Abstract
Fundo
A prevalência de nódulos da tireóide aumenta com a idade, com média de 4-7% para a população adulta EUA, mas é muito mais elevada (19-67%), quando sub nódulos -clinical são considerados. Cerca de 90% destas lesões são benignas e uma abordagem confiável para sua caracterização pré-operatório é necessário. Infelizmente cintilografia da tireóide convencional não permite a distinção entre proliferações tireoidianas benignas e malignas, mas fornece apenas informações funcional (
nódulos frios ou quentes
).
A expressão da molécula anti-apoptótica galectin- 3 é restrita a células cancerosas e esta característica tem implicações de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Mostramos aqui a possibilidade de obter imagens cancro da tiróide
in vivo
alvejando galectina-3.
Métodos
A tireóide imuno-cintigrafia galectina-3 com base usa como radiofármaco um específica
mAb 99mTc-radiomarcado. Uma câmera mini-gama de alta resolução sensíveis à posição foi usado como dispositivo de captura de imagem. Humanos galectina-3 xenoenxertos positivos cancro da tiróide (ARO) e galectina-3 tumores knockout foram utilizadas como alvos em diferentes experimentos
in vivo
. 38 ratinhos com massa de tumor de cerca de 1 g foram injectados na veia da cauda com 100 uCi de
mAb para galectina-3 marcado com 99mTc (30 ug proteína /em 100 ul de solução salina). imagens tumorais foram adquiridas em 1 hora, 3 horas, 6 horas, 9 horas e 24 horas após a injecção, usando a câmera mini-gama.
Achados
Os resultados de diferentes experimentos consecutivos mostram uma óptima visualização de cancro da tiróide xenoenxertos entre 6 e 9 horas da injeção do radiofármaco. tumores negativos a galectina-3 não foram detectados em todos os. Aos 6 horas após a injecção galectina-3 tumores que expressam foram corretamente visualizadas, enquanto a atividade de corpo inteiro tinha essencialmente apagada.
Conclusões
Estes resultados demonstram a possibilidade de distinguir no pré-operatório benigna da maligna da tiróide nódulos usando um específico galectina-3 rádio-immunotargeting.
In vivo
imagiologia de cancro da tiróide pode permitir uma melhor seleção de pacientes encaminhados à cirurgia. A possibilidade de aplicar este método para imagiologia e tratamento de outras galectina-3 tumores que expressam também é discutida
Citation:. Bartolazzi A, D’Alessandria C, Parisella MG, Signore A, Del Prete F, Lavra L, et ai. (2008) cancro de tiróide Imaging
In Vivo
por Segmentação do Anti-apoptóticos Molecule galectina-3. PLoS ONE 3 (11): e3768. doi: 10.1371 /journal.pone.0003768
editor: Andrew Boswell, Genentech, Estados Unidos da América
Recebido: 23 de junho de 2008; Aceito: 02 de novembro de 2008; Publicação: 20 de novembro de 2008
Direitos de autor: © 2008 Bartolazzi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Apoiado por AIRC (Associação italiana para a Pesquisa do Câncer). Não há outros patrocinadores desempenhou um papel neste trabalho
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
A alta prevalência de nódulos benignos da tireóide em população adulta faz a detecção pré-operatório de câncer de tireóide comparável a “procurar uma agulha em um palheiro”. A prevalência de nódulos da tiróide aumenta com a idade, média de 4-7% para a população adulta U.S. A. [1], mas é muito mais elevada (19-67%) quando sub-clínica nódulos também são considerados [2]. Felizmente, cerca de 90% destas lesões são benignas e por esta razão é necessário [1], [3].
