BTCC) e ainda elucidar se este efeito funciona através de uma transição (EMT) via epitelial-mesenquimal. A expressão de SATB1, E-caderina (marcadores epiteliais), vimentina (marcadores mesenquimais) em tecidos BTCC e tecidos cancerosos adjacentes, bem como em duas linhas celulares de cancro da bexiga foram investigados. Se a expressão SATB1 está associada a fatores clínico-patológicos ou não foram analisados ​​estatisticamente. invasão celular e migração, do ciclo celular, a proliferação celular e a apoptose foi avaliada em SATB1 knockdown e linhas celulares sobre-expresso. Os nossos resultados mostraram que a expressão de SATB1 foi notavelmente sobre-regulada tanto em tecidos BTCC e em linhas celulares de cancro da bexiga com um elevado potencial de metástases. Os resultados também foram associados com marcadores de EMT e mau prognóstico dos pacientes BTCC. Além disso, SATB1 induzida processos EMT através de regulação negativa da E-caderina, regulação positiva de repressores E-caderina (Caracol, Lesma e vimentina). SATB1 também promoveu a progressão do ciclo celular, proliferação celular, invasão celular e migração das células, mas não alterou a sobrevivência celular. Em conclusão, nossos resultados sugerem que SATB1 desempenha um papel crucial na progressão do cancro da bexiga através da regulação de genes que controlam processos EMT. Além disso, pode ser um novo alvo terapêutico para cancros da bexiga agressivos

citação:. Wan F, Cheng C, Wang Z, X Xiao, Zeng H, Xing S, et al. (2015) SATB1 superexpressão Regulamenta o desenvolvimento e progressão no cancro da bexiga através da EMT. PLoS ONE 10 (2): e0117518. doi: 10.1371 /journal.pone.0117518

Editor do Academic: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 07 de agosto de 2014; Aceito: 26 de dezembro de 2014; Publicação: 23 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não receberam qualquer financiamento específico para este trabalho

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

o câncer de bexiga (BC) é uma das neoplasias malignas mais comuns que afetam o revestimento da bexiga urinária, com uma estimativa de 386,300 novos casos e 150,200 mortes pela doença em todo o mundo, por ano [1]. Na China, foi relatado que BC é a malignidade mais comum genito-urinário, e a incidência desta doença tem sido aumentado nos últimos [2] décadas. Devido à recorrência alta locais de tumor, progressão e metástases à distância, mau resultado clínico foi mostrado para pacientes BC, apesar das melhorias consideráveis ​​nas técnicas cirúrgicas e terapias adjuvantes [3-6]. Enquanto isso, os caminhos complicados durante oncogênese eo comportamento biológico imprevisível de câncer ainda são mal compreendidas e afetada por fatores ambientais e genéticos [7]. Portanto, a identificação de novos marcadores moleculares que poderia servir fatores prognósticos como padrão é necessária para o diagnóstico precoce e para o desenvolvimento de um tratamento mais eficaz para pacientes BC.

Tem sido geralmente reconhecido que mau prognóstico de neoplasias está associada com a agressividade do tumor. Isto ocorre quando as células se tornam não-invasivos invasiva através de vários passos metastáticos, tais como as células epiteliais a perda de polaridade e mais invadindo compartimentos vascular e linfático [8]. O mesenquimais transição epitelial (EMT) é o processo chave que ocorre inicialmente durante fases críticas do desenvolvimento embrionário em que as células perdem suas características epiteliais e contatos célula-célula, e, concomitantemente, adquirir propriedades migratórias e invasivos de células mesenquimais [9-11]. Além disso, os processos de como EMT-semelhantes podem ocorrer durante a progressão do tumor em carcinomas e tem um papel na promoção de prevenção da apoptose e senescência das células tumorais, contribuindo para imunossupressão [12]. Perda de expressão da caderina-E é uma característica marcante do processo EMT [9]. Mais uma vez, em estudos recentes, tais como factores de transcrição Snail e Slug foram identificados como repressores directos de E-caderina e indutores de EMT, o que provoca ainda mais paramédicos completas, tanto a nível do morfológicas e comportamentais quando sobre-expresso em células epiteliais [13-15] . Além disso, um crescente corpo de evidências sugere que a EMT desempenha um papel fundamental na iniciação e desenvolvimento de metástase durante a invasão e progressão tumoral do câncer de bexiga

in vivo

e

in vitro

[16 -18].

