Abstract

Fundo

cancros do ovário e do endométrio seroso de alto grau são as fêmeas neoplasias do trato reprodutivo mais letais no mundo todo. Em parte, a incapacidade de tratar estes dois cânceres agressivos centra-se no fato de que enquanto a maioria dos pacientes são diagnosticados com base em estratégias de vigilância atuais como tendo uma resposta clínica completa para a sua terapia primária, quase metade irá desenvolver recorrência da doença dentro de 18 meses e o sucesso maioria vai morrer de recorrência da doença dentro de 5 anos. Além disso, não usado atualmente biomarcadores ou estudos de imagem pode prever o resultado após o tratamento inicial. Circula DNA tumoral (ctDNA) representa um biomarcador teoricamente poderosa para detectar a doença de outra forma oculta. Por isso, explorou o uso de marcadores ctDNA personalizados como tanto uma vigilância e biomarcador prognóstico em cânceres ginecológicos e comparou isso a instrumentos de vigilância aprovados pela FDA atuais.

métodos e resultados

amostras do tumor e de soro foram coletadas no momento da cirurgia e, em seguida, ao longo do curso do tratamento de 44 pacientes com cânceres ginecológicos, representando 22 casos de cancro do ovário, casos de câncer 17 uterinas, um peritoneal, três trompas de falópio, e um paciente com trompa de Falópio síncrona e câncer uterino. mutações do paciente /específicas do tumor foram identificados utilizando todo o exome e sequenciamento de genes-alvo e níveis ctDNA quantificada utilizando gota PCR digital. CtDNA foi detectado em 93,8% dos pacientes para os quais as sondas foram desenhadas e os níveis foram altamente correlacionadas com soro CA-125 e tomografia computadorizada (CT) resultados de digitalização. Em seis pacientes, ctDNA detectada a presença de câncer, mesmo quando a tomografia computadorizada foi negativo e, em média, tinham um prazo de execução de previsão de sete meses mais de tomografia computadorizada. Mais notavelmente, os níveis indetectáveis ​​de ctDNA em seis meses após o tratamento inicial foi associado com sobrevida livre e global aumentou de forma acentuada progressão.

Conclusões

Detecção de doença residual no ginecológica, e de fato todos os cancros, representa um dilema diagnóstico e um potencial ponto de inflexão crucial na medicina precisão. Este estudo sugere que o uso de biomarcadores ctDNA personalizados em cancros ginecológicos podem identificar a presença de tumor residual, enquanto também prever de forma mais dinâmica da resposta ao tratamento em relação ao utilizado actualmente estudos de soro e de imagem. De particular interesse, ctDNA foi um preditor independente de sobrevida em pacientes com câncer de ovário e endométrio. reconhecimento precoce da persistência da doença e /ou de reincidência ea capacidade de estratificar em melhores e piores grupos de resultados através da vigilância ctDNA pode abrir a janela para a melhoria da sobrevida e da qualidade e da vida nestes cancros

Citation:. Pereira E, Camacho -Vanegas O, Anand S, Sebra R, Catalina Camacho S, Garnar-Wortzel L, et al. (2015) personalizado tumorais circulantes DNA Biomarkers dinamicamente prever resposta ao tratamento e sobrevida em cânceres ginecológicos. PLoS ONE 10 (12): e0145754. doi: 10.1371 /journal.pone.0145754

editor: Goli Samimi, National Cancer Institute, United States |

Recebido: 27 de outubro de 2015; Aceito: 08 de dezembro de 2015; Publicação: 30 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Pereira et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Estes estudos foram financiados, em parte, por doações da iniciativa Varadi Ovarian Cancer em Educação (voz), o Ruttenberg Fundação Derald H. eo MS família Gordon. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução malignidades

