Abstract

O cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer, tanto para homens e mulheres. O diagnóstico precoce do cancro do pulmão tem uma taxa de sobrevida em 5 anos de 48,8%, no entanto, quase 35% dos pacientes em estágio I recaídas após a ressecção cirúrgica, pressagiando assim um mau prognóstico. Portanto, a detecção de cancro de pulmão na fase inicial e identificar ainda mais os pacientes de alto risco iria permitir a oportunidade de proporcionar uma terapia adjuvante e possivelmente aumentar a sobrevivência. Existe evidência considerável de que o sistema imunitário produz uma resposta de auto-anticorpos às células neoplásicas. A detecção de tais anticorpos foi mostrado para ter valor diagnóstico e prognóstico. Aqui aproveitamos a técnica de alto rendimento Luminex multiplex um total de 14 auto-antígenos associados a tumores para detectar a auto-anticorpos do soro pacientes. Os antigénios foram expressos 14 por transcrição in vitro /sistema de tradução com HaloTag no N-terminal. As proteínas de fusão foram então covalentemente imobilizado sobre as microesferas Luminex conjugados pelo ligando halo-ligação, eliminando, assim, o procedimento de purificação de proteínas. As amostras de soro de doentes com cancro e controlos saudáveis ​​foram interagiu com o complexo antigénio-microesfera para medir os auto- anticorpos. Nós desenvolvemos um sistema de detecção multiplex rápido para medir a assinatura de auto-anticorpos a partir de soros de doentes com reacção cruzada mínima. Um painel de sete biomarcadores de auto-anticorpos gerou uma AUC 80% em distinguir os cancros do pulmão de controles saudáveis. Este estudo é o primeiro relatório, combinando plataforma Luminex e tecnologia HaloTag para detectar a resposta imune humoral em pacientes com câncer. Devido à flexibilidade da tecnologia Luminex, esta abordagem pode ser aplicada a outras condições, tais como infecciosas, doenças neurológicas, e doenças metabólicas. Pode-se prever que este sistema Luminex multiplex, bem como o painel de sete marcadores biológicos podem ser utilizados para pesquisar a população de alto risco com CT teste subsequente com base no resultado do teste de sangue

citação:. Jia J, Wang W , Meng W, Ding M, Ma S, Wang X (2014) Desenvolvimento de um auto-anticorpos Teste Multiplex para detecção de câncer pulmonar. PLoS ONE 9 (4): e95444. doi: 10.1371 /journal.pone.0095444

editor: Nupur Gangopadhyay, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de outubro de 2013; Aceito: 27 de março de 2014; Publicação: 22 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Jia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo National Natural Science Foundation (81172072), a Fundação Ciência para Distintos Jovens Pesquisadores (R2101405), o Programa de Desenvolvimento de Infra-estrutura e Facilidade de Ciência e Tecnologia Departamento da Província de Zhejiang (2011F10015), principal da ciência e do Projeto de Inovação Tecnológica de Hangzhou ( 20112313A01), China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer, tanto para homens e mulheres em todo o mundo. Em 2012, estimava-se que 226,160 pessoas seriam diagnosticadas com cancro do pulmão e 160,340 pacientes que morrem de sua doença. A taxa de sobrevivência atual de 5 anos global para os pacientes é de 16% até 2007, entre os mais baixos de todos os cânceres, o que melhorou apenas marginalmente na última década [1]. A maioria dos pacientes com câncer de pulmão são diagnosticados nos estágios tardios /distante, portanto, com baixa taxa de sobrevivência, devido à falta de sintomas perceptíveis na fase inicial de desenvolvimento de neoplasias [2].

Os dados sugerem que o diagnóstico de câncer de pulmão quando se é pequena e definida localmente pode aumentar a possibilidade de cura [3], [4]. O diagnóstico precoce do cancro do pulmão poderia melhorar significativamente a taxa de sobrevivência de 5 anos até 48,8% em comparação com 3,3% de fase tardia /distante [5]. Portanto, a detecção de câncer de pulmão em estágio inicial e a identificação de pacientes de alto risco iria fornecer terapia adjuvante potencial e, possivelmente, aumentar a sobrevida.