especial rica em AT proteína de ligação 1 (SATB1) é uma região de ligação à matriz nuclear (MAR), proteína de ligação de ADN que actua como um organizador de genoma e regulador do gene através da modulação da conformação espacial da cromatina. É também participam numa variedade de processos biologicamente importantes, tais como a proliferação, a diferenciação, a apoptose e a reprogramação dos perfis de expressão [19-21]. Em estudos recentes, a supra-regulação de SATB1 foi encontrado para ser correlacionado com a invasão e metástases de muitos tipos de malignidade, incluindo o cancro gástrico, cancro da mama, cancro rectal, cancro do fígado e cancro da próstata. Estes achados sugerem que SATB1 é um fator prognóstico independente e um potencial alvo terapêutico em cancros humanos [21-26]. Por exemplo, Han et al descobriram que o esgotamento SATB1 poderia reverter o processo EMT através de regulação negativa dos repressores E-caderina, tais como Caracol e SIPI e regulação positiva da E-caderina em (MDA-MB-231) células altamente agressivas de câncer [21] . Outro estudo relatou que a supressão quimioterapêutico de miR-448 aumenta os níveis de mRNA de SATB1 e promove o EMT. Estes resultados fornecem novas abordagens terapêuticas potenciais para o câncer de bexiga.

Enquanto carcinoma de células transicionais da bexiga (BTCC) é um dos sub-tipos mais comuns de BC, o conhecimento atual sobre o mecanismo específico de BTCC invasão e metástase é ainda limitada. Em um estudo recente, Bin Han et al descobriram que SATB1 foi sobre-expresso em cancro da bexiga humana e associado com o grau do tumor e estágio. Além disso, eles também descobriram que a depleção SATB1 diminuição da proliferação de células e aumento da apoptose celular em células T24 e 5637 [27]. No entanto, como a expressão de SATB1 afeta o comportamento biológico de BTCC e se SATB1 induz a EMT no cancro da bexiga ainda é inexplorado. Neste estudo, avaliou-se a expressão de SATB1 em espécimes BTCC e linhas celulares de cancro da bexiga embora coloração imuno-histoquímica e em tempo real de RT-PCR e ensaios de análise de transferência de Western e descobriu que a sua expressão está correlacionada com características patológicas clinicamente. Em linhas celulares de cancro da bexiga humana estabelecidos, demonstramos ainda que overexpressed ou silenciados SATB1 regulamentou a migração celular, invasão e proliferação, juntamente com o ciclo celular.

Materiais e Métodos

Materiais

espécimes de cancro da bexiga primária e combinados tecidos não cancerosos foram obtidas de 126 pacientes (idade média de 65,2 anos, intervalo 45-78) diagnosticados com câncer de bexiga que se submeteram à ressecção cirúrgica para ensaios de imuno-histoquímica no Hospital da União no Departamento de Urologia (Wuhan , China) entre abril de 2007 e outubro de 2012. Partes de amostras de tecidos foram fixados em formalina e embebidos em parafina. Todos os doentes não receberam tratamento pré-operatório, tal como quimioterapia ou radioterapia. Todos os participantes desde que o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo, eo estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da União Hospital, Tongji Medical College, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia (HUST). informação clínica e patológica foi obtido a partir de uma revisão retrospectiva dos registros médicos bem documentados. Os tumores foram classificados histologicamente como o câncer não-invasivo do músculo da bexiga (NMIBC) (estágio PTA) ou músculo câncer de bexiga invasivo (CINM) (estágio pT3) de acordo com tumor-nós-metástase (TNM) de classificação para a fase [28]. Grade foi atribuída de acordo com a classificação dos tumores do sistema urinário e genital masculino Órgãos (2004) [28] da Organização Mundial da Saúde. Todas as mortes foram atribuídas ao câncer de bexiga. As características dos pacientes são detalhados na Tabela 1. linhas celulares de cancro da bexiga Humanos BIU-87 e T24 foram mantidas em nosso laboratório (Laboratório Central de Union Hospital, Tongji Medical College, HUST, Wuhan, China). células BIU-87 foram obtidos a partir de um grau II, não-invasiva do músculo (pT1) BTCC humano da bexiga urinária. células T24, que são pouco diferenciados e possuem um maior potencial de metástases e exibem uma morfologia fibroblástica típico microscopicamente foram derivadas de um carcinoma da bexiga grau III [29]. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 100 ug /ml de penicilina-estreptomicina (Gibco, Carlsbad, CA, EUA), e incubou-se com uma atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2 a 37 ° C.