A expressão de Iodeto de Sódio Simportadores (NIS) uma abordagem fiável e sistemática para a sua caracterização pré-operatória na membrana das células da tiróide permite a glândula tiróide a concentrar-se iodeto de a partir do soro. captação de iodeto de NIS-mediada é necessário para os passos organificação e oxidação subsequentes, que são eventos importantes para a produção de hormonas da tiróide. Esta propriedade peculiar da glândula tireóide suporta cintilografia convencional, que usa radioiodine na definição da glândula tireóide em estados fisiológicos e patológicos [4]. No entanto, esta técnica amplamente utilizada não permite a distinção entre proliferações tireoidianas benignas e malignas. Na verdade, embora o câncer é incomum em nódulos tireoidianos com captação de iodeto eficiente (redigido
nódulos Hot News), a grande maioria das proliferações de tireóide que não conseguem concentrar-se iodeto de (
nódulos frios
) são biologicamente benigna [ ,,,0],4].
células da tireóide
Normalmente não expressam galectina-3. A expressão forçada de galectina-3
via
transfecção cDNA específico gera um fenótipo transformado, bloqueando o programa de apoptose, uma característica que favorece o desenvolvimento de câncer [5] – [9]. Curiosamente, como já relatado em um grande estudo retrospectivo multicêntrico sobre o material histológico, carcinomas bem diferenciados, quase invariavelmente, expressam galectina-3 ( 94% de todos os tipos de câncer da tireóide, com exclusão do carcinoma medular), enquanto proliferações benignas da tiróide fazer não (apenas 2% dos nódulos benignos, principalmente representadas pelas adenomas, foram galectina-3 positivo) [10]. Este achado foi confirmado por diversos estudos relatados na literatura [11] – [14] e galectina-3 imunocoloração é já utilizado na prática clínica, a nível imuno-citológico, para uma melhor seleção dos pacientes encaminhados à tireoidectomia [10], [15] – [17]. Neste estudo, usando
in vivo
e
ex vivo
modelos experimentais de cancro da tiróide, mostramos a possibilidade de obter uma imagem confiável câncer de tireóide
in vivo
, visando a galectina-3 molécula de lectina. Esta abordagem de diagnóstico também pode ser usado para geração de imagens diferentes tumores galectina-3 expressando
in vivo
.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e galectina-3 mRNA interferência
linhas de células de carcinoma da tiróide ARO, gentilmente cedido pelo Dr. Silvia Soddu (National Cancer Institute Regina Elena de Roma, Itália) foi previamente descrito [18] – [19]. Embora a origem da tiróide de células ARO foi recentemente questionada [20], esta linha celular positiva galectina-3 cresce de forma muito eficiente
in vivo
e fornece um modelo útil para definir experimentos de galectina-3 immunotargeting com e sem galectina -3 interferência de mRNA. As células foram cultivadas em condições normalizadas a 37 ° C e 5% de CO
2 ambiente em meio RPMI-1640 suplementado com glutamina 2 mM, 10% de FCS, penicilina e estreptomicina (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).
Para a galectina-3 de interferência de mRNA três sequências diferentes foram identificados e testados como descrito anteriormente [21]. As duas sequências seguintes, que de forma semelhante e fortemente regulada negativamente a expressão de galectina-3 em células ARO foram sub-clonados no vector pSUPER e utilizados alternadamente (motivos conservados estão sublinhados): 5′-GATCCCCCAACAGGAGAGTCATTGTTTTCAAGAGAAACAATGACTCTCCTGTTGTTTTTGGAAA-3 ‘(Gal3-551, sentido); 5’-AGCTTTTCCAAAAA CAACAGGAGAGT-CATTGTTTCTCTTGAAAACAATGACTCTCCTGTTGGGG-3 ‘(Gal3-551, anti-sentido); GATCCCCACCTTACATGTGTAAAGGTTTCAAGAGAACCTTTACACATGTAA-GGTTTTTTGGAAA-3 ‘(Gal3-845, sentido); e 5’-AGCTTTTCCAAAAAACCTTAC-ATGTG TAAAGGTTCTCTTGAAACCTTTACACATGTAAGGTGGG-3 ‘(gal3-845, anti-sentido).
Na experiência apresentada na Figura 1 (painel B) células ARO foram estavelmente transfectadas com pSUPER-Gal3-551 (ArO- ) vector Gal-3i e zombar transfectadas com vector pSUPER como controle (ARO-CTR). A selecção de células transfectadas de forma estável foi realizada por tratamento com puromicina 2 ug /ml (Sigma) 72 horas após a transfecção.
