Abstract
localização do tecido da expressão do gene é cada vez mais importante para a interpretação precisa de conjuntos de dados em larga escala a partir de análises de expressão e de mutação . Para este fim, tem-se (1) desenvolveram um processo robusto e escalável para a geração de sondas de hibridação de mRNA, fornecendo 95% de taxa de sucesso primeira passagem na geração de sonda para qualquer gene alvo humana e (2), adoptado um procedimento de coloração automatizado para análises de tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina e microarrays de tecido. O
in situ
padrões de mRNA e expressão de proteínas de genes com conhecidos, bem como padrões de expressão tecido desconhecidos foram analisados em tecidos normais e malignas para avaliar procedimento especificidade e se
in situ
hibridização pode ser usado para validar novos anticorpos. Nós demonstramos concordância entre
in situ
transcrição e expressão de proteínas padrões de biomarcadores patologia conhecidos
KRT17
,
CHGA
,
MKI67
,
PECAM1
e
VIL1
e fornecer validação independente para novos anticorpos para os biomarcadores
BRD1
,
EZH2
,
JUP Comprar e
SATB2
. O presente estudo fornece uma base para abrangente
in situ
gene definir ou análises do transcriptoma de tecidos normais e tumorais humanas
Citation:. Kiflemariam S, Andersson S, Asplund A, Pontén F, Sjöblom T (2012) Scalable
In Situ Hibridização
em matrizes de tecido para Validação de Câncer Novel e biomarcadores de tecido-específicas. PLoS ONE 7 (3): e32927. doi: 10.1371 /journal.pone.0032927
editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 19 de setembro de 2011; Aceito: 05 de fevereiro de 2012; Publicação: 08 de março de 2012
Direitos de autor: © 2012 Kiflemariam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Cancer Foundation Sueco [11 0186] e da Fundação Beijer para TS, e da Fundação Wallenberg Knut e Alice [2002,0087] para FP. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
precisos e específicos de localização do tecido da expressão do gene é instrumental para a correta interpretação dos dados de transcriptoma de tecidos complexos, tais como tumores de pacientes. A rápida acumulação de dados de mutação exome de tumores também produz novos alvos terapêuticos putativos, e é, por conseguinte, valiosos para investigar a expressão do gene de tecido para prever efeitos e efeitos secundários de novas terapias de cancro. validação de especificidade dos anticorpos de diagnóstico e terapêutica é outra aplicação onde
in situ
expressão genética analisa poderia contribuir conhecimento essencial. Para optimizar a utilização de tal
in situ
expressão genética analisa na biologia do câncer, é preciso (1) Métodos para a geração fácil e eficiente de sondas para qualquer gene alvo, e (2) procedimentos automatizados e robustos para coloração de (FFPE) tecidos embebidos em parafina e microarrays de tecido (TMAs).
hibridização in situ em formol fixa (ish) técnicas empregam sondas de ARN marcadas para analisar a expressão e localização de transcritos de mRNA específicos em tecidos com resolução de tipo de célula . Tais sondas são tipicamente geradas por
In vitro
transcrição de plasmídeo ou de produtos de RT-PCR na presença de uma base conjugado hapteno, tais como a digoxigenina-UTP. Após a hibridação, as sondas ligadas são detectadas por imuno-histoquimica anti-hapteno cromogénico. Considerando cortes de tecidos congelados são mais frequentemente utilizados em mRNA ISH, tecidos FFPE arquivo e microarrays de tecido também pode ser empregado [1]. Como ARNm ISH é tecnicamente difícil e envolve muitos passos experimentais, vários formatos de automação diferentes têm sido desenvolvidos. O sistema Tecan GenePaint é um sistema robótico aberto que tem sido utilizado com sucesso para traçar o transcriptoma do mouse em tecidos congelados [2], [3]. Resumidamente, as reacções de pré-hibridação, hibridação e detecção do sinal são realizadas numa câmara de fluxo, onde um sistema de solvente automatizado adiciona soluções diferentes em paralelo. Este sistema em conjunto com a tecnologia de detecção permite um caudal diário de até duas lâminas cem [4]. os esforços de todo o proteoma já demonstraram a viabilidade de grande imunocoloração FFPE escala [5], [6]. Correlacionando a expressão da proteína e mRNA irá fornecer uma ferramenta de validação independente tanto para imuno-histoquímica (IHQ) e ISH, e permitir a descoberta de falsos positivos de um ou outro método.
