Abstract

O legumain cisteína protease está envolvido em vários processos biológicos e patológicos, e a protease foi encontrado sobre-expressos e associado a um fenótipo invasivo e metastático em um número de tumores sólidos. Consequentemente, legumain tem sido proposto como um marcador de prognóstico para certos tipos de cancro, e um potencial alvo terapêutico. No entanto, detalhes sobre como legumain avança progressão maligna, além da regulação da sua actividade proteolítica não são claras. No presente trabalho, legumain expressão foi examinada em linhas celulares de cancro colorrectal. diferenças substanciais nas quantidades de formas legumain pró e ativos, juntamente com padrões de distribuição intracelular distintas, foram observados em HCT116 e células SW620 e xenoenxertos subcutâneos correspondente. Legumain é pensado para ser localizado e processado para a sua forma activa principalmente nos endo-lisossomos; No entanto, a distribuição subcelular permanece largamente inexplorado. Ao analisar fracções subcelulares, uma forma proteoliticamente activa de legumain foi encontrada no núcleo de ambas as linhas celulares, para além da residência canónica endo-lisossomal.

In situ

análises de expressão e actividade legumain confirmou a endo-lisossômico e localizações nucleares em células em cultura e, sobretudo, também em seções de xenotransplantes e biópsias de pacientes com câncer colorretal. Nas linhas de células HCT116 e SW620 legumain nuclear foi encontrada para compensar cerca de 13% e 17% do legumain total, respectivamente. Em similaridade com estudos anteriores sobre variantes nucleares de cisteína proteases relacionadas, legumain foi mostrado para processar histona H3.1. A descoberta de legumain localizada nuclear lança uma inteiramente nova arena da biologia e funções no cancro legumain

Citation:. Haugen MH, Johansen HT, Pettersen SJ, Solberg R, Brix K, Flatmark K, et al. (2013) Legumain Atividade Nuclear no câncer colorretal. PLoS ONE 8 (1): e52980. doi: 10.1371 /journal.pone.0052980

editor: Matthew Bogyo, Universidade de Stanford, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de junho de 2012; Aceito: 22 de novembro de 2012; Publicação: 10 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Haugen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi generosamente apoiado por bolsas de autoridades do Sudeste regionais de saúde [HSO, # 2011142], www.helse-sorost.no; O Conselho de Investigação da Noruega no âmbito do Programa de Genômica Funcional [FUGE, # 158954 /S10], www.forskningsradet.no/fuge; Søren e Jeanette Bothners legado eo Cancer Society Norueguês [# PR-2006-0272], www.kreftforeningen.no; A Universidade de Oslo; Fundação Anders Jahres para a Promoção da Ciência; Astrid e Birger Torsteds Foundation; e da Fundação Nansen. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Legumain ou AEP (asparaginil endopeptidase), pertence à família C13 cisteína protease no CD do clã de acordo com o banco de dados MEROPS Peptidase [1]. Ele foi descoberto pela primeira vez em feijão [2] e solha no sangue (

Schistosoma mansoni

) [3] antes de Chen e colegas de trabalho descrito a versão mamífera em 1997 [4]. A protease de mamífero é homóloga claramente com legumain de espécies não mamíferas e a conservação ao longo da linhagem evolutiva, presumivelmente, indica importância funcional. A pró-enzima humano de 433 aminoácidos sofre várias divisões sucessivas ambos N e C-terminalmente, algumas das quais requerem pH ácido, antes de atingir a forma activa da enzima madura. O processo de maturação é parcialmente auto-catalítico, mas depende também de outras enzimas proteolíticas, que, juntamente com a compreensão completa do processo de activação, não foram totalmente caracterizados [5] – [7]. A protease activa mostra preferência altamente específica para a hidrólise de substrato C-terminalmente a asparagina e, em certa medida, após o ácido aspártico sob condições mais ácidas. Os inibidores endógenos mais potentes são legumain de cistatina E /M e a cistatina C [8], [9], enquanto que o inibidor químico clássico de proteases de cisteína, o composto E64, não afecta a actividade legumain [4].