A) imagem obtida com uma câmara de mini-gama de alta resolução a um rato tendo ARO (GAL3 +) xenoenxerto após 6 horas a partir de IV injecção de 100 uCi de
mAb marcado com 99mTc a galectina-3. A seta mostra a massa de tumor revelados na perna esquerda. Uma acumulação coerente do marcador rádio é observada no fígado de acordo com a depuração do mAb exógeno (painel 1A); Avaliação morfológica e imuno-histoquímica dos xenoenxerto de tumor extirpado mostrar um câncer de tireóide pouco diferenciado com uma expressão variável da galectina-3, como revelado por um mAb galectina-3 específico e um imunoperoxidase direta método de coloração (2A painel); A tabela mostra a cinética de tumor rácio /músculo normal do marcador rádio em diferentes pontos de tempo (painel 3A). B) A imagem adquirida com uma câmera mini-gama de alta resolução em um rato tendo galectina-3 interferiu ARO xenotransplante (Gal3-) após 6 horas de i.v. injecção de 100 Ci de
mAb a galectina-3 (painel 1B) marcado com 99m; Avaliação imunoistoquímica do tumor excisado mostra uma regulação negativa consistente de expressão de galectina-3 (painel 2b); A eficiência de interferência de ARN estável galectina-3 em baixo regulação da expressão de galectina-3 é demonstrado na imunotransferência. células ARO mock-transfectadas com pSUPER vector foram utilizados como controle (CTR); galectina-3 interferiu células ARO foram estáveis transfectadas com pSUPER-Gal3-551 vetor (Gal3i); α-tubulina foi utilizada como um controlo de carga. A análise de densitometria das espécies moleculares visualizadas no gel é também mostrada (painel 3B). Os resultados são expressos como unidades relativas de densitometria (RDU), medido normalizando sinal de Gal-3 com a correspondente intensidade da banda α-tubulina.
Down-regulação da expressão de galectina-3 foi verificada na análise western blot em diferentes pontos de tempo (12-72 horas após a transfecção as células tumorais e injecção em ratinhos).
Os anticorpos monoclonais e imuno-histoquímica
Um purificado de rábano conjugada com peroxidase (HRP-conjugado) anticorpo monoclonal de rato para galectina -3 (SRL ESPAÇO, Milão, Itália) foi usado em imuno-citoquímica de acordo com as instruções do fabricante, tal como relatado anteriormente [13]. Resumidamente, o tratamento com microondas antigénio-recuperação dos tecidos em lâminas de 0,01 mol /L de tampão citrato, pH 6,0 foi aplicado por três ciclos de 3 minutos cada, a 750 W. rato purificada mAb dirigido para galectina-3 foi usada numa gama de concentrações de 5-10 ug /ml. A actividade enzimática foi visualizada com 3, 3′-diamino-benzidina (Dako, Glostrup, Dinamarca).
análise de Western Blot
Total de extractos celulares (TCEs) foram obtidos utilizando um tampão de lise composta por: Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 a 1%, PMSF 1 mM e 1 comprimido de cocktail de inibidor de proteína completo (Roche). Uma alíquota de TcE (30-70 ug) foi separado em 10% SDS-PAGE, em seguida, transferidas para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad). Os anticorpos seguintes foram usadas em imunotransferência: um mAb de rato purificada para galectina-3 (Mabtech AB, Nacka Strand, Suécia), um mAb de murganho anti-α-tubulina (TU-02, Santa Cruz Biotechnology) e HRP anti-ratinho conjugada IgG e anti-rato IgG de anti-soros específicos (Sigma). Imunorreatividade foi detectada por meio de análise quimio-luminescência (kit ECL, Amersham Corporation). As espécies moleculares resolvidos em Western blotting foram finalmente analisados por densitometria, utilizando um software de dedicar (NIH ImageJ, versão 1.32j)
.