Para obter uma maneira flexível para analisar a expressão de tecido de conjuntos de genes grandes em microarrays de tecido FFPE, criámos um processo simples e escalonável com base em PCR para a geração de sondas de ARNm de qualquer gene alvo da mesma biblioteca de cDNA e desenvolvido ainda um sistema de coloração automatizado, onde 48 genes podem ser processados em 48 tecidos ou TMA numa corrida única. Em seguida, validou a especificidade e escalabilidade desta abordagem por ISH paralelo e IHC segmentação biomarcadores conhecidos na patologia. Por fim, demonstrar a especificidade de anticorpos para novos biomarcadores específicos de tecidos ou de câncer usando
in situ
hibridização.
Resultados
otimização Tecnologia
Dezessete genes foram escolhidos para representar biomarcadores patologia bem estabelecidos ou novos biomarcadores específicos de tecidos ou câncer descobertos dentro do projeto Protein Human Atlas [5]. Estes bromodomain incluído contendo 1 (
BRD1
), chromogranin-A (
CHGA
), histona-lisina N-metiltransferase (
EZH2
), família com semelhança de sequência 174 membro B (
FAM174B
), glutamato descarboxilase 1 (
GAD1
), Janus quinase 3 (
JAK3
), placoglobina junção (
JUP
), queratina 17 (
KRT17
), v-sim-1 Yamaguchi sarcoma viral homólogo oncogene relacionado (
LYN
), mix1 homeobox-like 1 (
MIXL1
), o antígeno Ki- 67 (
MKI67
), 6A fosfodiesterase (
PDE6A
), plaquetas molécula de adesão de células endoteliais 1 (
PECAM1
), proteína tirosina fosfatase tipo C (
PTPRC
), especial AT-rich de ligação sequência da proteína 2 (
SATB2
), villin1 (
VIL1
) e proteína 473 (dedo de zinco
ZNF473
). Os produtos de PCR desejados e sondas de RNA foram obtidos para todos os genes (Figura S1).
A seguir, determinar se o comprimento da sonda RNA afeta a sensibilidade ou especificidade de sinais ISH utilizando duas abordagens diferentes. Na primeira abordagem, sondas de RNA para
CHGA
e
KRT17
foram fragmentados em duplicidade, usando métodos catalisada-íon alkaline- e metal investigar se mais curto comprimento da sonda daria um sinal mais elevado devido a uma melhor penetração nos tecidos. Ambos os protocolos foram adaptados para uso com sondas de RNA DIG-UTP-rotulados. Não houve diferença significativa no sinal pode ser visto entre sondas fragmentados e não fragmentados ao avaliar a coloração em condições normais de cólon, rim, fígado, baço e de amígdalas (dados não apresentados). A segunda abordagem foi investigar se sondas maiores teria um impacto sobre o sinal ISH. Três sondas diferentes segmentação
PDGFRB
(beta receptor do factor de crescimento derivado das plaquetas) com comprimentos de 500 pb, 1000 pb e 1500 pb foram gerados. Não houve diferença significativa no sinal entre os comprimentos de sonda pode ser visto quando se avalia a coloração em glomérulos de rim, no entanto, o fundo foi aumentada para 1000 pb e 1500 pb, quando se comparam as sondas as sondas de sentido e anti-sentido de ARN (dados não mostrados) [7].
foi realizada adoção do sistema GenePaint para arrays de tecidos humanos
para facilitar uma abordagem em larga escala, otimização de proteinase K concentração. Três genes com vários níveis de expressão,
PDGFRB, KRT17
e beta actina (
ACTB
), foram escolhidos e avaliados em um tissue microarray com cólon normal, rim, fígado, baço e tonsilas. As concentrações ensaiadas foram de 2,5, 5, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 ug /ml. Para
ACTB
uma concentração de 40 ug /ml foi suficiente para proporcionar indicações claras e distintas sem afectar a morfologia do tecido. Para
KRT17
e
PDGFRB
, uma concentração proteinase K de 60 ug /ml foi ideal quando comparando todos os diferentes tecidos na matriz e, portanto, foi escolhido para novas experiências. Para visualizar os genes expressos em níveis baixos, duplos ciclos de amplificação de sinal de tiramida-base foi introduzida. Além disso, a importância de cortes de tecido fresco foi determinado uma vez que fraco ou nenhum sinal foi observado para as secções de tecido com mais de 3 semanas (dados não apresentados).