ginecológicas serão diagnosticados em mais de 94.000 mulheres em os EUA e irá resultar em perto de 29.000 mortes só este ano [1]. O desenvolvimento de biomarcadores mais sensíveis e precisos será fundamental tanto para a detecção precoce da doença e vigilância mais eficaz no cenário pós-tratamento. Por exemplo, no câncer epitelial de ovário, a fêmea malignidade trato reprodutivo mais letal em todo o mundo, a maioria das mulheres vai se apresentar com doença em estágio avançado, que será gerido por ressecção cirúrgica seguida de platina combinação e quimioterapia baseada em taxano. Enganosamente, usando tecnologias de detecção atuais, 80% destes pacientes parecem ter uma resposta clínica completa à terapia primária. Na verdade, mais de metade irá desenvolver recorrência da doença dentro de 18 meses. Assim, um período crítico para o início do tratamento mais agressivo mais cedo e melhorar a sobrevivência é potencialmente perdidos para sempre. O biomarcador única actualmente disponíveis no soro em malignidades ginecológicas, CA-125, não tem a sensibilidade e especificidade para a resposta ao tratamento e monitorização de detecção de início de recidiva [2,3]. modalidades de imagem, incluindo tomografia computadorizada (TC) são comumente usados ​​para a vigilância das doenças, mas também a falta de sensibilidade e muitas vezes permanecem inconclusivos ou atrasado em demonstrar a progressão da doença [4,5].

A quantidade absoluta de DNA livre de células (cfDNA) no soro de um paciente como um marcador da presença da doença em doenças malignas ginecológicas foi explorada em primeiro lugar mais de 10 anos [6,7]. Com o advento de novas tecnologias de sequenciação e técnicas analíticas, a capacidade de detectar ADN em circulação específicos do tumor (ctDNA), muitas vezes referida como o “biópsia líquido”, evoluiu. A medição de ctDNA foi mostrado ser uma reflexão precisa da presença da doença e da evolução do tumor em diversos tipos de cancro incluindo cancro da mama, pulmão, cólon, e cancros do estômago [8-12]. Estudos anteriores em malignidades ginecológicas foram inicialmente avaliados quanto à presença de ctDNA num único ponto de tempo utilizando lavagens pélvica, ascite, soro e plasma [13-15]. Como prova de princípio de estudo a demonstrar a capacidade de rastrear série de doenças, que recentemente usou um evento de fusão específica do tumor para demonstrar a presença continuada de ctDNA e doença residual, assim, mínima, em um único paciente durante um período de quatro anos em face de medidas CA125 repetidamente normais [16]. Além disso, estudos longitudinais que correlacionem níveis ctDNA com a carga tumoral e evolução clínica em cancros ginecológicos estão faltando. No entanto, a natureza dinâmica, sensível e específico teórico de ctDNA como um biomarcador sugere grande potencial para revolucionar a nossa abordagem à vigilância tumor em cancros ginecológicos.

Aqui nós descrevemos um gasoduto rápida e eficiente que os casais mutação de ponto específico de tumor identificação com detecção ctDNA baseada em PCR digital de gotícula. Nós testamos este gasoduto para detectar e monitorar o status de tumores em 44 mulheres com cancros ginecológicos. Especificamente, usando uma combinação de toda a sequenciação exome (WES) e painel de sequenciamento genético dirigido, nós compilamos perfis de mutação do tumor para uma coorte de pacientes com câncer ovariano e endometrial. painéis derivadas de doentes de biomarcadores ctDNA foram gerados e testados utilizando PCR digital de gota, que validado para ser capaz de detectar uma única cópia de ctDNA por amostra de soro. Os resultados foram comparados ctDNA contra a corrente biomarcador de soro, CA125, tomografia computadorizada e aprovado pelo FDA e do conhecido estatuto cirúrgico /clínica dos pacientes. Este é o primeiro estudo a demonstrar em cânceres ginecológicos que ctDNA pode detectar a presença de câncer mais cedo do que outras modalidades de teste recomendadas atualmente e que ctDNA níveis ao término da terapia primária são um preditor independente de ambos livre de progressão (PFS) e sobrevida global ( OS).