Os resultados são expressos como unidade de densitometria relativa (RDU) após normalização com valores densitométricos da banda obtido para α-tubulina.
modelos de murino de xenoenxertos de cancro da tiróide
isentos de agentes patogénicos 4-5 semanas de idade nua
(nu /nu)
ratos (Charles River , EUA) foram utilizados para o estabelecimento de xenoenxertos de cancro da tiróide
in vivo
. Os ratos foram mantidos em gaiolas de 4 animais cada um com água e comida
ad libitum
. Galectina-3 expressando e altamente tumorigênico pouco diferenciado linha de células de carcinoma folicular da tiróide (ARO) e as células ARO derivado galectina-3 knockout (ARO-GAL3 negativo) foram considerados para estas experiências.
de tipo selvagem e interferiu ARO as células foram mantidas em condições padrão de cultura como referido acima, isoladas a partir de placas de cultura de tecidos com tripsina 0,05%, EDTA a 0,02% (Gibco), lavadas em PBS estéril e injectadas subcutaneamente em ratinhos nus, a uma concentração variando de 7 × 10
6 a 10
7 células /0.2 solução salina ml, dependendo da experiência. Injecção das células foi realizada utilizando uma agulha padrão de insulina.
n anestesia era necessário. Cinquenta animais foram utilizados em três diferentes conjuntos de experimentos para estabelecer xenografs tumorais. Os ratos foram examinados três vezes por semana para os sinais de crescimento tumoral mensurável.
Foram selecionados os ratos para
In vivo
experimentos com imagens quando o peso do tumor foi de cerca de 0,5-1 g. Para determinar o
In vivo
expressão de galectina-3 em xenoenxertos de tumor, alguns dos tumores foram excisados cirurgicamente e usado para galectina-3 Análise da expressão como descrito acima. Este trabalho foi realizado de acordo com as orientações específicas fornecidas pelo Ministério da Saúde Pública italiana para a experimentação animal. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional de experimentação animal no Instituto do Câncer Regina Elena Nacional de Roma. O biotério no NCI de Roma é certificada pelo Ministério da Saúde Pública italiana.
rotulagem Rádio de anticorpo monoclonal para galectina-3
Affinity purificada e altamente concentrada (5 mg /ml) anticorpo monoclonal humano para galectina-3 (Mabtech, Nacka, Suécia) foi marcado com rádio, usando o método previamente relatada [22]. Resumidamente, as pontes de dissulfureto de anticorpo foram reduzidos utilizando um excesso molar de 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos à temperatura ambiente seguido de purificação com uma coluna de Sephadex G-25 (Amersham Biosciences GmbH, Reino Unido) e tampão de fosfato frio purgado com azoto pH 7,4 como eluente. O anticorpo reduzido foi armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Activado galectina-3 mAb (400 ug /200 ul de volume) foi marcado por adição de 7 mL de uma diposphonate-metileno (MDP) kit de exame ósseo (Medrotec®, Amersham Saúde, Reino Unido) como descrito anteriormente [22] e 10 mCi (370 MBq) de
99mTcO
4
– recém-eluído a partir de (
99Mo /
99m gerador) (GE-Healthcare, UK). eficiência de marcação (LE) foi avaliada usando instantâneo A cromatografia em camada fina (ITLC-SG, VWR, Itália) com NaCl a 0,9% como fase móvel.
As tiras foram analisados por um scanner computadorizado mini-rádio (Bioscan sistema , Itália). LE, foi . 95% com uma actividade específica final de 70 uCi /ug (Fig. S1 online)
De forma a optimizar a eficiência de marcação com anticorpos diversos experimentos foram realizados variando a razão molar de 2-mercaptoetanol /mAb (intervalo: 1.000:1 para 4.000:1) ea taxa de mAb /
99m para a rotulagem (intervalo 250.000:1 para 4.500.000:1)
a redução das pontes de dissulfeto em um. proporção molar de 2145:1 foram usadas (2-mercaptoetanol /mAb) e uma proporção molar de 1,500,000:1 para Ab /
99mTc deu o maior de LE
99mTc-anti-galectina-3 e para todas as outras experiências (Fig. S1 online).