Validação de coloração ISH em matrizes de tecido
secções de tecido consecutivos foram coradas usando o senso ISH sonda, ISH sonda antisense e imuno-histoquímica para comparar a expressão de genes no nível de proteína mRNA e. Para um subconjunto dos genes analisados (
CHGA
,
KRT17
,
LYN
,
MKI67
,
PDE6A
,
PECAM1
,
PTPRC
e
VIL1
), padrões de expressão de proteína à base de imunohistoquímica são bem conhecidos e estabelecidos. Estes objectivos foram utilizados para comparar a expressão de proteínas e os transcritos correspondentes para a validação do procedimento ISH escalável. A proteína de filamento intermediário KRT17 foi, como esperado, altamente expresso numa grande variedade de células epiteliais diferenciadas, como demonstrado pela coloração da amígdala (Figura 1, A-C e Figura S3) e no brônquio (Figura S3). CHGA, um marcador para a diferenciação neuroendócrino, mostraram forte coloração em células neuroendócrinas do intestino (Figura 1, D-F), em ilhéus pancreáticos e órgãos endócrinos tais como a paratiróide (Figura S3). O marcador de proliferação bem caracterizado Ki-67 é expresso em G1, S, G2 e M fases do ciclo celular e muitas vezes utilizado para avaliar células em proliferação no interior dos tumores. As células em proliferação na base das criptas do cólon normal (Figura 1, G-I), na vulva anal e em amígdalas (figura S3) são mostrados. O sinal ISH para Ki-67 foi localizada em regiões específicas no núcleo de acordo com dados do mouse [8]. PECAM1 foi expressa nas células endoteliais, na maioria dos órgãos, exemplificado pela placenta ricamente vascularizado (Figura 1, J-L), do endométrio (pré menopausa) e nó de linfa (figura S3). VIL1 é uma proteína expressa na borda em escova do epitélio e, como tal altamente expressa nos túbulos renais e células glandulares do tracto gastrointestinal, tais como o cólon (Figura 1, H-S), apêndice e duodeno (Figura S3). Além disso, para
CHGA
,
PECAM1
e
VIL1
, dois pares de sondas de ARN independentes (Tabela S1) foram utilizados para a validação cruzada da especificidade da sonda. O tecido e padrão de distribuição celular de expressão tanto para ARNm e proteína foram semelhantes para estes cinco genes, confirmando a sensibilidade e especificidade da hibridação in situ automatizado em FFPE TMA. Para PDE6A, IHC mostraram coloração em alvéolos, músculo esquelético, brônquio e células nos glomérulos renais. ARNm e proteína de correlação foi observada apenas em dois casos de músculo esquelético. anticorpos estabelecidos para Lyn e PTPRC mostrou membranoso e coloração citoplasmática distinta em tecidos linfóides e células glandulares do tracto gastrointestinal, e coloração citoplasmática selectiva em tecido linfóide, respectivamente. Não houve correlação entre a proteína e expressão de mRNA (Figura S5). Para
PTPRC
, a falta de coloração ISH foi cruzada validado com dois pares de sondas de ARN independentes (Tabela S1).
sinais ISH são vistos como coloração azul /roxa com núcleos contracorados em metil verde, Considerando IHC sinais estão em marrom com counterstain hematoxilina.
A-C
: queratina 17 (
KRT17
) em amígdalas,
D-F
: cromogranina A (
CHGA
) em dois pontos,
G-I
: Ki-67 (
MKI67
) em dois pontos,
J-L
: Platelet molécula de adesão de células endoteliais 1 (
PECAM1
) na placenta ,
M-O
: Villin-1 (
VIL1
) no cólon. matrizes de tecido foram hibridizadas com sondas de controlo sentido (A, D, G, J, M), as sondas anti-sentido (B, E, H, K, N), ou imunocoradas com anticorpos (C, F, I, L, S) segmentação o respectivo transcritos ou produtos proteicos. Todas as imagens foram obtidas a partir diapositivos digitalizados com um 40 × objetiva.