coloração imuno-histoquímica análise

a expressão de proteínas foi determinada por coloração imuno-histoquímica para SATB1, e-caderina e vimentina, com o método complexo estreptavidina biotina-peroxidase utilizando SABC kits (Boster Ltd., Wuhan, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as amostras de tecido foram fixadas em 10% de formalina tamponada neutra, desidratado e embebido em parafina. Em seguida, as secções foram desparafinizadas e reidratadas. O peróxido de hidrogénio foi aplicado para bloquear a actividade endógena de peróxido durante 10 minutos. Após recuperação de antigénio usando um forno de microondas, as secções foram tratadas com soro de cabra normal a 10% durante 10 min a temperatura ambiente para reduzir a capacidade de ligação não específica. As secções foram então incubadas com anticorpo policlonal de coelho SATB1, E-caderina e vimentina (Abcam Inc., Cambridge, MA, EUA) a uma diluição de 1:70. Estes foram deixados numa câmara humidificada durante a noite a 4 ° C. Depois de se lavar três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 5 min de cada vez, as secções foram incubadas com anticorpo secundário por 40 minutos e, em seguida, com Estreptavidina complexo biotina-peroxidase durante 40 min a 37 ° C. Depois de enxaguar, diaminobenzidina (DAB; Abcam Inc., Cambridge, MA, EUA) foi usada como cromogénio e as secções foram contrastadas com hematoxilina. As amostras foram incubadas com STF em vez de o anticorpo primário serviram como controlos negativos. SATB1staining em nuclear foi definida como immunoreactions detectáveis ​​e E-caderina e coloração vimentina em plasmalemma ou citoplasma foi definida como immunoreactions detectáveis. A coloração positiva foi pontuada com base na intensidade e a percentagem de células com coloração nuclear SATB1. De acordo com a intensidade predominante, a intensidade da coloração foi indicado na seguinte escala: 0 marcar, coloração nuclear negativo para todas as células de tumor; escore 1, coloração nuclear fraca; escore 2, coloração nuclear moderado; escore 3, coloração nuclear forte. De acordo com a percentagem de células coradas positivamente, o marcador de densidade de coloração foi determinada como se segue: 0, inferior a 5%; 1, 5 a 25%; 2, 25 a 50%; 3, mais do que 50%. A pontuação final foi calculada pela soma dos dois escores acima. Pontuações de 0-2 foram definidas como pontuações de expressão baixo, e 3-6 foram definidas como contagens elevadas.