estudos de estabilidade específicos foram realizados incubando rádio fresco anticorpo marcado em solução salina ou de plasma humano a 37 ° C durante 24 horas e avaliar a pureza radiofármaco por ITLC-SG em diferentes pontos de tempo (1 hr, 3 horas, 6 horas e 24 horas). A estabilidade em solução salina e o plasma foi elevada durante as primeiras 6 horas ( 90% e 80% de solução salina e de plasma, respectivamente) com uma ligeira diminuição às 24 h (Fig. S1 online)
. alta resolução Gamma Camera
a Câmara gama alta resolução (HRC) (Li-tech Srl, Itália), mostrado na figura S2 on-line é composto por uma estrutura cristalina de colimador acoplado a um Hamamatsu H8500 (Hamamatsu, Japão) posição Sensitive Foto Multiplicador de Tubo (PSPMT), carregue a eletrônica de leitura e um sistema de aquisição de dados
O colimador buraco paralelo patenteada, já descrito [24] – [25]. é feita de tungstênio puro, com 200 mm septos de espessura. É constituída por um colimador 24 milímetros disposta sobre uma estrutura de colimador 6 milímetros adjuvante, em que os cristais são integrados nos orifícios. A estrutura de cintilação é composto por 20 × 20 Csl (Tl) cristais array (Spectra Physics-Hilger, UK) com um campo de visão (FOV) de 49,0 × 49,0 milímetros
2. As dimensões de cristal são 2,05 × 2,05 × 5,0 milímetros
3 e cada cristal é coberto by100 mm epóxi branca reflexiva em seus cinco superfícies cegas. A estrutura cristalina de colimador é acoplado ao PSPMT via graxa óptica.
O H8500 PSPMT tem um tamanho externo de 52,0 × 52,0 × 18,0 mm
3 com uma área ativa de 49,0 × 49,0 mm
2. O fotocatodo é bi-alcalino e o sistema de multiplicação, composta por dinodos canal 12 do metal, proporciona um ganho de 3 × 10
6 @ -1000 V.
A carga multiplicada é recolhido por uma matriz de 8 × 8 ânodos.
A leitura é um miniaturizados (52,0 × 52,0 × 5,0 mm
3) eletrônica front-end, e os sinais são amostrados com uma placa ADC compacto USB dedicado. O sistema de aquisição oferece 4 canais em 20 M amostras /seg. aquisição e processamento de dados é realizada em um sistema baseado em Linux equipados com ARM PXA255 CPU com 10 tela sensível ao toque “. O sistema de controle e software de processamento de dados são aplicações proprietários desenvolvidos em linguagem C ++. O sistema permite a execução de uma aquisição em tempo real, com um tempo de actualização de 0,5 seg. O sistema é concebido para ser uma bateria operada dispositivo portátil; Como consequência, os principais pesos do detector de cerca de 2 kg, enquanto o peso total é de cerca de 4,5 kg.
A resolução de energia HRC é cerca de 20% FWHM @ 140 keV (
99m) ao longo de todo o FOV. A sensibilidade é de 210 cps /MBq ea uniformidade é ± 5%, enquanto que fornece 2,2 milímetros intrínseca resolução espacial adequada para nossos experimentos Imaging
in vivo com camundongos
xenoenxerto de tumor, e
ex-vivo
com espécimes cirúrgicos derivadas de pacientes humanos.
ex-vivo de imagens de cancro da tiróide humana
Como uma prova de conceito para geração de imagens diferenciadas câncer de tireóide em humanos, foi realizada
ex-vivo
estudos de ligação utilizando como alvo um nó cervical metastático fresco linfa extirpado de um paciente tendo um carcinoma papilar da tiróide. Imediatamente após a remoção cirúrgica do nódulo linfático foi cortada em metade longitudinalmente através da lesão do cancro e as duas secções de tecido foram incubadas a 37 ° C durante 3 h numa solução de 50 ml contendo 2 uCi de
99mTc-anti-Gal-3 ( 0,1 ug de proteína) em solução salina com 1% de HSA na presença ou ausência de 100 ug de anti-Gal-3 anticorpo não marcado
resultados
de forma a avaliar a especificidade de ligação de um
mAb a galectina-3
in vivo
, seis animais portadores galectina-3 xenotransplantes de carcinoma positivos (ARO-Gal-3
+) foram considerados de uma experiência preliminar.