Os métodos atuais para o diagnóstico de câncer de pulmão exigir uma biópsia e exame patológico da tecido normalmente após a descoberta da lesão na radiografia de tórax ou tomografia computadorizada. Atualmente, não há exame de sangue disponível para o cancro do pulmão. Várias abordagens foram desenvolvidas para identificar biomarcadores para o diagnóstico de cancro do pulmão [6], [7]. Entre estes, o sistema imunitário ter sido mostrado para produzir auto-anticorpos contra células neoplásticas, bem como os antigénios associados a tumores desregulados [8], [9], por conseguinte, a detecção de tais auto-anticorpos têm valor diagnóstico e prognóstico [10], [11]. Mais importante, as respostas imunitárias humorais existem vários meses ou anos antes dos sintomas clínicos, assim, os auto-anticorpos poderiam ser utilizados para o diagnóstico precoce de doentes com cancro [7], [9], [12]. Além disso, é relatado que células B e anticorpos associados às células B promover carcinogénese de novo [13], sugerindo que a resposta imune humoral pode desempenhar um papel directo na progressão do cancro.

(1) Os HaloTag amina Ligandos Luminex foram conjugados com contas magnéticas por meio do ácido carboxílico activado de grupo radical COOH. cor diferente representa vários tipos de contas Luminex. (2) As proteínas recombinantes halo-tag foram covalentemente imobilizada sobre as pérolas de Luminex conjugado com o ligando por meio de ligantes HaloTag cloroalcano reactivos no ligandos. Cada grânulo foi imobilizado com a proteína diferente separado. (3) – (4) devido à ligação covalente, cada complexo talão de proteínas individualmente atravessou vigorosamente lavagem e então combinados para fazer a piscina microesfera. (5) A piscina microesfera acoplado à proteína foi então igualmente aliquotado em uma placa de 96 poços. Cada poço contém múltiplos biomarcadores de auto-antigénios e pode ser usado para uma única amostra de soro. (6) Os auto-anticorpos nos soros ligada às microesferas antígeno conjugado, e foram detectadas por anticorpo anti-humano de R-ficoeritrina conjugada. O sinal foi lido no Luminex 200 Bioanalyzer.

Neste estudo, descrevemos um sistema de diagnóstico não-invasivo na plataforma Luminex xMAP para detectar auto-anticorpos no soro para diagnóstico de câncer de pulmão. Os auto-antigénios candidatos foram seleccionados a partir da literatura e expressa pelo sistema in vitro de transcrição /tradução utilizando HaloTag no N-terminal. Sem purificação, as proteínas recombinantes foram covalentemente imobilizada sobre esferas Luminex. As amostras de soro foram incubadas com o complexo auto-antigénio-grânulo para medir a quantidade de auto-anticorpos. Um painel de sete antigénios, isto é, p53, NY-ESO-1, vivendo, Ubiquilin1, BIRC, p62 e PRDX, foram utilizados num modelo de estatística multivariada para distinguir doentes de cancro de controlos saudáveis. Este é o primeiro estudo de detectar auto-anticorpos multiplex em tecnologia Luminex.

Materiais e Métodos

Expressão de proteínas recombinantes

O cDNAs por 14 auto-antígenos foram clonados no vector Flexi ( Promega, EUA) com um HaloTag no N-terminal. O halo proteínas marcadas com recombinantes foram expressas pelo sistema in vitro de transcrição /tradução (Promega). A proteína HaloTag também foi produzido como proteína negativo. As proteínas foram detectadas por Western blot utilizando anticorpo de coelho anti-HaloTag (Promega).

Western Blot Assay

halo marcado proteínas recombinantes foram expressas pelo

in vitro

transcrição /tradução sistema e, em seguida, submetido para a Western Blot. Em resumo, um total de lisado de proteína de 3 ul foi carregada 12% de SDS-PAGE, em seguida, transferidas electroforeticamente para uma membrana de PVDF (GE). O lisado de proteína com a proteína HaloTag única (31 kDa) estava a ser carregada como controlo. Após o bloqueio, as membranas foram transferidas com o anticorpo de coelho anti-HaloTag (Promega), seguido por incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Proteintech). Os sinais de proteína foram detectados por ECL reagente (GE), e fotografadas usando Alpha Innotech Fluor Chem FC2 sistema de análise de imagem de quimiluminescência (Alpha Innotech).