Métodos

paciente inscrição e Amostra Coleção

Quarenta e quatro pacientes com ginecológica, malignidades foram inscritos e aprovados para participação após a obtenção do consentimento informado por escrito apropriado como uma parte do nosso Institutional Review Board (IRB) -aprovado programa genômica câncer ginecológico no Icahn Escola de Medicina Monte Sinai (Tabela 1). amostras de tumor foram coletadas no momento da cirurgia. Amostras de sangue foram coletadas no momento da cirurgia e de novo com cada sorteio de sangue por todo o curso clínico do paciente. tecido tumoral cirúrgica foi imediatamente flash congelados em nitrogênio líquido após a colheita e soro foi coletado em BD Vacutainer SST II Tubes antecedência (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ). Dentro de quatro horas após a recolha, as amostras de sangue foram centrifugadas durante 10 minutos a 12000 g). O soro foi transferido para um tubo Falcon de 15 ml e centrifugados a 1,200g durante um adicional de 10 minutos para eliminar detritos celulares remanescentes. Os dados clínicos foram extraídas dos registros médicos do paciente e incluiu variáveis ​​demográficas, local do tumor inicial, histologia, grau, palco, CA-125 níveis e regimes de quimioterapia. Os dados referentes a procedimentos cirúrgicos, locais de doença metastática, e as recidivas, também foram coletadas. Todos os pacientes com cancro do endométrio ou de ovário foram elegíveis para a inscrição se os espécimes necessários de acordo com o protocolo do estudo e dados clínicos relevantes estavam disponíveis:. CA-125 níveis, tomografia computadorizada resultados (CT), os resultados cirúrgicos e regimes de quimioterapia

Extracção de DNA Protocolos

tumoral o ADN genómico foi extraído de cerca de 25-50mg de tecido utilizando o DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, GmbH, Hilden) de acordo com as instruções do fabricante. ADN da linha germinal foi extraído a partir de sangue total usando o kit de ADN ArchivePure (5 Prime) de acordo com o protocolo de purificação do ADN de sangue inteiro, fornecida pelo fabricante. Quantificação do ADN genómico foi realizada utilizando por fluorometria Qubit. Livre circulante (cfDNA) foi extraído a partir de 1 mL de soro utilizando o Kit de circulação Ácido Nucleico (Qiagen, GmbH, Hilden) e eluiu-se com 105 ul de DNase e RNase isenta de água.

Identificação de Mutações somáticas

foram identificados os perfis personalizados de mutação de tumor para tumor de cada paciente por toda quer sequenciamento exome (WES) ou uma abordagem sequenciamento de genes alvo. Em ambos os ensaios, o ADN genómico (ADNg) de tecido tumoral e um controlo normal foram sequenciados para identificar variantes genéticas (SNVS e pequenas indels) específicas para o tumor (apenas mutações somáticas). Toda a sequenciação foi realizada no Departamento de Genética e Genômica na Icahn Escola de Medicina Monte Sinai. bibliotecas de todo o genoma foram preparados a partir de ADNg utilizando o kit de ADN NEBNext Biblioteca Prep (New England Biolabs, Ipswich, MA), enriquecido com bibliotecas exome inteiras usando o sistema de captura de v3.0 SeqCap EZ exome Biblioteca Humana (Roche NimbleGen, Madison, WI) , cobrindo aproximadamente 64 Mb do genoma onde variantes pode ser chamado; sequenciamento-end emparelhado (2×100 lê nt) foi feito em Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA) em qualquer modo Rapid Run High Output ou. sequenciamento do gene alvo foi realizada utilizando Ion AmpliSeq

TM Cancer Hotspot Painel v2 (Life Technologies, Carlsbad, CA), utilizando a tecnologia de sequenciamento Ion Torrent PGM para ~ 1000 a cobertura de 3000X. O Ion AmpliSeq

TM Cancer Hotspot Painel v2 interroga 50 oncogenes e genes supressores de tumor em toda 207 amplicons (abrangendo 21.820 nt onde variantes pode ser chamado). Com base na experiência, candidatos mutações somáticas foram triados para o desenvolvimento sonda Taqman se fração alelo mutante foi ≥ 8% e passou revisão manual inspecionando alinhamentos de leitura matérias na ferramenta navegador IGV genoma, então validado para geração final da sonda por sequenciação directa Sanger de tumor ADN e o seu ADN genómico emparelhado células mononucleares do sangue periférico (CMSP). Como os dados WES forneceu um número maior de candidatos mutações somáticas que era prático para validar, os candidatos com maior fração alélicas e melhor qualidade da chamada variante foram priorizados.