Ratos com massa de tumor de cerca de 1 g foram injectados na veia da cauda (iv) com 100 jiCi de
mAb para galectina-3 marcado com 99mTc (30 ug proteína /em 100 ul de solução salina). As imagens foram adquiridas em 1 hora, 3 horas, 6 horas, 9 horas e 24 horas após a injecção, usando a câmera mini-gama. A galectina-3 immunotargeting de tumores ARO foi altamente eficaz em ratinhos xenoenxertados. Uma área central da necrose tumoral (confirmado histologicamente) com capacidades de ligação do radiofármaco foi correctamente descrita num dos casos (Fig. S2 on-line). As experiências preliminares com diferentes tumores positivos para galectina-3, incluindo melanomas, linfomas e carcinomas da mama, também foram consideradas para este fim com resultados sobrepostos (dados não mostrados). Como esperado, a maioria dos anticorpo marcado rádio galectina-3 foi concentrado no fígado de acordo com a folga de mAbs exógenos a partir do sangue [26] (Fig. S2 on-line). A fim de optimizar a captura de imagem e para demonstrar a especificidade de ligação do mAb a galectina-3 um maior
In vivo
experiência (repetida em triplicado) foi considerada.
A experiência incluiu 12 ratinhos xenoenxertados , dois grupos de seis animais cada. O primeiro grupo foi transplantado com 3 a galectina-ARO células positivas a uma concentração de 5-8 x 10
6 células /0,2 ml de solução salina /ratinho; o segundo grupo de ratinhos foi transplantado com células de galectina-3 knockout Aro (ARO-GAL3 negativo), obtidos usando uma interferência específica de galectina-3 de ARN (iARN) [20].
ARO células negativas-GAL3 eram Injectaram-se subcutaneamente na concentração de 10
7cells /0,2 ml de solução salina /rato, a fim de promover um crescimento tumoral rápido
in vivo
em cerca de 4 dias.
Isto foi necessário para manter um eficiente infra-regulação da expressão de galectina-3 no estábulo interferiu células ARO, crescendo
in vivo
na ausência de puromycine antibiótico como seletiva. Galectina-3 sub-regulação estável interferiu células ARO foi verificada em western blot em diferentes pontos de tempo (12-72 horas). Após 4 dias a partir da injecção das células todos os ratos desenvolveram um tumor subcutâneo visível com um tamanho de diâmetro médio de 0,5 cm. Os animais foram então injectados na veia da cauda com 100 uCi de
mAb para galectina-3 (proteína de 30 ug) e as imagens de corpo inteiro foram adquiridos em 1 hora, 3 horas, 6 horas, 9 horas e 24 horas marcado com 99mTc usando a câmera de alta resolução gama.
as imagens foram analisadas desenho das regiões de interesse (ROI) sobre o tumor implantado e sobre o músculo lateral do contador tomado como plano de fundo. Como esperado, a melhor visualização das ARO-Gal-3
+ xenoenxertos foi obtida entre 6 e 9 horas a partir da injecção do traçador, enquanto que a galectina-3 tumores negativos não foram detectados em todos os (Fig. 1 os painéis A e B) . Os tumores foram finalmente explantado para avaliação histológica e análise imuno-fenotípica, como mostrado na Figura 1.
Em um conjunto diferente de experiências, 20 ratinhos xenoenxertados ARO foram injectados com 100 uCi de
mAb marcado com 99mTc para galectina -3 (proteína de 30 ug) e 5 grupos de 4 animais cada foram sacrificados às 3 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas e 24 horas após a injecção, respectivamente.