As amostras de soro de pacientes

O estudo foi aprovado pelo institucional Conselho de Zhejiang Academia de Ciências Medicina Review. Todos os participantes que forneceram soros foram dadas consentimentos informados por escrito.

Os pacientes com cancro do pulmão localizada foram coletados no Departamento de Oncologia, o hospital primeiras das pessoas Hangzhou a partir de agosto de 2010 a março de 2012. Um total de 117 amostras de pacientes atendidas os seguintes critérios de elegibilidade para este estudo: 1) por câncer de pulmão clinicamente localizado comprovada por biópsia, 2) ausência de terapia do câncer pulmonar prévia, 3) data de soro desenhada era imediatamente anterior à data da cirurgia, 4) sem outras doenças malignas concorrentes e auto-imune doenças. Destes 117 amostras, as amostras 44 foram escolhidos ao acaso para ser utilizado no desenvolvimento e validação de plataforma Luminex, enquanto que 25 amostras foram utilizadas para a selecção biomarcador, eo restante 48 amostras foram utilizadas para a análise multiplex de biomarcador. Da mesma forma, para servir como sujeitos de controlo, o hospital forneceu 110 amostras de soro na faixa etária de 29-76, sem histórico de câncer coletados entre 2011 e 2012. Estes 110 amostras também foram divididos aleatoriamente em três grupos neste estudo, especificamente 35 amostras para o desenvolvimento Luminex, 25 amostras para a seleção de biomarcadores e 50 amostras para análise multiplex.

Conjugação do HaloTag Amine Ligand para Luminex microesfera

a quantidade mínima de HaloTag Amine (O4) Ligand (Promega, EUA) para a máxima eficiência da conjugação sobre as microesferas Luminex (Luminex Corp) foi determinada como se segue. Um total de 5 × 10

6 Luminex microesferas magnéticas foram conjugados com uma série de diluição de HaloTag Amina Ligando: 0,0016 mg, 0,008 mg, 0,04 mg, 0,2 mg, 1 mg. Resumidamente, as microesferas foram suspensas numa solução de 100 MES mmol /L (pH 6,0), contendo 5 mg /mL de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (Thermo Scientific) e HaloTag amina ligando. Após uma incubação de 2 horas no escuro, as microesferas foram lavadas e ressuspensas em 100 MES mmol /L (pH 4,5), e armazenadas a 4 ° C.

As microesferas acopladas com Luminex HaloTag ligando foram incubadas com HaloTag proteína purificada em uma série de diluição de 0 ug a 5 mg. A MFI (intensidade de fluorescência média) representa o sinal de ligação e foi detectado pelo anticorpo anti-HaloTag.

Desenvolvimento e Validação da proteína-microesfera Complexo

O complexo ligando-microesfera em diferentes regiões do grânulo incubou-se separadamente com as proteínas de fusão recombinantes HaloTag à temperatura ambiente no escuro durante 60 minutos. Após a incubação, as microesferas foram lavadas com PBS contendo 0,1% de BSA e 0,5% de Tween 20, e ressuspensas em PBS contendo 0,1% de BSA para validação.

A quantidade de proteína conjugada com a microesfera foi medido utilizando um anticorpo comercial ( anticorpo anti-p62 de coelho, anticorpo de coelho anti-p53, Santa Cruz) contra cada proteína alvo. Resumidamente, diluições em série de cada anticorpo (que varia de 0 a 5 ug /ml em PBS, 1% de BSA) foram incubadas com microesferas 3.000 conjugados com proteínas diferentes numa placa de 96 poços durante 1 hora. A seguir à lavagem com PBS /BSA a 1%, as microesferas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com R-ficoeritrina durante 30 minutos. O complexo resultante foi novamente lavadas e ressuspensas em PBS /BSA a 1% antes de ler em Luminex 200 Bioanalyzer (Luminex Corp). O valor MFI representa o sinal de ligação.