Validação de novos biomarcadores de anticorpos por ISH em matrizes de tecido
A expressão derivado de anticorpo no projeto Atlas proteína humana sugeridos ou uma expressão específica de tecido ou utilidade clínica no diagnóstico de câncer ou terapia para os novos biomarcadores putativos
BRD1
,
EZH2
,
FAM174B
,
GAD1
,
JAK3
,
JUP
,
MIXL1
,
SATB2
e
ZNF473
. Portanto, a análise da sua
In situ
expressão de mRNA e proteína nos tecidos normais podia fornecer validação da especificidade do anticorpo. BRD1 é conhecido por imuno-histoquímica para ser expresso em Purkinje e células neuronais no sistema nervoso central, as células em condutas seminiferus em testículo, células glandulares em próstata, glândula supra-renal e do apêndice e macrófagos no pulmão, o que foi confirmado por ISH (Figura 2, A-C e Figura S4). EZH2 é um biomarcador potencial de cancro como a sobre-expressão da proteína nuclear é visto numa variedade de cancros agressivos, incluindo cancro da mama, cancro da próstata e glioblastoma multiforme [9]. A expressão de genes foi encontrada em ambos transcrição (coloração citoplasmática) e proteína (coloração nuclear) em células glandulares em apêndice (Figura 2, D-F), duodeno e das trompas de Falópio (Figura S4), as células em condutas seminiferus em testículos e nos miócitos no coração músculos. JUP foi sugerido por IHC a ser um biomarcador específico do tecido expresso em anexiais epidérmicas e células da pele, o que foi confirmado por ISH (Figura 2, G-I) e em células epiteliais escamosas das amígdalas (figura S4). SATB2 é um biomarcador da novela para o cancro colorectal [10], em que a expressão do gene profiling demonstrou associação de infra-regulação transcricional com metástases e mau prognóstico [11]. Os anticorpos para SATB2 apresentou coloração nuclear de células glandulares do tracto gastrointestinal inferior, incluindo células da cripta do cólon (Figura 2, L). ISH concomitante matriz confirmada expressão transcrição SATB2 no citoplasma restrito ao epitélio do apêndice, cólon (Figura 2, J-K) e do recto (Figura S4), mas não em outros órgãos. Para a validação destes quatro novos biomarcadores, dois pares de sondas de ARN independente foram usadas para cada gene (Tabela S1). GAD1 mostrou ISH semelhante e coloração IHC em células e as células na camada molecular do cerebelo de Purkinje, mas nenhuma correlação foi observada em outros tecidos. A especificidade dos novos anticorpos para
FAM174B
,
JAK3
,
MIXL1
e
ZNF473
não pôde ser verificada por ISH (Figura S5). Para
JAK3
, a falta de coloração ISH foi cruzada validado com dois pares de sondas de ARN independentes mas para
FAM174B
,
MIXL1
e
ZNF473
, única um par sonda poderia ser projetado devido a tanto regiões codificantes de proteína muito curto ou muito alta homologia com outros genes (Tabela S1).
sinais ISH são vistos como coloração azul /roxa com núcleos contracorados em metil verde, enquanto IHC sinais estão em marrom com counterstain hematoxilina.
A-C
: Bromodomain contendo 1 (
BRD1
) na glândula supra-renal,
D-F
: histona-lisina N-metiltransferase (
EZH2
) no apêndice (coloração nuclear e citoplasmática de proteína e mRNA, respectivamente),
G-I
: junção placoglobina (
JUP
) na pele,
J-L
: especial AT-rich de ligação sequência da proteína 2 (
SATB2
) em dois pontos (coloração nuclear e citoplasmática de proteína e mRNA, respectivamente). matrizes de tecido foram hibridizadas com sondas de controlo sentido (A, D, G, J), sondas anti-sentido (B, E, H, K), ou imunocoradas com anticorpos (C, F, I, L) a segmentação dos respectivos transcritos ou produtos proteicos . Todas as imagens foram obtidas a partir diapositivos digitalizados com um 40 × objetiva.