Existem vários relatórios de legumain sendo sobre-expresso num certo número de tumores sólidos (por exemplo, cancros da mama e colo-rectal), e esta foi também correlacionada com um fenótipo mais invasivo e metastático [10] – [12]. Recentemente, nós analisamos um painel de linhas celulares de melanoma e descobriu que legumain foi expressa e activa na maioria das linhas celulares investigadas [13]. Em tecidos normais, legumain é mais proeminentemente expresso na placenta, rim e baço [10]. Legumain knock-out ratinhos nasceram saudáveis ​​e férteis, mas exibir reduziu o peso corporal, endo-lisossomos aberrantes com o desenvolvimento de insuficiência renal e hematopoiese extramedular no baço [14] – [16].

Recentemente, tem sido mostrado que legumain podem estar envolvidos na proliferação celular independente da actividade de endopeptidase [17]. Além disso, foi demonstrado legumain para activar proMPM-2, o que pode explicar em parte a associação observada entre a expressão de potencial metastático legumain e [18]. A especificidade de substrato estrita combinado com a sobre-expressão em diferentes tipos de tumores tem motivado a exploração de legumain como um activador do pró-fármaco no tratamento do cancro, por exemplo, por adição de uma cadeia clivável péptido à doxorrubicina ou auristatina [10], [19] e a segmentação de compostos fármaco utilizando um inibidor da enzima legumain [20]. Outras funções biológicas conhecidas de legumain incluem processamento autofágica-lisossômico de proteínas hepatocelular [21], o processamento de antígenos para MHC apresentação de classe II [22], e maturação no receptor Toll-like sinalização [23].

Neste estudo, expressão legumain e atividade proteolítica foram examinados em duas linhas de células de carcinoma colorectal (CRC), HCT116 e SW620. diferenças notáveis ​​em atividade foram inicialmente identificados e usamos ainda mais estas linhas celulares para examinar a distribuição legumain e da atividade em níveis subcelulares. De grande interesse e um tanto inesperada, proteolítica nuclear legumain activo foi revelado em ambas as linhas celulares, para além da localização endo-lisossomal esperado. Estes resultados foram ainda mais reconhecido por imunofluorescência, imunohistoquímica e

In situ

medições de atividade em células cultivadas e xenotransplantes, e também documentada no tecido tumoral CRC humano. Finalmente, legumain foi mostrado para clivar proteoliticamente histona H3.1

in vitro

revelando um potencial implicação funcional da atividade legumain localizada nuclear.

Materiais e Métodos

As linhas celulares, xenotransplantes e biópsias CRC

RKO, CO205, SW48, Colo320DM, HT29, SW620 e HCT116 foram comprados da American Type Culture Collection (ATCC). KM20L2 e HCC2998 (DCTD Tumor /Repositório Linha celular) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Michael R. Boyd (National Câncer Institute, Frederick, MD, EUA), bem como a LS174T [24] e [25] TC7 linhas celulares a partir de Dr. Richard Hamelin (INSERM, Paris, França). identidade da linha celular foi validado pela análise curta repetição em tandem para a HCT116 e linhas de células SW620. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (BioWhittaker) contendo soro fetal bovino a 10% (Hyclone), HEPES 20 mM (BioWittaker) e 2 mM de GlutaMax (Invitrogen). Todas as linhas celulares foram rotineiramente testados negativo para

Mycoplasma

. xenoenxertos subcutâneos de HCT116 e SW620 foram estabelecidos por injecção de 1 * 10

6 células em ambos os flancos de fêmea produzido localmente /c nus ratinhos BALB (nu /nu) [26]. Habitação e todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso da Universidade de Oslo Hospital Animal, em conformidade com as orientações das autoridades de Investigação norueguês animal no bem-estar animal. biópsias humanas foram obtidas de pacientes durante a cirurgia primária de CRC assumido ou verificado. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Regional do Sul da Noruega (# S-98080) e consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes.