As amostras de tecido a partir de sangue, fígado, baço, rim, intestino delgado, intestino grosso, musculares e tumorais ARO xenoenxertos foram removidos, pesados e contados para a presença de radioactividade. Todos os animais foram fotografadas antes de matar com resultados reprodutíveis (dados não mostrados). O
in vivo
bio-distribuição de opção denominado galectina 3-mAb expresso em percentagem da dose injectada por grama de tecido (% ID /g), mostrou uma depuração do sangue rápida do radiofármaco dentro de 3 horas de injeção. A maior parte da radioatividade foi detectada no fígado e rins, indicando uma depuração rápida do marcador
via in the hepática e do trato urinário (tabela 1).
Como esperado, a captação tumoral de o mAb específico de galectina-3
99mTc-rotulado aumentou de 3 a 9 horas pós-injecção. Aos 6 horas após a injecção os tumores alvo eram claramente visíveis enquanto a atividade de corpo inteiro tinha essencialmente apagadas (tabela 1 e fig. S2 online)
.
Embora a tradução destes resultados na prática clínica vai exigir o uso de mAbs humanizados ligados a diferentes radionuclídeos e mais extensos estudos pré-clínicos, tentamos simular uma imagem baseada em galectina-3 de cancro da tiróide humana
ex-vivo
. Para este objectivo, um nódulo linfático cervical fresco cirurgicamente excisadas a partir de um paciente tendo uma metástase de carcinoma papilar da tiróide (histologicamente confirmado), foi usada como alvo para o estudo da eficiência de ligação do traçador específico Gal-3.
Imediatamente após a ressecção cirúrgica remoção do nódulo linfático foi cortada ao meio através da lesão do cancro e foi incubada a 37 ° C durante 3 horas em solução de 50 ml de solução salina contendo 2 uCi de
99mTc-mAb para galectina-3 (0,1 ug de proteína) e 1% humanos albumina de soro, na presença ou ausência de 100 ng de não marcada (fria) de anti-galectina-3 mAb (ensaio de deslocamento).
Após lavagem extensa em solução salina uma imagem comparativa das duas preparações de tecido foi realizada. Os resultados desta experiência são mostrados na Figura 2.
A figura mostra o modelo de nódulos linfáticos cortadas ao meio longitudinalmente e fotografadas usando o mini-câmera gama após 1 hora e 2 horas de incubação com 2 uCi de
-99mTc mAb marcado com a galectina-3 (0,1 ug de proteína) em solução salina, na presença (painel B) ou não (painel a) de um excesso (100 ug) de mAb não marcado específico de galectina-3. O painel A mostra a detecção do tumor por radiofármaco após 1 hora e 2 horas de incubação. O painel B mostra uma menor aceitação consistente do radiofármaco na presença de um excesso de unlabelled mAb anti-gal3-, devido ao efeito de deslocamento específico.
A câmera mini-gamma prontamente detectada a metástase do câncer de tireóide (painel a), enquanto que uma absorção tumoral escassa do radiofármaco foi visível no controle, devido ao efeito de deslocação do mAb frio em excesso (painel B).
Discussão
em conjunto estes resultados sugerem a possibilidade de detectar cancro da tiróide e outras galectina-3 que expressam tumores
in vivo
usando um específico radio-imunocintigrafia galectina-3. O uso de galectina-3 radiofármaco para a detecção de cancro da tiróide
In vivo
é suportado por um lógica molecular sólido [5], [7] – [10]. Além disso, demonstramos recentemente que galectina-3 immunotargeting representa uma ferramenta de diagnóstico útil para a identificação de proliferações de tireóide no pré-operatório malignas em bases imuno-citológico, embora alguns carcinomas da tiróide (cerca de 10-15%, dependendo pelos estudos) não expressam galectina-3 [10] – [14], [17]. O rádio-imunocintigrafia galectina-3 com base proposto aqui, fornece informações biológicas sobre nódulos da tireóide e representa um guia útil para identificar corretamente essas proliferações de tireóide que devem ser avaliadas com citologia e /ou prontamente excisadas.