análises paralelas de proteína SATB2 e expressão transcrição em FFPE matrizes de cancro colorectal
proteínas e expressão de mRNA de SATB2 foi avaliada em cancros colo usando uma matriz que engloba 60 tumores primários em duplicado. Anotação foi realizada com base em uma escala de três-grade. Um par não contêm tecido do tumor, e dos restantes 59 amostras, 44 apresentaram concordância total entre IHC e expressão em células glandulares ISH (Figura 3). Doze mostrou concordância semi como coloração foi observada, mas com intensidades diferentes, enquanto que 3 amostras não apresentaram nenhuma correlação. Observou-se concordância entre proteína e padrão de expressão de mRNA em um total de 56 amostras (teste kappa de Cohen, k = 0,68).
sinais ISH são vistos como coloração azul /roxa com núcleos contracorados em verde metilo, enquanto que os sinais de IHC estão em marrom com counterstain hematoxilina. matrizes de tecido foram hibridizadas com a sonda de controlo sentido (A, D, G, J), sonda de anti-sentido (B, E, H, K) ou imunocoradas com anticorpo (C, F, I, L). Todas as imagens foram obtidas a partir diapositivos digitalizados com um 40 × objetiva.
Discussão
Scaling ISH abordagens para conjunto de genes ou análises de toda a exome exige condutas para a síntese da sonda, hibridação, análise e anotação. Considerando que o trabalho solo muito tem sido realizado no quadro de grandes estudos rato transcriptoma em tecidos congelados, as modificações são necessárias para ISH bem sucedido e reprodutível em materiais FFPE. Para a síntese da sonda fácil, é possível concluir que a informática cuidadosas combinados com a utilização de uma biblioteca de ADNc humano reunido (MegaMan) implica uma elevada taxa de sucesso de primeira passagem no modelo de geração da sonda. Esta biblioteca de ADNc a partir de ARNm envolve 32 tecidos humanos e linhas 34 celulares de cancro humano garante uma boa representação dos transcritos com diferentes níveis de expressão e as variantes de splicing. Em projectos paralelos, esta abordagem tem êxito foi usado para gerar um total de 700 sondas com uma taxa de sucesso de primeira passagem de 95% (dados não mostrados) factores .Essential para coloração bem sucedida que diferem dos procedimentos publicados anteriormente que empregam tecidos congelados foram o uso de tecido recentemente seccionada, uma vez que fraco ou não se observou coloração de secções de tecido FFPE antigos possivelmente devido a oxidação de ARN na superfície exposta ou condições de fixação insatisfatórios que afecta a qualidade do ARN, uma concentração mais elevada de proteinase K, e dois ciclos de biotina tiramida com base na amplificação de sinal. Embora este último pode resultar em níveis de fundo ligeiramente mais elevadas, isto é na nossa experiência uma forma conveniente de aumentar a intensidade do sinal.
A especificidade e sensibilidade do ISH foi cuidadosamente avaliada por coloração de secções consecutivas do mesmo TMA englobando ~ 40 tipos de tecidos normais no corpo humano. Os padrões de coloração ISH e IHC de
KRT17
,
CHGA
,
MKI67
,
PECAM1
e
VIL1
eram idênticos em tecido tipos, uma selecção de amostras representativas são mostrados na Figura 1 e Figura S3, proporcionando assim forte validação da abordagem ISH. Este elevado grau de concordância está de acordo com observações anteriores de projetos rato transcriptoma. No entanto, uma melhoria muito necessária para permitir a mineração de dados eficiente da ISH e IHC é uma ontologia padronizado para anotação dos tecidos humanos, em analogia com a ontologia do mouse EMAP anatomia [3].