Para testar a capacidade de detecção do sistema Luminex, 44 câncer e 35 amostras de soros de controlo de saúde foram selecionados aleatoriamente, eo NY-ESO-1 de auto-anticorpos foi medida pelo sistema Luminexe. Resumidamente, microsferas de diferentes conjugados com proteína recombinante NY-ESO-1 e separadamente HaloTag foram combinadas e divididas em alíquotas para uma placa de 96 poços. As amostras de soro foram diluídas a 1:200 em PBS /BSA a 1% e incubada com as pérolas durante a noite a 4 ° C com agitação. Os sinais de auto-anticorpos foram então detectado por R-ficoeritrina conjugada com anticorpo policlonal anti-humano (Rockland) durante 0,5 horas com agitação constante. Depois de três lavagens, o complexo de reacção foi ressuspenso em PBS /BSA a 1% para leitura em Luminex 200 Bioanalyzer. Os valores de MFI foram representados por MFI (NY-ESO-1) menos MFI (HaloTag).

As intensidades de fluorescência foram também comparados com um kit de ELISA comercial (Biovalue, EUA). O experimento foi realizado de acordo com a instruções do fabricante.

A detecção de auto-anticorpos no soro

Diferentes microesferas conjugados com proteínas recombinantes e HaloTag separadamente foram combinadas e divididas em alíquotas para uma placa de 96 poços para detectar a de auto-anticorpos no soro. As amostras de soro foram diluídas a 1:200 em PBS /BSA a 1% e incubada com as pérolas durante a noite a 4 ° C com agitação. Os sinais de auto-anticorpos foram então detectadas por Luminex como descrito anteriormente.

Análise Estatística

Foram realizadas análises Ambos uni e multivariada. As diferenças entre os dois grupos foram avaliadas pelo teste t de Student. A correlação entre os sistemas single-complexas e multi-complexos ou entre ELISA e Luminex sistema de single-plex foram avaliadas pelo coeficiente de correlação de Pearson (R). previsão classe foi examinada usando o pacote BRB-array Tools (versão 3.6), disponível em https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html. Todos os cálculos foram realizados utilizando linguagem de programação R estatística (https://cran.r-project.org/) e os pacotes de bioconductor. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS 13.0 (SPSS), GraphPad Prism 5.0, e Excel. p 0,05 foi considerado estatisticamente significante

Resultados

A abordagem geral do estudo é representado na Fig.. 1 |

De modo a imobilizar covalentemente as proteínas recombinantes para a microesfera Lumimex, o ligando amina foi conjugado HaloTag primeiro às microesferas Luminex através do ácido carboxílico activado de grupo radical COOH em diferentes concentrações (Fig. 2A). A eficiência de acoplamento aumentada de uma maneira dependente da concentração, tal como detectado por HaloTag proteína padrão (Fig. 2A). Além disso, a IMF alcançado ao patamar de 0,2 mg e 1 mg de ligando amina, indicando a saturação do ligando amina na superfície do grânulo. Neste estudo, 0,2 mg de ligando foi utilizado para conjugar a microesfera.

(A) Titulação do HaloTag amina ligando conjugado sobre as microesferas Luminex. A proteína padrão HaloTag purificado foi utilizado para detectar a eficiência da conjugação de uma série de concentrações. O MFI (intensidade de fluorescência média) representa o sinal de ligação detectado pelo anticorpo anti-HaloTag. (B) Validação do complexo microesfera juntamente com Luminex HaloTag amina ligando. Os grânulos Luminex foram acoplados com 0,2 mg do HaloTag ligando e os sinais foram detectados por (A).

A microesfera Luminex conjugado de 0,2 mg do ligando amina foi ainda confirmada usando proteína padrão diferente em HaloTag concentração. Os dados demonstraram que a máxima IMF mesmo a 1,25 ug de proteína padrão que demonstra a condição de conjugação óptima (Fig. 2B).