Os lisados ​​celulares, condicionados a colheita de mídia e enriquecimento subcelular

Para obter lisados ​​celulares por imunotransferência, culturas sub-confluentes foram descoladas utilizando EDTA (BioWittaker) e lavou-se 3 vezes em PBS arrefecido em gelo (BioWittaker) antes de tampão de lise frio (150 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% de NP-40 ) com a mistura de inibidor de protease CompleteMini (Roche Diagnostics) foi adicionada para secar os sedimentos celulares e deixadas em gelo durante 15 min. Finalmente, as amostras foram sonicadas e centrifugadas a 15000 × g durante 15 min para remover os detritos celulares. Em amostras para as medições da actividade de um tampão de lise (100 mM de citrato de sódio, 1 mM de EDTA dissódico, 1% de n-octil-beta-D-glucopiranósido, pH 5,8) foi utilizado sem inibidores de protease. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando o kit BCA (ácido bicinconínico) ensaio de proteína (Pierce) ou ensaio de Bradford [27]. Todas as amostras foram armazenadas a -80 ° C. meio condicionado de células foi obtida por inoculação de 7,5 * 10

5 as células em placas de 6 poços e cultivadas durante a noite em meio contendo soro, em seguida, lavadas e cultivadas durante mais 24 horas em 1 ml de meio isento de soro. O meio condicionado isento de soro foi centrifugada a 15000 × g durante 5 min e o sobrenadante recolhido. As proteínas de meio condicionado foram concentradas por adição de 4 volumes de acetona arrefecida em gelo, deixando as amostras em gelo durante 15 minutos e centrifugação a 4 ° C e 12000 x g durante 10 min. Líquido foi removido e o precipitado ar seco à temperatura ambiente antes de re-dissolução em tampões para immunoblotting ou actividade medições, de acordo com protocolos subsequentes. enriquecimento subcelular dos lisossomas e dos núcleos foi feita por centrifugação com gradiente de densidade de acordo com Brix

et ai.

[28] com separação das fracções repetido duas vezes para garantir uma elevada pureza. tampões de lise foram ajustadas a pH 5,0 e 7,4 para lisossomal e fracções nucleares, respectivamente. Tudo outro enriquecimento subcelular foi realizada em triplicado usando o Kit de fracionamento de proteínas subcelular em células cultivadas (Thermo Scientific) em 5 * 10

6 células HCT116 e 10 * 10

6 SW620 células para obter volumes iguais de pelotas celulares como partida material de acordo com o protocolo dos fabricantes, e com a adição de lavagem do sedimento entre todas as frações para garantir alta pureza.

Immunoblotting e ELISA

as amostras foram corridas em géis NuPAGE 4-12% ( Invitrogen) a 150 V e temperatura ambiente usando o MES-buffer fornecido (contendo SDS), de acordo com o protocolo dos fabricantes, e depois transferidas para 0,45 fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore Corp.) na fechadura Sure-célula X ( Invitrogen) a 4 ° C durante uma hora em metanol a 20% contendo tampão de Tris-Glicina. Qualidade de transferência de proteína foi verificada utilizando Amidoblack para géis 1D. As membranas foram subsequentemente bloqueadas durante uma hora à temperatura ambiente em 5% de leite seco TBST-tampão (Tris-tamponada salina com Tween 20) e sondadas com o anticorpo primário em 5% de leite seco TBST-tampão, durante uma hora à temperatura ambiente no seguinte concentrações: anticorpo policlonal de cabra legumain (pAB) (1:1000; I D Systems; AF2199), catepsina pAb L cabra (1:500; I D Systems; AF952), catepsina pAb B de coelho (1:10000; Calbiochem; 219408), cistatina e /M pAb de cabra (1:500; R D Systems; AF1286), anticorpo monoclonal de ratinho α-tubulina (Acm) (1:5000; Calbiochem; CP06), arilsulfatase B (ARSB) mAb de ratinho (1 (-2 lâmpada) mAb rato MAB4415), proteína de membrana associada à lisossômico (1:250, Santa Cruz, sc-18822), proteína especificidade 1 (SP1) rabbit pAb (1:10000, Millipore; :500, R D Systems , 07-645), e o mAb de coelho histona H3 (1:10000, Millipore, 05-928). Em seguida, as membranas foram lavadas 3 vezes em tampão de leite seco sem, sondado com anticorpo de HRP secundário (peroxidase de rábano) (1:5000; DakoCytomatation) específico contra as espécies correspondente, durante uma hora à temperatura ambiente, e subsequentemente lavada 3 vezes. Desenvolvimento foi realizada utilizando SuperSignal Oeste Dura substrato ampliado Duração (Pierce) de acordo com as instruções dos fabricantes, visualizadas em filmes de raios-X médicos (Kodak ou Thermo Scientific) e convertido para TIFF usando um scanner de filme de mesa (Canon). Para análise densitométrica do filme foi digitalizado num densitómetro calibrado GS-800 (Bio-Rad) e quantificado por QuantityOne v.4.6.5 (Bio-Rad). Todas as quantidades medidas foram normalizadas usando o controle de carga correspondente (α-tubulina). medições de ELISA de legumain total de humano (R D Systems, DY4769) a partir de três isolamentos de proteínas separadas foram realizadas em duplicado de acordo com as recomendações dos fabricantes