sensibilidade e especificidade de anticorpos é um dos principais preocupação em imuno-histoquímica, especialmente em projectos de grande dimensão onde numerosos anticorpos estão sendo produzidos para as metas com padrões de expressão desconhecidos. validação especificidade dos anticorpos para o grau de diagnóstico pode ser executada através da obtenção de padrão de coloração altamente semelhante com um anticorpo criado para um epitopo diferente do mesmo antigénio [6], a perda de sinal em ratinhos knock-out ou outro organismo modelo ou padrão de coloração altamente semelhante com
in situ
hibridização. Nós aqui demonstrar a viabilidade da última abordagem à escala organismo no ser humano, como TMA abrangendo praticamente todos os tecidos normais podem ser analisados em uma única experiência. Fomos capazes de verificar a especificidade dos novos anticorpos para
BRD1
,
EZH2
,
JUP
e
SATB2
, com dois pares de sondas de ARN independentes, confirmando que ISH pode fornecer validação especificidade independente. Uma selecção de amostras representativas é visto na Figura 2 e Figura S4. Em experiências paralelas, não fomos capazes de confirmar a especificidade dos novos anticorpos para
FAM174B
,
JAK3
,
MIXL1
e
ZNF473
(Figura S5) . A semi-correlação entre mRNA e expressão de proteína para
GAD1
e
PDE6A
pode ser devido a especificidade do anticorpo ou diferenças entre os processos de transcrição e tradução. A falta de correlação entre o mRNA e expressão de proteína para
LYN
e
PTPRC
pode ser devido a razões biológicas e técnicas. Os anticorpos para
LYN
e
PTPRC
está direcionando todas as isoformas conhecidas das proteínas e dos pares de sondas RNA estão localizados em regiões que estão presentes em todas as transcrições conhecidos. Também para PTPRC, foram utilizados dois pares de sondas de ARN independente, o que demonstra a falta de coloração ISH entre Inter TMA replica. Portanto, acreditamos que a falta de correlação entre a expressão de ARNm e proteína é provavelmente devido a razões biológicas, tais como pós-transcrição, translação e modificações pós-traducionais que afectam os níveis de ARNm e proteína. Além disso, mRNA decadência e meia-vida de proteína poderia ter um impacto sobre mRNA e correlação proteína. Outras fontes de discrepância entre IHC e ISH poderia ser a falta de sensibilidade ou especificidade em qualquer uma das abordagens; isso permite interpretação dos padrões de coloração concordantes como apoio da especificidade do anticorpo e os padrões discordantes como a falta de especificidade. Nos esforços de grande escala, os anticorpos com padrões de coloração ISH concordantes devem ser priorizados para análises posteriores ao contrário de anticorpos com coloração ISH discordantes ou em falta.
SATB2
, um fator de transcrição associado à matriz nuclear e um membro da família de especiais rica em AT proteínas de ligação, foi recentemente mostrado para ser expresso em células normais do tracto gastrointestinal inferior e em células de cancro de origem colorrectal. Devido ao padrão de expressão nuclear altamente específico para as células normais e malignas do tracto gastrointestinal, a expressão da proteína SATB2 foi sugerido como um biomarcador de diagnóstico clinicamente útil para cancros colorrectais, o terceiro cancro mais diagnosticado no mundo [10]. teste Kappa de Cohen foi realizada para determinar a concordância entre IHC e coloração ISH, demonstrando boa confiabilidade entre avaliadores. A tecnologia escalável aqui apresentado também permite análises de expressão de conjunto de genes em matrizes de tecido humano. Nós prevemos que a tirosina kinome, phosphatome tirosina, outros genes nas vias de câncer, juntamente com um grande número de genes do cancro candidato novos derivados de exome e sequenciação do genoma constituem os principais alvos de grande escala
in situ
caracterização baseada hibridização. Propomos que o mapeamento abrangente e sistemática da expressão
em
situ em tecidos humanos normais e malignas na resolução tipo de célula irá fornecer um conhecimento valioso, especialmente no desenvolvimento de medicamento contra o câncer como os resultados podem auxiliar na previsão de efeitos, orientar reposicionamento da disponíveis drogas alvo, e ajudar a prever a resposta aos medicamentos que inibem vários alvos moleculares diferentes. Ele também fornece a base técnica para o mapeamento de genes codificantes de proteínas humanas de expressão transcrição e, potencialmente, também outras espécies de RNA, em abordagens sistemáticas todo o genoma.