PCR Ensaio concepção e validação

Ensaios TaqMan personalizadas foram projetados usando a ferramenta de projeto baseado na web Life Technologies (www.lifetechnologies.com/order/custom-genomic-products). Os ensaios continham iniciadores de PCR não marcado (para a frente e para trás), além de VIC, Tet ou sondas marcadas com FAM, que sondadas para o tipo selvagem e mutante, respectivamente variantes. Os ensaios foram depois validados por PCR quantitativa (qPCR), utilizando TaqMan ® mistura de genotipagem mestre (Life Technologies, Foster City, CA) em um ABI Prism 7900 Sequence Detection System HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Em primeiro lugar, a especificidade foi estabelecida testando a ensaios sobre tumoral e ADN genómico combinado de PBMC. A linearidade de cada ensaio foi então estabelecido por comparação de cada ensaio contra uma curva padrão preparada a partir de uma série de diluições em série de ADN de tumor, variando de 400-4000 cópias do genoma específica equivalente que ensaio.

Mutation quantificação em livre circulante DNA (cfDNA)

Para consolidar ainda mais a sensibilidade, linearidade e os limites inferiores de detecção, ensaios desenvolvidos foram então testadas por PCR gota digitais (Raindance Technologies, Billerica, MA) de acordo com o protocolo do fabricante. Para este fim, diluies em sie de ADN de tumor, preparadas para cada ensaio, e na gama de 2-24 cópias foram misturados em um fundo de 100.000 cópias de ADN genómico do tipo selvagem. Uma vez que o limite inferior de detecção foi estabelecido para cada ensaio, foi realizada em ddPCR cfDNA extraído do soro e /ou plasma do doente. Vinte pi de cfDNA eluído foi utilizado para cada reacção de PCR, o que representa 200 ul de soro. O volume total de reacção de PCR foi de 50 ul (^ 10 gerando 6 gotas). As condições de PCR foram as seguintes: 95 ° C durante 10 minutos para um ciclo; 95C (15 segundos) e 58C (um minuto) com um passo de 45 ciclos de cada; e 98C (10 minutos). O produto de PCR foi então introduzida no instrumento Raindrop sentido para quantificação de tipo selvagem e mutantes números de cópias. Cada amostra foi analisada cfDNA por, pelo menos, duas repetições. Para determinar a reprodutibilidade do ensaio e a eficiência de extracção cfDNA, que cravado cada amostra de sangue do doente com uma concentração conhecida de DNA de lambda digerido com Hindi II do fago (Qiagen, GmbH, Hilden) antes do isolamento cfDNA. qPCR foi usada para quantificar os fragmentos de 125 e 535 pb de ADN de HindIII λ-. Com base em λ eficiência de extracção de ADN, a eficiência de recuperação para extracções cfDNA utilizados nestes estudos era entre 60 e 90%.

Análise estatística

Para avaliar a capacidade de ctDNA e CA125 para prever a presença de tumor na tomografia computadorizada e no momento da cirurgia, os parâmetros de sensibilidade e especificidade, bem como correspondente intervalo de confiança de 95% foram estimadas usando modelos log-binomial que levaram em conta as correlações que surgiram de lá sendo várias medições no mesmo paciente ao longo Tempo. probabilidades previstas a partir desses modelos equipados foram então usados ​​em modelos de regressão logística para estimar e comparar as áreas sob as curvas receiver operating characteristic (ROC) (AUCs), tanto ctDNA e CA125. A sobrevida global (OS) e sobrevida livre de progressão (PFS) foram estimados utilizando o método de Kaplan-Meier e comparadas com o teste log-rank, entre os pacientes com níveis de ctDNA que estavam presentes ou ausentes após a ressecção cirúrgica e terapia adjuvante. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SAS versão 9.3 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). teste de hipóteses foi em frente e verso e conduzida ao nível de 5% de significância.