Para rastrear rapidamente os auto-antigénios candidatos, um painel de 14 proteínas foi expressa por

in vitro

sistema de transcrição /tradução. Depois de confirmada por Western blot (Fig. 3A), as proteínas de fusão recombinantes com o HaloTag foram directamente incubadas com o complexo de microsferas de ligando sem a purificação de proteínas. A ligação covalente entre HaloTag e formas de ligando-se rapidamente sob condições fisiológicas em geral e é altamente específica e essencialmente irreversível, dando origem a um complexo que é estável mesmo sob condições rigorosas. A quantidade de proteína imobilizada para a microesfera Luminex indivíduo foi, em seguida, examinado usando os anticorpos comerciais contra as proteínas do antigénio correspondente. Como mostrado na Fig. 3B, os sinais de MFI foram medidos de um modo dependente da concentração detectada por anticorpos anti-p62 e anti-HaloTag.

(A) O Western Blot representativa dos auto-antigénios recombinantes com HaloTag no terminal-N expresso pela in vitro transcrição /sistema de tradução. (B) A validação das microesferas Luminex juntamente com as proteínas recombinantes HaloTag. As proteínas imobilizados foram detectados por anticorpos anti-p62 e anti-HaloTag separadamente e os sinais foram de uma forma dependente da concentração. (C) Comparação do NY-ESO-1 em soros de auto-anticorpos detectados por ELISA e Luminex. Um total de 44 cancros do pulmão e 35 controlos saudáveis ​​foram seleccionados aleatoriamente para comparar o NY-ESO-1 de auto-anticorpos medido pelo sistema Luminex e ensaio de ELISA. R

2 = 0,92 indica a alta correlação entre plataformas Luminex e Elisa na detecção de NY-ESO-1 de auto-anticorpos.

Para investigar se o sistema Luminex pode detectar o auto-anticorpos da espécie humana, 44 de pulmão cancro e 35 amostras de soros saudáveis ​​foram seleccionados aleatoriamente e o NY-ESO-1 de auto-anticorpos foi comparada utilizando o sistema Luminex e um kit de ELISA comercial (Biovalue, EUA). Ambas as plataformas de ensaio detectada a maior quantidade significativa do NY-ESO-1 de auto-anticorpos em pacientes com cancro em comparação com controlos saudáveis ​​(Fig. 3C). A análise de regressão linear Unário revelou que o coeficiente de correlação (r Pearson) foi de 0,92 para o NY-ESO-1 anticorpos medidos por ambas as técnicas de Luminex e ELISA, o que sugere que dois métodos tinham um elevado grau de concordância na detecção de NY-ESO-1 de auto-anticorpos (

p

. 0,01)

a seguir, desenvolveu o sistema Luminex multiplexado. Quatro complexos proteína de microesfera (NY-ESO-1, p53, p62, e PRDX), bem como um talão de conjugado HaloTag como controlo de referência foram igualmente combinadas e distribuídas numa placa de 96 poços. O anticorpo anti-p53, foi usada para detectar a microesfera de p53 neste sistema de multiplex. Os dados mostraram que os sinais de MFI foram altamente correlacionados com os do sistema de grânulo indivíduo (-Plex único) (Fig. 4A), demonstrando o sistema de multiplex é válido para a detecção de auto-anticorpos. Além disso, com excepção da microesfera p53, incluindo todas as outras microesferas NY-ESO-1, p62, PRDX produzidos os sinais de fundo, indicando que não havia reactividade cruzada entre os grânulos neste sistema multiplex (Fig. 4B).

(a) Comparação das pérolas de p53 acoplado de singleplex (grânulo individual) e o sistema de multiplex (múltiplos grânulos). O valor MFI foi detectado por uma série de diluição de anticorpo p53. (B) Não reatividade cruzada entre diferentes biomarcadores no sistema multiplex. Um sistema de multiplex contendo cinco microesferas acopladas com NY-ESO-1, p53, p62, e PRDX HaloTag separadamente foi incubada com o anticorpo p53 e p53 apenas as microsferas feito reagir com anticorpo anti-p53, enquanto outras microesferas detectados os valores de MFI de fundo. (C) A correlação do sinal das microesferas p53 no sistema singleplex e multiplex. (D) O mesmo que (C), mas utilizando p62 acoplado microesferas.