extracção de ARN e ensaios de PCR quantitativa em tempo real

O ARN total foi extraído e purificado a partir de cada amostra de tecido e linhas celulares utilizando o reagente Trizol (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada utilizando o kit de transcrição reversa (Takara Biotecnologia Dalian, China), com as seguintes condições: a transcrição reversa a 37 ° C durante 25 min, seguido de incubação a 85 ° C durante 5 seg em 20 uL de volume de reacção. Em seguida, o cDNA foi preparado e utilizado como um molde para quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (PT-PCR) realizada sobre uma StepOnePlus Real-Time PCR sistema ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) utilizando o SYBR Green Real- tempo de mistura de PCR master (Takara Clontech, Quioto, Japão). Isto foi feito com as seguintes condições: desnaturação a 95 ° C durante 30 segundos, seguido de 40 ciclos de amplificação (95 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 30 segundos). Os iniciadores foram concebidos utilizando o NCBI-BLAST Primer como se segue: SATB1 (para a frente, 5′-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 ‘; reverso, 5′-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′), E-caderina (para a frente, 5’-CTG GACGCTCGGCCTGAAGT-3 ‘; reversa , 5’-GGGTCAGTATCAGCCGCTTT-3 ‘), vimentina (para a frente, 5′-ACAGGCTTTAG CGAGTTATT-3′; reverso, 5’-GGGCTCCTAGCGGTTTAG-3 ‘), torção (para a frente, 5′-CAGCGCACCCAGTCGCTGAA-3’; reversa, 5 ‘ -CCAGGCCCCCTCCATCCTCC-3 ‘), Snail (para a frente, 5′-ATCCGAAGCCACACGCTGCC-3′; reverso, 5’-CACGGCTGCAGTGGGGACAG-3 ‘), Slug (para a frente, 5′-CGCTCCTTCCTGGTCAAGA-3′; reverso, 5’-3-TTGCGTCACTCAGTGTGC ‘), ZEB1: (para a frente, 5′-TGCTCCCTGTGCAGTTACACCTT-3′; reverso, 5’-CCAGACTGCGTCACATGTCTTTGA-3 ‘), ZEB2: (para a frente, 5′-ATACCGCGGTGCCATCCTTGTACAGTGGTT-3′; reverso, 5’-GCGCTGCAGAGTAATTGGAAAAAAACAAA-3 ‘) , GAPDH (para a frente, 5’-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ‘; reverso, 5′-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3’). Os iniciadores foram concebidos para serem intrão-medindo. Os valores limite de ciclo (CT) foram padronizados com valores CT de GAPDH. Os níveis relativos de ARNm transcrito de cada indivíduo na amostra comparado com o controlo de GAPDH foram calculados utilizando a 2

-ΔΔCt método.

análise de transferência de Western

A proteína total foi extraído a partir de cada amostra de tecido e a linha de células utilizando tampão RIPA (Sigma, St Louis, MO, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As concentrações de proteína foram determinadas com um kit de ensaio de proteína BCA (Boster Ltd., Wuhan, China). Quantidades iguais de amostras de proteínas recolhidas foram resolvidas em electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio 10% (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) e transferidas para membranas de PVDF (Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA), seguido pela bloqueio com tampão TBST composto de Tris 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM e Tween a 0,05% suplementado com leite isento de gordura a 5% a 4 ° C durante 2 horas. As membranas manchadas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo policlonal de coelho SATB1, E-caderina, vimentina (Abcam Inc., Cambridge, CA, EUA) (1: 800), ZEB1, ZEB2, Snail e espaçador (Santa Cruz Biotechnology Inc ., Santa Cruz, CA, EUA) (1: 500). Foi utilizado GAPDH (Boster Ltd., Wuhan, China) como um controlo de carga. A ligação do anticorpo foi detectada usando anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Boster Ltd., Wuhan, China) durante mais 2 h à temperatura ambiente de acordo com as instruções do fabricante. As bandas imunorreactivas foram visualizadas por reforçada Ocidental sistema de detecção de mancha de ECL (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) e a intensidade das bandas detectadas foram analisados ​​utilizando um programa de J imagem.

células SATB1-knockdown

Uma previamente validado shRNA foi utilizado [21]. A sequência do shRNA foi como se segue: 5′-GGATTTGGAAGAGAGTGTC-3 ‘. O shRNA foi sintetizado e clonado no vector pGenesil2 (GenePharma Co., Ltd. Xangai, China) e em seguida transfectado em células T24 -confluent 50%, juntamente com um vector de controlo pGenesil2 usando Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante . populações agrupadas de células knockdown foram obtidas após duas semanas de selecção de drogas com 400 ug /ml de G418, após a incubação durante 24 h. Em seguida, as linhas de células estáveis ​​SATB1-knockdown de ARN-interferência mediadas foram designados como pGenesil2-SATB1-shRNA e foram ainda cultivadas durante as experiências subsequentes. células T24 tratados com pGenesil2-mexidos-shRNA (5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘), que não tem como alvo qualquer gene específico foram usados ​​como os grupos de controle.