Resultados

Características clinicopatológicas dos pacientes e seus tumores

Quarenta e quatro pacientes em tratamento para ginecológica cancro foram recrutados para este estudo e o seu tipo de cancro e informações características clinicopatológicas é mostrado na Tabela 1. ADN derivado de tumores, o ADN da linha germinal, ctDNA e dados clínicos estavam disponíveis para todos os pacientes. Todos os tumores ovarianos foram histologia seroso de alto grau, com a exceção de um tumor mesodermal misturado maligno. Embora a maioria dos cancros do endométrio eram de alto grau, os subtipos histológicos foram variadas. Para efeitos de nossas tumores serosos análise de alto grau da trompa de Falópio, peritônio e ovário foram agrupadas como carcinomas serosos de alto grau pélvicos (HGSC). A maioria dos tumores sequenciadas foram coletadas no momento da cirurgia primário (n = 40), enquanto quatro amostras de tumores eram de recorrências.

Identificação de somáticas Genomic Variantes e Desenvolvimento da personalizados ddPCR Ensaios

Uma visão geral de nosso pipeline personalizado análise ctDNA é mostrado na Fig S1. Usando uma combinação de WES e sequenciamento painel alvo, primeiro teve como objetivo identificar mutações significativas específicas do tumor para o desenvolvimento de gotículas PCR (ddPCR) ensaios baseados digitais. Oito tumores foram sequenciados utilizando dados WES de Illumina-end emparelhado sequenciamento coletados no HiSeq 2500 e 36 foram sequenciados utilizando o Painel Hotspot Cancer Ion AmpliSeq ™ alvo v2 usando o sequenciador Ion Torrent PGM. Todos os tumores foram sequenciados utilizando WES tumores ovarianos. As amostras de soro estavam disponíveis a partir de qualquer cirurgia primário ou secundário para todos os pacientes. soros longitudinais estavam disponíveis para 23 pacientes. ctDNA foi extraído de um total de 228 pontos de tempo individuais, com uma média de 7,8 pontos no tempo por paciente (Fig 1).

mutações candidatos foram identificados por 36 pacientes (S1 tabela). Das mutações detectadas utilizando o painel de alvo, o gene mais comummente mutado foi TP53 (23/36 pacientes; 66%), o que ocorreu sempre em alto grau histologia seroso de ambos os tumores do ovário e do endométrio. Também foram identificadas mutações, embora em frequências mais baixas, em PTEN, PIK3CA, MET, KRAS, FBXW7 e BRAF. Várias mutações candidatas foram identificadas por 16 pacientes. Todas as mutações candidatos foram confirmados por sequenciamento Sanger dos respectivos tumores.

No total, 52 ensaios exclusivos, de 55 concebido, foram validados para a sensibilidade, especificidade e linearidade utilizando PCR quantitativo (qPCR), representando 32 pacientes para pode ser exercidas que ctDNA estudos quantitativos. A robustez dos diferentes ensaios gerados para cada um dos pacientes foi demonstrada por um número de diferentes métricas. Para todos os 52 ensaios, o coeficiente de correlação de linearidade, R

2, foi maior que 0,99 (média de 0,9988, S2A Fig). Os menores limites de detecção foram estabelecidos para cada ensaio personalizado usando DNA tumor cravado do respectivo paciente com mutações conhecidas e testadas utilizando 2-24 cópias mutantes em um fundo de 100.000 do tipo selvagem cópias de seu DNA germinal. Com base nestes testes, a sensibilidade para discriminar entre o tipo selvagem e a sequência mutante para todas as sondas utilizadas no presente estudo variou entre 0,01% e 0,002%. Quantificação dos mutantes específicos de tumores exemplares em cfDNA foi altamente correlacionados em repetições ddPCR (Pearson r: 0,9938, S2C figura). Houve também uma alta correlação linear entre a fração de alelos, conforme determinado pelo ddPCR e orientada sequenciamento (Pearson r: 0,95). E esta correlação foi estatisticamente significativa p = 4.47E-15 (S2D Fig)

Estimando a sensibilidade e especificidade da ctDNA para prever tumor presença

em seguida, avaliamos a capacidade de ctDNA série-coletadas para triagem de presença clínica do tumor. Ao mesmo tempo, nós também comparou o teste aprovado pela FDA usado atualmente, CA-125. Para estabelecer uma verdade relativa do solo para a presença do tumor, foi utilizado CT de imagem e, no momento da cirurgia. Embora relativamente imprecisa, este nos permitem identificar uma série de importantes descobertas. Dados comparando ctDNA e CA-125 níveis para a presença de tumor na tomografia computadorizada estava disponível através de 53 pontos de tempo para 23 pacientes.