Mutation analisa

ADN do HCT116 linhas celulares. e SW620 foi isolado utilizando o Kit de DNA QIAamp sangue Mini (Qiagen).

LGMN

(ENSG00000100600) exão 12 (ENSE00000808693) foi subsequentemente gerado por PCR usando a frente específica (5′-agaggctggacttggggtat-3 ‘) e reverso (5′-gcttccgttacatggaggac-iniciadores 3’). As reacções de sequenciação foram realizadas utilizando os mesmos iniciadores e o Kit de Sequenciação do Ciclo de Dyenamic ET Dye Terminator (Amersham) como descrito pelo fornecedor. As amostras foram finalmente submetidas a deixar-se limpo, separado por electroforese capilar e analisados ​​utilizando um instrumento MegaBACE1000 sequenciação (Amersham).

Legumain actividade, imuno-histoquímica e imunofluorescência

Legumain actividade nos lisados ​​celulares e subcelulares fracções foi medida em triplicado por clivagem do substrato Z-Ala-Ala-Asn-NHMec (Departamento de Bioquímica, Universidade de Cambridge, Reino Unido), como descrito anteriormente [4], [29]. Em breve, o lisado celular (20 ul) foi adicionado ao negro de microplacas de 96 poços (N ° 3915; Costar, Corning). Após a adição de 100 ul de tampão e 50 solução ul de substrato (concentração final 10 uM) em qualquer pH 5,8 ou 7,4, uma medição de cinética com base no aumento da fluorescência ao longo de 10 minutos foi realizada a 30 ° C num leitor de placas (Wallac Victor 3 , Perkin Elmer) e apresentados como unidades de enzima em que uma unidade de actividade foi definida como a quantidade de enzima libertando 1,0 umol de produto /min sob as condições padrão descritas. A imunofluorescência foi realizada em células crescidas em lâminas de vidro esterilizados em placas de 6 poços posteriormente fixados em 4% de PFA e permeabilizadas com 0,2% de Triton-X100 antes da coloração com o anticorpo primário legumain (1:100) e um anticorpo secundário conjugado com Alexa488 (Invitrogen, 1:200, a-11034) em tampão contendo 0,1% de BSA. As lâminas de controlo foram preparadas sem a adição do anticorpo primário. Os núcleos foram coradas com DRAQ5 ™ (Biostatus) e lamelas montadas em Mowiol em Tris-HCl a 200, pH 8,5 (Hoechst) antes da observação em LSM510 a laser de varredura confocal ou sistema de imagem LSM710 (Carl Zeiss). aritmética de imagem foram realizados de acordo com Jedeszko

et al.

[30] usando o Image J [31]. A análise dos legumain localizada nuclear foi realizada em 5 z-stacks cada uma composta por 25-35 seções e cada uma contendo 30-40 células capturadas sem pixels saturadas.