SATB1-superexpressão células

O humano SATB1 ADNc de comprimento completo foi clonado no vector de expressão pcDNA3.1 comprado de GenePharma Co., Ltd. (Xangai, China). Após ser confirmada por sequenciação de ADN, o vector de expressão e de controlo vector pcDNA3.1 pcDNA3.1-SATB1 foram transfectados em 50% de células -confluent BIU-87 utilizando Lipofectamina 2000, respectivamente (Invitrogen). Após a transfecção, as linhas de células estáveis ​​foram seleccionados após incubação com 600 � /mL de G418 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro de vitela fetal, durante duas semanas. Estas foram então cultivadas durante as experiências subsequentes. As células que sobre-expressam BIU SATB1 foram estabelecidos e os níveis de expressão SATB1 exibidos por estas células foram confirmadas utilizando análise RT-PCR em tempo real. células não transfectadas BIU-87 foram usados ​​como os grupos de controle.

Imunofluorescência análise

Para determinar a localização celular de proteínas para SATB1 e E-caderina, imunofluorescência foi realizada utilizando um A1Si de varredura a laser do microscópio confocal. Resumidamente, BIU-87 e T24 células transfectadas com vectores de expressão pGenesil2-SATB1-shRNA pcDNA3.1-SATB1 e foram semeadas em lamelas de vidro e colocadas em placas de 24 poços. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 30 min a 37 ° C, após incubação durante 3 dias, e, em seguida, lavadas com PBS duas vezes durante 10 minutos cada. As células fixadas foram permeabilizadas com 0,3% de Triton- X 100 durante 15 min, bloqueadas em soro de cabra a 10% durante 1 h, e, em seguida, lavadas com PBS duas vezes durante 10 minutos cada. Em seguida, as células foram incubadas com o anticorpo primário como se segue: anticorpo policlonal de coelho SATB1, e E-caderina (Abcam Inc., Cambridge, CA, EUA) (01:50) a 4 ° C durante a noite, seguido por detecção com anticorpos secundários conjugados com Cy5 e faloidina marcada com FITC (5 ug /ml) (Sigma) durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. DAPI foi subsequentemente utilizado para corar núcleos. As imagens foram coletadas usando uma Nikon A1Si de varredura a laser confocal do microscópio (Nikon, Japão).

invasão celular e migração ensaios in vitro

BIU e T24cells transfectadas com plasmídeos pcDNA3.1-SATB1, pGenesil2 vector contendo shRNA específica-SATB1, bem como o vector de controlo negativo foram adicionadas ao compartimento superior das placas Transwell com filtros de policarbonato de 6,5 mm e o tamanho de poro 8.0μm (Corning Costar, MD, EUA). Isto foi feito em 100 uL de meio isento de soro e 500 ul de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS. Para os ensaios de invasão de células, as inserções Transwell de filtro foram revestidas com 50 uL de Matrigel (BD Biosciences, NJ, EUA). Após incubação durante 12 h a 37 ° C, 5% de CO

2 atmosfera, as células tumorais que penetraram a parte inferior da membrana de inserção foram fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal (Boster Ltd., Wuhan, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, as células coradas invasivos foram contadas sob um microscópio de luz em 10 campos seleccionados aleatoriamente em 200 × ampliação. Para os ensaios de migração de células, as células transfectadas foram semeadas em câmaras superiores sem revestimento de Matrigel. Após incubação durante 12 h a 37 ° C, 5% de CO

2 atmosfera, as células que migraram nos lados de baixo da membrana de filtro foram fixadas e coradas com violeta de cristal a e, em seguida, contados e analisados ​​como descrito acima. Três poços replicados foram testados por ensaio, e cada experiência foi realizada em triplicado. Espectrofotómetro foi utilizado para medir a densidade óptica a 560 nm, e a capacidade de invasão de células foi calculada utilizando a percentagem das células que penetraram os filtros revestidos com Matrigel.