A sensibilidade e especificidade do ctDNA para prever a presença de tumor na tomografia computadorizada emparelhado foi 0,91 [0,73-0,97] e 0,60 [0,31-0,83], respectivamente (Tabela 2). Resultados semelhantes foram obtidos para o CA-125 e de tomografia computadorizada (Tabela 2). A baixa especificidade do ctDNA foi surpreendente para nós e por isso examinou esta em maior profundidade. A discrepância verificou-se ser o resultado de uma falta de concordância entre os testes em seis pacientes. Especificamente, todos os seis pacientes tinham níveis detectáveis ​​de ctDNA mas os resultados negativos CT imagem dentro de duas semanas da coleta de sangue ctDNA. Interrogatório de sua história completa revelou que todos os seis pacientes foram posteriormente encontrados para ter tumores cirurgia comprovado que não tinham sido detectados pela exploração CT. Além disso, a análise dos dados dos pacientes revelou que, em média, ctDNA previu recorrência aproximadamente 7 meses. (Intervalo: 1-11 meses) antes do CT de imagem (Fig 2)

Neste exemplo representativo, aumentos dos níveis de ctDNA em paciente 137 níveis preceder um aumento nos níveis de CA-125 por seis meses e identificação positiva pré-data de crescimento do tumor a necessidade de ressecção intestinal sete meses depois. tomografia computadorizada era inespecífico e paciente foi levado para a sala de cirurgia para a cirurgia exploratória, que revelou a presença de tumor.

níveis

CA-125 e ctDNA foram então comparadas com a presença de tumor no momento da cirurgia por 30 pontos no tempo por 21 pacientes. Quando comparado com a presença de tumor no momento da cirurgia, ctDNA tinha uma sensibilidade de 0,81 [0,60-0,92] e uma especificidade de 0,99 [0,81-0,99]. Por comparação, a sensibilidade e especificidade do CA-125 foi de 0,82 [0,61-0,93] e 0,64 [0,17-0,94], respectivamente. As áreas sob as curvas ROC foram calculadas para ctDNA e CA-125 e foram 0,91 [0,83-0,99] e 0,70 [0,44-0,95], respectivamente. Embora estes resultados sugerem que ctDNA poderia ser um teste de diagnóstico mais preciso do que CA-125, a diferença de curvas ROC não foi estatisticamente significativa (p = 0,3575) [Tabela 2].

Níveis ctDNA seguintes inicial de tratamento são Predictive diferenças em sobrevida

A seguir, avaliou se os níveis ctDNA após a terapia de ressecção cirúrgica e adjuvante teve significado prognóstico. Pré e pós-tratamento níveis ctDNA foram analisadas para 10 pacientes e em comparação com PFS e OS. estado clínico atual, mortos da doença (DOD), vivo com a doença (AWD) e sem evidência de doença (NED), estava disponível para todos os 10 pacientes (Tabela 3). níveis indetectáveis ​​de ctDNA após o tratamento adjuvante inicial foram associados tanto melhorada PFS (p = 0,0011 Kaplan Meier) e OS (p = 0,0194; Fig 3). A diferença PFS mediana foi de pouco mais de 2 anos (seis meses versus 32 meses). Todos os quatro pacientes com pós-tratamento média níveis ctDNA ≥ 10 cópias /ml são DOD, enquanto o paciente com ctDNA = 5 cópias /ml, que também tinham intrigante níveis muito baixos de ctDNA pré-tratamento, é AWD. Dos cinco pacientes com níveis indetectáveis ​​ctDNA pós-tratamento, nenhum deles morreu de sua doença, três são AWD e dois são NED. Dois dos pacientes já ter sobrevivido além de 5 anos. Notamos nenhuma diferença de sobrevivência com base em valores pré-tratamento ctDNA

análise do (painel esquerdo) livre de progressão de Kaplan-Meier e a sobrevida global (painel da direita) entre os indivíduos com indetectável. (CtDNA = 0; linhas azuis) e detectáveis ​​ctDNA (≥ 1; linhas vermelhas). diferença significativa na sobrevida livre de progressão (p = 0,001) e sobrevida global (p = 0,0194) entre os grupos indetectável e detectável.