Combinando imagiologia galectina-3 com tireóide FNA-citologia, na verdade, pode permitir a distinção entre pré-operatório benigna de proliferação maligna da tiróide com alta eficiência. Consequentemente, muitos tireoidectomias desnecessárias poderia ser evitada e o uso clínico de cintigrafia da tiróide convencional com iodeto de rádio, que só proporciona informação funcional em condições específicas da tiróide, pode ser restrito a questões clínicas mais seleccionados. Outros estudos que utilizam a galectina-3 mAbs humanizados específicos conjugados com radionuclidos será necessário confirmar e validar estas conclusões. Se a abordagem diagnóstica proposta irá ser bem sucedida um rádio-ablação específica de galectina 3 tumores que expressam também pode ser explorado usando galectina-3 mAbs específicos conjugados com diferentes compostos de rádio (ou seja,
186Re,
177Lu ou
90Y,
64Cu,
67Cu). ‘Radiação terapia-alvo “Um galectina-3 proporciona a dose de radiação especificamente para o tumor positivo de galectina-3 com exposição limitada de tecidos normais. Penetração de raios beta nos tecidos vivos é de vários milímetros e do efeito terapêutico pode ser obtido também nas células cancerosas que não ocupam diretamente o radiofármaco (efeito de cross-fogo). Esta abordagem pode ser útil tanto para detecção e tratamento de micro carcinomas papilares (lesões menores que 1 cm, comumente formuladas ‘
oculto PTC
‘), que estão atualmente indetectável no pré-operatório.
Além disso, a possibilidade de tratar doenças malignas da tiróide primários e metastáticos que são galectina-3 positivas, mas não de iodo ávido e por essa razão eles não respondem à terapia de rádio-metabólica convencional com
131Iodine, representa uma importante conquista na área da oncologia, que será investigado.
os dados preliminares de
in vivo
imagem de galectina-3 melanomas positivos, linfomas e carcinomas da mama também têm sido obtidos abrindo possibilidades interessantes para o futuro de usar rádio mAbs marcados para galectin- 3 para
in vivo
imagiologia e tratamento de diferentes tipos de tumores malignos humanos [27] – [31]
Informações de Apoio
Figura S1..
estabilidade e eficiência de marcação do radiofármaco de galectina-3. A estabilidade do radiofármaco foi avaliada por incubação de uma amostra do mAb marcado com rádio em solução salina e de soro durante 24 horas a 37 ° C. A percentagem de tecnécio ligado ao mAb foi avaliada por Instant Camada Fina Chromatography- sílica gel à base (ITLC-SG) em tiras de diferentes pontos de tempo. O gráfico mostra a retenção de tecnécio que varia entre 100% e 85% durante as primeiras seis horas (cerca de 360 minutos), com uma ligeira diminuição de 6 a 24 horas (painel superior). A actividade para o mAb marcado radioactivamente anti galectina-3 foi avaliada numa experiência de titulação. A melhor relação de mAb /Tc foi calculada através da variação da actividade de 99mTc adicionado a um volume estável de anticorpo reduzida. A eficiência de marcação (LE) foi avaliada por ITLC-SG. A proporção óptima de mAb /Tc encontrado foi 1.200.000 /1 correspondente a 30-40 mCi de actividade e uma eficiência de marcação até 95%. Uma atividade superior a este valor não aumentou o LE (painel inferior B)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0003768.s001
(8,52 MB DOC)
Figura S2.
imagiologia de tumores in vivo utilizando 99mTc-mAb marcado com a galectina-3 e um mini câmara gama portátil de alta resolução. A) A câmara portátil de alta resolução mini-gama utilizada neste estudo. B) A imagem captada pela câmara gamma de alta resolução em um rato tendo o positivo xenoenxerto de carcinoma da tiróide galectina-3 ARO, após 6 horas de i.v. injecção de 100 ^ Ci de 99mTc-rotulado mAb para galectina-3. O tumor confirmado na histologia foi de 1,2 cm de diâmetro e mostrou uma grande área de necrose central, correspondente à lacuna que não conseguiu corrigir o radiofármaco (seta)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0003768.s002
(10,39 MB DOC)
Reconhecimentos
Agradecemos Marco Paolo Martegani para a assistência técnica na preparação do manuscrito.