A seguir, procurou testar a correlação de ambos os sistemas Luminex single e multi-complexos, comparando os sinais de auto-anticorpos de amostras de soro selecionados aleatoriamente detectado por ambos os sistemas separadamente. Como mostrado na Fig. 4C e a Fig. 4D, o coeficiente de correlação (r de Pearson) foi de 0,84 para a microesfera p53 (

P

0,01), enquanto que 0,81 para a microesfera de p62 (

P

0,01), A r Pearson também estava acima de 0,80 para outros complexos proteína de microesfera (dados não mostrados) indicando a elevada correlação entre os sistemas de uma e de multi-plex.

Baseado no sistema Luminex multiplex, nós analisamos um painel de auto-antigénios candidatos a 14 detectar os anticorpos circulantes por câncer de pulmão 25 independentes e 25 controles saudáveis ​​selecionados aleatoriamente a partir da coorte amostra deste estudo. Sete auto-antígenos, incluindo p62, BIRC, vivendo-1, p53, PRDX, NY-ESO-1 e Ubiquilin, produziu os sinais notavelmente mais elevados das IFM em pacientes com câncer de pulmão em comparação com controles saudáveis ​​(Mann-Whitney p valor 0,05) (Fig . 5).

a seguir, determinou se o painel de 7 biomarcadores poderia ser usado para a detecção não invasiva de pacientes com câncer de pulmão. Foram triados 48 cancros do pulmão independentes e amostras de soro 50 de controlo com vários tipos de câncer de pulmão e etapas por o sistema multiplex Luminex. Os parâmetros básicos dos 48 pacientes com câncer e 50 controles estão resumidos na Tabela 1, incluindo idade, sexo, tabagismo e estado de beber. Após a separação em classes e controlo do cancro, a precisão da previsão de desfecho binário foi estimada utilizando diferentes algoritmos de aprendizado de máquina disponíveis no BRB Ferramentas Matriz. o valor de cada amostra para cada um desses 7 biomarcadores foi multiplicado pelos coeficientes correspondentes derivados de regressões logísticas univariadas no conjunto de treinamento com câncer /controle como uma variável resposta binária, em seguida, os valores foram totalizados. As pontuações de índice criados foram então avaliados pela curva ROC, que forneceu um índice puro da precisão de um teste traçando a sensibilidade contra 1- especificidade para cada valor do resultado do teste. Três algoritmos de previsão foram usadas para gerar o ROC, incluindo composto preditor covariável (PCC), na diagonal análise discriminante linear (DLDA), e o composto Bayesiana preditor covariável (BCCP). Notavelmente, a análise proporcionou um ROC muito semelhantes para todos os três algoritmos com AUC de 0,82 (PCC), 0,81 (DLDA), 0,81 (BCCP), respectivamente (Fig. 6), o que demonstra a forte poder discriminativo dos 7 marcadores. Nenhuma correlação com a idade, sexo, observou-se fumar ou beber status para este painel de biomarcador.

Discussão

A detecção dos anticorpos circulantes contra antígenos associados tumor é uma abordagem promissora para o diagnóstico precoce do câncer, e as tecnologias têm sido amplamente desenvolvido [14], [15]. Até à data, ELISA é o método convencional para a detecção de autoanticorpos no soro, mas a sua aplicação na assinatura de auto-anticorpos de multiplexação é limitada. Recentemente, foram adoptadas tecnologias de microarray proteína e Luminex xMAP para medir o painel sorológico de autoanticorpos [16], [17].

Luminex xMAP é um elevado durante todo plataforma com sensibilidade superior e especificidade de ELISA [18], [19 ], [20]. Neste estudo, foi descrito um método simples Luminex com base na tecnologia HaloTag para detectar os auto-anticorpos a partir de soros de doentes. As proteínas HaloTag foram covalentemente ligados aos ligantes cloroalcano conjugados com as microesferas [21], [22]. Devido à ligação covalente específico, os lisados ​​de proteína de fusão halo-marcados matérias são selectivamente imobilizado para os grânulos Luminex e, subsequentemente, passar por passo de lavagem vigorosa, saltando, assim, o procedimento de purificação de proteínas enfadonho.