ciclo celular e análise de proliferação

para validar os efeitos de SATB1 sobre o ciclo celular, a citometria de fluxo foi usada para a análise da percentagem de células em cada fase do ciclo celular após coloração das células com iodeto de propídio (PI) (Keygentec, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, as células BIU e T24 foram ressuspensos em PBS gelado e fixadas com 70% de etanol em gelo. Em seguida, os poços fixas foram coradas com PI solução durante 30 min e analisadas por citometria de fluxo

CCK-8 ensaio de proliferação celular (kit de CCK-8; Boster Ltd., Wuhan, China). Foi utilizado para detectar a célula as taxas de crescimento de acordo com as instruções do fabricante. Em, as células breves estabelecidos SATB1-knockdown T24 e SATB1-sobre-expressam BIU-87 células em 4 × 10

3 por poço foram semeadas em placas de 96 poços de fundo plano, e incubou-se durante 48 h a 37 ° C, numa 5% de CO

2 atmosfera. Para a quantificação da viabilidade das células, as células foram incubadas com uma solução de CCK-8 (10 ul /poço) durante 1,5 h a 37 ° C. Em seguida, os valores de absorvância de células tumorais foram medidos a 450 nm nos pontos de tempo indicados utilizando um leitor de microplacas (Bio-Rad, Tóquio, Japão). Três poços replicados foram testados por ensaio, e cada experiência foi realizada em triplicado.

A apoptose ensaio

Para detectar os efeitos de SATB1 em apoptose celular, citometria de fluxo foi realizada para analisar a taxa apoptotics usando Anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (Keygentec, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Em resumo, as células T24 BIU e transfectadas com plasmídeos de pcDNA3.1-SATB1 e pGenesil2 vector contendo shRNA específica-SATB1, bem como o vector de controlo negativo foram plaqueadas em placas de 6 poços e cultivadas durante 24 horas. Em seguida, as células (1×10

6) foram coradas com anexina-V e PI e as células em apoptose foram determinadas pelo kit de detecção de apoptose anexina V-FITC e avaliada utilizando um instrumento FACSCalibur.

A análise estatística

os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Três poços replicados foram testados por ensaio, e cada experiência foi realizada em triplicado. As comparações estatísticas entre os grupos foram determinados pelo aluno

t

-teste. A análise da tabela Cruz foi realizada utilizando qui-quadrado (χ

2) de Pearson ou teste exato de Fisher para analisar a significância de correlações entre a expressão SATB1 e as características clinicopatológicas de câncer de bexiga. Curvas de Kaplan-Meier foram utilizadas para estimar a relevância prognóstico de SATB1 numa análise univariada. A análise multivariada foi realizada utilizando um teste de COX riscos proporcionais. Todos os dados foram analisados ​​usando SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Todos os testes estatísticos foram bicaudais e significância estatística foi considerada para p 0,05.

Resultados

SATB1 é regulado para cima em tecidos BTCC humanos e linha celular de cancro da bexiga com elevado potencial metastático