Materiais e Métodos
declaração Ética
o uso de matrizes de tecido HPA neste estudo é coberto pela licença ética HPA (EPN Uppsala 2002/577, 2005/338) e licença de ética aos investigadores (EPN Uppsala 2007/116). As identidades das amostras de tecido vestida não são conhecidos com os investigadores, nem serão liberar para o domínio público.
geração Probe
O procedimento de geração sonda está delineada na Figura S2. Foi desenvolvido um software próprio que selecciona as regiões de transcrição adequados para a concepção de sonda de hibridação nos genes de interesse, minimizando homologia com transcritos de outros genes do transcriptoma RefSeq humana, assegurando que as sequências de sondas estão presentes em transcritos RefSeq do gene de interesse e incluindo as regiões para abranger as fronteiras exão. Dois conjuntos independentes de iniciadores de PCR para a amplificação de produtos 500-600 nt foram gerados para cada gene usando Primer3 [12]. Uma sequência de promotor de T7 (5′-GCGTAATACGACTCACTATAGGG-3 ‘) foi incorporado na extremidade 5’ do iniciador para a frente ou inversa, respectivamente, para gerar o modelo ribossonda anti-sentido ou sentido. Todos os pares de iniciadores utilizados na produção da sonda encontram-se resumidos na Tabela S1.
MegaMan biblioteca transcriptoma humano de Stratagene, uma colecção de cADN criada utilizando ARNm a partir de 32 tecidos humanos e linhas 34 celulares de cancro humano, foi utilizada para a PCR (www. genomics.agilent.com). Cada reacção continha 2 mL de 10 x tampão de PCR (166 mM de (NH
4)
2SO
4, Tris 670 mM, pH 8,8, mM, 2-mercaptoetanol 100, MgCl 67 mM
2), dois ul de dNTPs (mM, GE Healthcare, Uppsala, Suécia 10), 1,2 ul de DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), 0,4 ul de iniciador directo (50 uM, Sigma-Aldrich), 0,4 ul de iniciador inverso (50 | iM, Sigma-Aldrich), 0,2 jil de polimerase de Taq (5 U /uL, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), 1 ul biblioteca MegaMan humano transcriptoma (160 ng /ul, (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA)) e MilliQ água até um volume de 20 ul. As condições de PCR incluíram aterragem temperaturas de recozimento que variam de 64 ° C a 57 ° C; 96 ° C durante 2 min; 3 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 64 ° C durante 10 s e 70 ° C durante 30 s; 3 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 61 ° C durante 10 s e 70 ° C durante 30 s; 3 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 58 ° C durante 10 s e 70 ° C durante 30 s; 41 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 57 ° C durante 10 s e 70 ° C durante 30 s, e uma extensão final de 5 min a 70 ° C. Os produtos de PCR foram corridos num gel de agarose a 1,25% para confirmar o tamanho do produto. Sentido e anti-ribossondas marcadas com digoxigenina foram gerados por
In vitro
transcrição dos produtos de PCR com DIG RNA mistura de marcação (Roche, Rotkreuz, Suíça) em um volume total de reacção de 5 ul. Um ug de cada sonda de ARN foi corrida num gel de TBE-ureia a 6% (Invitrogen) para confirmar o tamanho. Os estoques foram feitas diluindo sondas de ARN com água MilliQ a 200 ng /mL e armazenado em -80 ° C. soluções de trabalho de sonda de 20 ng /ul foram feitas a partir de soluções-mãe e armazenado em -20 ° C.
sondas de ARN foram fragmentados utilizando duas abordagens diferentes. Para a fragmentação catalisada-alcalino, dando fragmentos que variam 50-150 pb, sondas de ARN foram digeridos com tampão de carbonato de sódio 0,2 M (pH 10,2) a 60 ° C. O tempo de incubação é calculada por T = L
0-L
F /
K
L
0D
f, em que t é o tempo de incubação em minutos, L
0 e L
f são comprimentos iniciais e finais da sonda em kb, e
k
é a constante de velocidade para a hidrólise (aproximadamente 0,11 kb
-1min
-1). As reacções foram paradas por adição de acetato de sódio (pH 4,7) e as amostras foram precipitadas com etanol [13]. Um ug de cada sonda de ARN foi corrida num gel de TBE-ureia a 6% para confirmação tamanho. Para o metal fragmentação catalisada por ião, dando fragmentos entre 60-200 pb, as sondas de ARN foram incubados com cloreto de zinco em 100 mM de Tris-HCl 100 (pH 7) a 70 ° C durante 15 min. As reacções foram paradas com EDTA 0,5 M (pH 8) [14]. Um ug de cada sonda de ARN foi corrida num gel de TBE-ureia a 6% para confirmação tamanho.