Discussão

Nós demonstramos que a medição de série de ctDNA é um biomarcador de vigilância em cânceres ginecológicos que é tão sensível e específico como o FDA aprovou-biomarcador de soro CA-125 e pode detectar a doença recaída meses mais cedo do que a tomografia computadorizada. Além disso, a medição dos níveis ctDNA no momento da conclusão da terapia inicial, a cirurgia debulking e platina combinação /taxano gibão quimioterapia, proporciona um novo preditor das diferenças de sobrevivência em pacientes. Especificamente, níveis indetectáveis ​​de ctDNA foram associados com a sobrevida livre e global de melhoria da progressão. Em nossa população de estudo, a diferença de PFS foi de pouco mais de dois anos entre as mulheres com níveis detectáveis ​​e indetectáveis ​​de ctDNA. Estas diferenças, uma detecção mais precoce do que a TC de imagem e separação de mulheres com pior sobrevida e melhor, é surpreendente uma vez que a base teórica para a vigilância do câncer é que anteriores resultados de detecção em melhores opções e resultados terapêuticos. O que se sabe é que, neste momento, e contando com exame clínico, CA-125 medições e imagens, a maioria dos pacientes com câncer ovariano após o tratamento inicial são diagnosticados como tendo uma resposta clínica completa. Apesar disso, mais de metade destas mulheres irá desenvolver recorrência da doença dentro de 18 meses.

CA-125 e tomografia computadorizada são as modalidades de vigilância mais utilizados em cancros do ovário e do endométrio. Mesmo assim, CA-125 é considerada opcional e CT de imagem só é recomendada como indicado clinicamente pelas diretrizes da National Comprehensive Cancer Network (NCCN) [17]. Mais de 50% dos pacientes com câncer de ovário com níveis de CA125 normais após a quimioterapia, no entanto, têm a doença persistente, mas a distinção entre pacientes exclusivamente sobre este biomarcador atualmente não é possível [18]. Para a ~ 50% dos pacientes com doença persistente, o aumento da sensibilidade e especificidade conferida por uma abordagem baseada em genómica pode permitir sub-categorização adicional de pacientes para ajudar a diferenciar doença e subtipos terapêuticos. CA-125 também é amplamente expresso em outros tecidos e é elevado em processos benignos, tais como endometriose, leiomiomatose uterina, massas anexiais benignos, inflamação das trompas, doença hepática, insuficiência cardíaca, fluxo menstrual e a gravidez, o que limita a sua utilidade no controlo de cancro do ovário [ ,,,0],19]. Finalmente, com uma semi-vida estimada entre 9-44 dias [20], o CA-125 não podem oferecer uma resposta tão rápida a variações de volume de tumor como ctDNA. Por outro lado, enquanto a imagem TC é o método padrão para a avaliação da recorrência da doença, no nosso coorte havia seis casos de CT imagem negativa com ctDNA detectável na cara de doença residual. Além disso, e como notado acima, um aumento no ctDNA precedida evidência radiológica de recorrência do tumor, em média, 7 meses.

Em uma série de outros tipos de cancro, os níveis ctDNA foram demonstradas para correlacionar mais estreitamente com as mudanças na volume do tumor do que actualmente biomarcadores disponíveis [8], estudos em seres humanos no entanto longitudinais correlacionando níveis ctDNA com a carga tumoral em malignidades ginecológicas havia faltado. Anteriormente, o nosso grupo relatou-se na detecção de rearranjos genéticos, especificamente eventos de fusão, e a sua utilização como ensaios ctDNA para monitorar a posteriori um paciente com cancro do ovário avançado estágio [16]. A justificativa para iniciar nosso estudo foi que, apesar da história deste paciente da remissão clínica aparente com base em vários estudos clínicos, bioquímicos e radiológicos negativos que ela tinha múltiplas recorrências. Por um período de quatro anos, o paciente foi submetido a cirurgia primária debulking e quimioterapia, recorrências tumorais, e vários esquemas quimioterápicos. As amostras de sangue foram recolhidas e armazenadas longitudinalmente no nosso Biobank como parte de um programa de investigação. Considerando que os níveis de CA125 pós-cirúrgicas foram elevados apenas três vezes durante 28 medições, a fusão específica ctDNA biomarcador foi facilmente detectável em todas estas mesmas amostras de sangue e em que as recidivas. Apesar de não se correlacionam diretamente ctDNA quantidade com a carga tumoral, a fusão específica do tumor ctDNA continuou a ser detectável em períodos de remissão clínica aparente, demonstrando a capacidade para ctDNA para detectar a doença oculta no câncer de ovário.