Está bem estabelecido que a multiplexação biomarcadores individuais (ou seja, de auto-anticorpos profiling) poderia aumentar significativamente a sensibilidade e especificidade de biomarcadores de câncer em discriminar os pacientes com câncer de controles saudáveis ​​[23]. O objetivo deste estudo foi o de tirar proveito da técnica Luminex multiplex um painel de 14 auto-antígenos associados a tumores na detecção de pacientes com câncer de pulmão. Estes auto-antigénios foram seleccionados com base no seu desempenho em distinguir cancros de controlos saudáveis ​​descritos na literatura. Por exemplo, auto-anticorpos de p53 foi detectada em cerca de 15% dos doentes com cancro [24], [25]. Ubiquilin 1 foi encontrado para ser um biomarcador promissor para o cancro do pulmão com uma AUC de mais de 0,7 [26]. Vivendo-1 de auto-anticorpos foi relatado em 19 de 37 pacientes com câncer de pulmão (51,3%) [27]. Além disso, 25 (47%) de 53 doentes com NSCLC foram testados positivos para auto-anticorpos contra os soros PRDX em [28]. Auto-anticorpos para NY-ESO-1, BIRC e p62 também foram detectados em pacientes com câncer de pulmão com 20%, 19,5% e 18,8% de sensibilidade, respectivamente [29], [30], [31].

Multiplex da antigénios associados a tumor tem sido amplamente explorados por ELISA, [33], [34], [35], [36] [32] ou de microarray [37]. Este estudo é o primeiro relatório, combinando plataforma Luminex e tecnologia HaloTag para detectar a resposta imune humoral em pacientes com câncer de pulmão. O painel de 7 biomarcadores alcançado sobre exatidão de 80% na detecção de câncer de pulmão a partir de controles saudáveis. Esses auto-anticorpos, no entanto, não têm associação com a histologia do tumor, etapas e tipos devido ao limite de tamanho da amostra. Portanto, estudo de seguimento serão necessários em um grande grupo de pacientes com uma mistura de tipos de tumores e estágios para validar o desempenho dos auto-anticorpos em toda a histologia do tumor e tipos, em especial, a correlação entre malignidade da doença e o título de auto-anticorpos. Pode-se prever que este sistema Luminex multiplex, bem como o painel de sete marcadores biológicos podem ser utilizados para pesquisar a população de alto risco com CT teste subsequente com base no resultado do teste de sangue.

Explorando a resposta imune a tumores fornece uma oportunidade única para o desenvolvimento de novas ferramentas para a detecção sorológica de cancro, bem como uma vantagem para a terapia. Um teste com base na demonstração de auto-anticorpos contra antigénios tumorais em soros de pacientes poderiam ser de grande importância para a detecção precoce do cancro devido ao curso de tempo prolongado de carcinogénese e porque um nível detectável de anticorpos contra o estímulo cancerígena pode formar muito antes do fenótipo tumoral surge. À semelhança de outros cancros, o cancro do pulmão desenvolve como os resultados do descarrilamento de processos de regulação múltiplas e heterogéneas. Por conseguinte, não é uma única biomarcador que precisa de ser elucidados. padrões de biomarcadores multiplexados ter um valor preditivo positivo significativamente maior do que os marcadores individuais em pacientes doentes exigentes de controles não-cancerosas.

O teste de auto-anticorpos é uma grande promessa, mas muito mais pesquisa com amostras extensas é necessário para confirmar a confiabilidade do teste e para se adaptar a técnica para rastreio em massa. Além disso, os médicos também precisará saber se o diagnóstico precoce melhora o resultado para pacientes com câncer de pulmão, contribuindo assim para a produção de anticorpos para o tratamento da doença. Portanto, fazendo a ponte entre a ciência básica ea prática clínica representa o principal objetivo no futuro próximo para permitir que os médicos a adaptar risco ajustado estratégias de rastreio e tratamento para pacientes com câncer de pulmão atuais.