Preparação do tecido
As matrizes de tecido foram utilizadas as matrizes padrão utilizados para imuno-histoquímica da proteína humano de ‘Atlas projeto (www.proteinatlas.org). Estas matrizes compreendem núcleos em triplicado de 1 mm de 48 tipos diferentes de tecido humano não-maligno [15] e duplicar núcleos de 1 mm de cancro colo-rectal primário [10]. microarrays de tecido com tumor e normais tecidos FFPE foram seccionados a 6 mm e montadas em lâminas de microscópio Superfrost Plus.
A hibridização in situ
As secções de tecido foram desparafinados em xileno, seguido de hidratação em um etanol graduado série (100%, 95% e 80%, em 3 min cada). A hibridação foi automatizado usando Tecan GenePaint (Tecan AG, Männedorf, Suíça), essencialmente como descrito [2], [4], [16]. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra forma. Resumidamente, a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada em 0,7% H
2O
2 em metanol, seguido por desproteinização em HCl 0,2 M e por digestão de 60 ug /ml de proteinase K (Roche). As secções de tecido foram pré-hibridados em tampão de hibridação (Ambion, Foster City, CA, EUA) sem sonda durante 30 min e depois incubadas com 200 ng /ml de digoxigenina-ribossonda marcada durante 4 horas a 64 ° C. Após hibridação, as secções de tecido foram lavadas em 5 × solução salina de citrato de sódio (SSC), 50% de formamida e 0,1 x SSC. Para detectar a sonda ligada, foi adicionado um anticorpo anti-digoxigenina (150 U /mL, Roche) conjugado com peroxidase de rábano. Após cinco lavagens em tampão de bloqueio, um passo de amplificação tiramida biotina foi realizada para aumentar a sensibilidade na detecção in situ (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). A biotina depositado foi detectado por neutravidina conjugado com fosfatase alcalina (2 mg /ml, ThermoScientific, Waltham, MA, EUA), que cliva o tetrazólio substrato cromogénico nitroazul (NBT) 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP ) para produzir um precipitado azul /púrpura no local da hibridação. Depois de 30 min o tempo de desenvolvimento, a reacção cromogénica foi parada por incubação das secções de tecido num tampão contendo EDTA, seguido por fixação em PFA a 4%. Os núcleos foram contrastadas com 2% metil verde e as lâminas foram desidratadas em álcoois graduados e montado num meio à base de resina.
A imuno-histoquímica
Resumidamente, as lâminas foram desparafinadas em xileno, hidratadas em álcoois graduados e bloqueadas durante a peroxidase endógena em 0,3% de peróxido de hidrogénio diluído em 95% de etanol. Para recuperação antigênica, uma câmara decloaking (Biocare Medical, Walnut Creek, CA; EUA) foi utilizado. As lâminas foram imersas e fervidas em tampão de citrato, pH 6 (Lab Vision, Värmdö, Suécia) durante 4 min a 125 ° C e, em seguida, deixada arrefecer até 90 ° C. Automated IHC foi realizada essencialmente como descrito [17], utilizando um instrumento Autostainer 480 (Lab Vision). As secções de tecido foram incubadas com os anticorpos primários (Tabela S2) e um sistema de visualização de polímero dextrano (UltraVision polímero LP HRP, Lab Vision) durante 30 minutos cada à temperatura ambiente e as lâminas foram desenvolvidas durante 10 min utilizando diaminobenzidina (Lab Vision) como cromogénio. Todas as incubações foram seguidas de uma lavagem em tampão de lavagem (Lab Vision). As lâminas foram contrastadas em hematoxilina de Mayer (Histolab, Gotemburgo, Suécia) ea tampa escorregou usando Pertex (Histolab) como meio de montagem.