Para investigar se a expressão anormal de SATB1 está relacionada com desenvolvimento e progressão do cancro da bexiga e também envolvido na regulação de EMT no cancro da bexiga humana, imuno-histoquímica, em tempo real de RT-PCR e análise de mancha western foram inicialmente realizados para identificar a expressão de SATB1. Além disso eles foram usados ​​para analisar a E-caderina e vimentina em 126 amostras de tecido de câncer de bexiga humana, correspondendo a tecidos normais adjacentes e linhas celulares de cancro da bexiga, respectivamente. foram encontrados os níveis de SATB1 e vimentina expressão a ser significativamente regulada para cima no mRNA e os níveis de proteína nos tecidos NMIBC e CINM em comparação com aqueles em corresponder espécimes não neoplásicas adjacentes (Fig 1A e C;. * P 0,05; ** P 0,001). Nós também descobrimos que houve mudanças notáveis ​​nos níveis de SATB1 e vimentina entre NMIBC e CINM tecidos, que revelaram expressão que os tecidos CINM apresentaram níveis mais elevados de SATB1 e vimentina do que em tecidos NMIBC (Fig 1A e C;. * P 0,05). Os níveis de SATB1 RNA e proteínas de expressão foram significativamente mais elevados em linhas celulares de tumor metastático (T24) do que na linha celular tumoral não metastática (BIU-87) (Figura 1A e C;. ** P 0,001), sugerindo SATB1 expressão foi associada com fenótipos de tumor agressivo. Além disso, a expressão de vimentina foi surpreendentemente sobre-regulada em níveis de RNA e proteína em linha de células T24 em comparação com aqueles em linhas celulares BIU-87 (Fig 1A e C;. * P 0,05). Por outro lado, a expressão de E-caderina foi marcadamente baixa ou perdido no mRNA e os níveis de proteína nos tecidos NMIBC, tecidos CINM e alta metastático T24 linha de células de tumor, mas significativamente alta em corresponder espécimes não neoplásicas adjacentes e linha BIU-87cell (Fig. 1A e C; * P 0,05, ** P 0,001). Foram obtidos resultados semelhantes por análise de coloração imuno-histoquímica para a detecção de SATB1, E-caderina e vimentina, que mostrou que SATB1 foi predominantemente localizada nos núcleos do tecido de cancro da bexiga, com imunorreactividade baixo em tecidos normais da bexiga (fig. 1B). No entanto, vimentina foi encontrado para ser predominantemente manchado na membrana plasmática de tecidos de câncer de bexiga, com uma perda de ou baixa de coloração E-caderina (Fig. 1B). Entre os doentes com cancro da bexiga preliminares com expressão SATB1 positivo exibido expressão de E-caderina perdido ou baixo, mas a alta expressão de vimentina. Em contraste, os pacientes SATB1-negativos apresentaram forte coloração E-caderina, mas a coloração luz da vimentina (Fig. 1D), o que sugere uma forte correlação positiva entre SATB1 e marcadores de EMT no BTCC.

As manifestações de níveis de mRNA de SATB1, e-caderina e vimentina em tecidos de carcinoma de bexiga humana e duas linhas celulares de carcinoma da bexiga foram avaliadas por RT-PCR quantitativo (a; * P 0,05, ** P 0,001). IHC coloração de tecidos de carcinoma de bexiga humana e correspondentes tecidos não-cancerosas adjacentes para SATB1, E-caderina e vimentina foi realizada. SATB1 coloração foi observada nos núcleos de células cancerosas da bexiga, vimentina verificou-se ser predominantemente corados em membrana plasmática de células de cancro da bexiga, mas a coloração de E-caderina foi observada principalmente na membrana plasmática de células não-cancerosas da bexiga (B); amostras de cancro de bexiga com SATB1-positivos foram coradas com vimentina mas não caderina-E. No entanto, as amostras tumorais com SATB1-negativos foram coradas com a E-caderina, mas não vimentina (D). A ampliação original 400x × (B e D). Os níveis de proteína de SATB1, E-caderina e vimentina foram analisados ​​por Western blot (C). As barras de erro indicam �e.p.m, n = 3 experimentos.

A superexpressão de SATB1 está associado com os parâmetros clínico e correlaciona-se com mau prognóstico

As relações entre expressão SATB1mRNA e fatores clínico-patológicos foram investigados. Como mostrado na Tabela 1, de expressão elevada de SATB1 foi significativamente associado com a idade (≥55 versus 55, p = 0,034), a profundidade do tumor primário de invasão (T1 + T2 vs T3 + T4, P 0,001), TNM stage (estágios I + II vs. estágios III + IV, P = 0,015), presença de metástases em linfonodos (P = 0,013) e presença de metástases à distância (P = 0,012). No entanto, não foram detectadas diferenças significativas entre a expressão elevada SATB1 e ambos os sexos (masculino versus feminino, P = 0,143) ou diferenciação tumoral (G1 versus G2 + G3, P = 0,111). A análise de Kaplan-Meier foi realizada para determinar a significância prognóstica de SATB1. Como mostrado na Fig. 2, a análise revelou uma correlação entre os níveis mais elevados e tempos de sobrevivência SATB1expression global menor (p 0,001). Além disso, a análise de regressão de Cox multivariável confirmou que a expressão SATB1 é um factor de prognóstico significativo e independente para o carcinoma de células de transição da bexiga humana após o ajuste para outros factores, como mostrado na Tabela 2 (P = 0,005).