Neste presente estudo, agora demonstrar a capacidade de detectar com sensibilidade mutações pontuais por PCR digital em especificidades, mesmo para além de 0,01% de uma amostra complexa. Usando este gasoduto, uma vez que as sondas ctDNA específicos do paciente ter sido gerados e validados, o teste de amostras de soro pode ser concluída dentro de horas e é facilmente incorporado em um programa de vigilância (S3 Fig). A nossa abordagem requer conhecimento prévio de alterações genéticas específicas do tumor no tumor de cada doente. Neste estudo, foi utilizada uma combinação de WES e um painel de alvo que tem como alvo 50 oncogenes comumente mutantes e supressores de tumor. Esta abordagem combinada permitiu-nos para gerar sondas ctDNA por 82% das mulheres em nosso estudo. Como esperado, Wes identificadas mutações em 8/8 das amostras de tumor. O painel de cancro que foi utilizado nos permitiu interrogar 207 amplicões 50 através oncogenes e genes supressores de tumor a uma cobertura muito alta e resultou na identificação de mutações em 28/36 (78%) amostras. No futuro, o uso de painéis de sequenciamento focadas especificamente em cancros do ovário e do endométrio deve permitir uma plataforma de identificação ainda mais robusto e eficiente.

O objetivo desses estudos de vigilância de última geração é detectar a recorrência da doença mais cedo, pacientes que são candidatos cirúrgicos mais óptimos, seus tratamentos de forma mais eficaz e personalizado, se e quando necessário, triados para ensaios terapêuticos. Por outro lado, para algumas delas, o uso de marcadores baseados em ctDNA poderia reduzir o número de intervenções desnecessárias, resultar em menos ao longo do tratamento e contornar os custos financeiros e de radiação associada com estudos de imagem CT. Em última análise, agora que ctDNA foi mostrado para detectar a doença residual anterior e pode-se distinguir entre as mulheres com pior e melhorou a sobrevivência em cancros do ovário e do endométrio, os estudos clínicos que definem a utilidade de ctDNA como uma ferramenta de vigilância em cancros ginecológicos podem agora ser concebidos.

Informações de Apoio

S1 Fig. Visão geral do gasoduto análise ctDNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0145754.s001

(TIF)

S2 Fig. A precisão e a reprodutibilidade do ensaio ddPCR em PT208. (Mutação TP53; Chr17: 7.577.539; G A) para a detecção e quantificação ctDNA

linearidade (A) ensaio foi determinada por meio da análise de tumores diluições em série de fracções alelo. cópias mutantes detectados pelo sistema ddPCR foram apoiados por um R

2 de 0,99. (B) O limite inferior de detecção para este ensaio foi estabelecida pela adição de diluições em série de DNA de tumor em uma base de 100000 cópias de equivalentes do genoma a partir de ADN da linha germinativa do paciente. Fracionários percentagens de concentração de mutação variou de 0.025-0.002 e foram analisados ​​por ddPCR. fração de mutação foi detectada tão baixo quanto 0,002%. (C) Replicar reprodutibilidade para a detecção ctDNA. correlação de Pearson entre repetições individuais é calculado e demonstrado (Pearson r = 0,99) (D) Acordo de determinação fração de alelos mutantes entre sequenciamento e ddPCR (p = 4.47E-15)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0145754. S002

(TIF)

S3 Fig. algoritmo de vigilância ginecológica actual e proposta

doi:. 10.1371 /journal.pone.0145754.s003

(TIF)

S1 Table. mutações específicas de tumor candidato identificadas por WES e sequenciamento alvo.

amostras interrogados pelo WES são destacadas com um asterisco.