A-5 anos taxa de sobrevida global em pacientes com expressão alta SATB1 foi significativamente pior do que aqueles com baixa expressão SATB1 (P 0,001; teste log-rank)

a expressão ectópica de SABT1 induz EMT em uma estabelecido. linha de células de cancro humano, aumentando a sua capacidade invasiva

estudos anteriores ligaram SATB1expression com a transição epitelial-mesenquimal (EMT) [21,24]. Para testar se a expressão ectópica de SATB1 poderia induzir EMT em células tumorais não metastáticas, a linha celular de cancro da bexiga humano (BIU-87), com uma expressão muito baixa SATB1 foi transfectado com plasmídeos de expressão pcDNA3.1-SATB1 para estabelecer uma estável SATB1 que sobre-expressam a linha de células tal como descrito em material e Métodos. Os resultados em tempo real de RT-PCR e transferência de Western mostrou que SATB1 ARNm e os níveis de proteína do grupo transfectadas aumentou significativamente em comparação com o grupo não transfectadas e o grupo de controlo de vector-transfectadas (Figura 3A;. ** P 0,001). No entanto, não houve mudanças notáveis ​​na expressão de SATB1 no grupo transfectado-vector grupo controle e não transfectadas (P 0,05). Resultados semelhantes podem ser obtidos por análise de imunofluorescência para a detecção de SATB1 (Fig. 3C). Curiosamente, verificou-se que a transfecção de células BIU-87 provocou um aumento significativo de Snail e espaçador (ARNm e proteína) e uma indução concomitante de vimentina (ARNm e proteína). Os níveis de ARNm da expressão de E-caderina foram diminuiu após transfecção de plasmídeos de expressão pcDNA3.1-SATB1 (Fig 4A;. P 0,05). No entanto, não houve alterações notáveis ​​na expressão da proteína E-caderina entre o vector de controlo e o grupo pcDNA3.1SATB1 (Figura 4B;. P 0,05). Só havia uma tendência para a redução na expressão da proteína caderina-E, e o efeito inibido não foi tão acentuada porque a inibição pode ser pós-translacional.

A expressão SATB1 de células BIU-87 e células T24 transfectadas com pcDNA3.1-SATB1 e pGenesil2-SATB1-shRNA foram examinados por qRT-PCR e western blot (A e B; ** P 0,001). Não-transfectadas células BIU-87 foram usados ​​como grupo de controlo. células T24 tratados com pGenesil2 vetor de controle que não visam qualquer gene específico foram usados ​​como os grupos de controle. Análise por imunofluorescência foi realizada para detectar a SATB1staining em cada grupos de células. imagens de imunofluorescência em 200 × ampliação (C e D). As barras de erro indicam SEM, n = 3 experimentos

A expressão de Caracol e Slug, dois inibidores da caderina-E, eo vimentina mesenquimais marcador foram regulados positivamente após expressão SATB1 foi reforçada (A;. ** P 0,001). Os níveis de ARNm da expressão de E-caderina foram diminuiu após transfecção de plasmídeos de expressão pcDNA3.1-SATB1 (A; P 0,05). Houve uma tendência para a redução da expressão da proteína E-caderina em BIU-87 células com expressão reforçada SATB1 (B; P 0,05). Depois de expressão SATB1 foi silenciada com SATB1 shRNA em células T24, a expressão de Snail, Slug e marcadores mesenquimais vimentina foi reprimidos. A expressão do marcador epitelial, E-caderina, foi regulado positivamente em comparação com células não transf ectadas e as células transfectadas com vector de controlo (C e D; * P 0,05; ** P 0,001). Não houve mudanças notáveis ​​nas expressões de ZEB1, ZEB2 e torção, outros inibidores conhecidos de E-caderina, em BIU-87 com células de expressão e T24 SATB1 reforçados com expressão SATB1 reduzida, respectivamente.

no entanto, não houve mudanças notáveis ​​na expressão de ZEB1, ZEB2 e twist, que conhecido como outros inibidores da caderina-e, nos três grupos de células (P 0,05).