In situ atividade

de legumain em células e secções de tecidos a partir de xenoenxertos foi medida por clivagem do substrato Suc-Ala-Ala-Asn-NHNapOME (Departamento de Bioquímica, Universidade de Cambridge, Reino Unido), como descrito anteriormente e verificou em tecidos de ratinhos legumain knock-out [32], [33] utilizando concentrações finais de 5 mM-nitro-salicilaldeído 1, substrato 0,5 mm e fornecidos com DAPI (Invitrogen) para visualizar os núcleos. Células montados em OCT Composto (Tissue-Tek) e xenoenxertos foram cortadas em secções de criostato (6 um) e incubadas com solução de ensaio 50 uL durante 10-15 min a 37 ° C antes de observação por meio de laser de varrimento LSM710 sistema de imagem confocal ou LSM510, respectivamente, e utilizando o módulo de co-localização do software Zen 2009 para pseudo-coloração (branco). As lâminas de controlo foram preparados usando tampão sem substrato, o inibidor de epoxi E64 (Sigma) a uma concentração final de 1 uM ou humana cistatina recombinante E /M (R D Systems, 1286-PI) a uma concentração final de 0,1 uM. coloração imuno-histoquímica foi realizada em secções de tecidos, embebidos em parafina e fixados em formalina a partir de xenoenxertos crescido subcutaneamente e biópsias CRC humanos, utilizando o anticorpo legumain em 1:300 diluição com o método de biotina-estreptavidina-peroxidase, tal como descrito anteriormente [34]. -Cabra IgG colorações controlo de isotipo foram realizadas a uma concentração similar em secções de tecido de tumor de xenoenxerto e CRC

A clivagem proteolítica da histona H3.1

legumain recombinante humano (R . D systems, 2199-CY ) foi auto-activado a 37 ° C durante 2 h em tampão ácido (NaOAc 50 mM, NaCl 100 mM, pH 4,0) a uma concentração de 0,1 ug /ul. legumain bovino foi isolado a partir de rim, como descrito por Yamane

et ai.

[35]. Humana histona H3.1 recombinante (New England Biolabs, M2503S) foi adicionado ao tampão de ensaio 50 uL (MES 50 mM, NaCl 250 mM, pH 5,0 ou pH 7,0) com ou sem cistatina E /M e com adição final de qualquer das humana activa ou legumain bovina. Cada mistura foi incubada a 37 ° C por 2 h com agitação.

Resultados

Legumain e catepsina L estão heterogênea expressa em linhas celulares de CRC

Os lisados ​​de um painel de CRC As linhas celulares foram sujeitas a separação por PAGE e transferidas para membranas de PVDF. Por sucessivos sondagem com anticorpos policlonais, o montante total e várias formas maduras de legumain (painel superior, Fig. 1 e Fig. S2A) e catepsina L (painel do meio, Fig. 1 e painel inferior, Fig. S2A) foram visualizados. Legumain pareciam estar presentes em duas formas massa molecular de aproximadamente 56 kDa e 36 kDa (setas). As linhas celulares de CRC exibida uma ampla gama no valor total de legumain, e também em quantidades relativas de pró-forma putativa de 56 kDa e a forma madura activa de 36 kDa, que ambos eram sensíveis a infra-regulação por um específico legumain siRNA (Fig. S1). Recombinante pró-legumain humana (rhLeg, 5 ng) foi utilizado como controlo. Catepsina L estava presente na maioria das linhas celulares, embora os níveis mais elevados foram observados em RKO, TC7 e HCT116. Nos dois últimos, que abrigam quantidades elevadas de legumain madura, a banda mais dominante catepsina L correspondeu à 25 kDa da cadeia pesada da forma activa de duas cadeias (seta). Em contraste, a linha de células RKO mostrou alta expressão simultânea de inactiva (30 kDa, de cadeia simples) a catepsina G e um menor nível de legumain activa, o que sugere que estas proteases de cisteína são submetidas à activação mútua em linhas celulares de cancro colorrectal.

imunoblots de lisados ​​celulares a partir de um painel de linhas celulares de CRC demonstraram elevada variabilidade na quantidade total de legumain e catepsina G, e também na presença dos diferentes formas maduras. células HCT116 e SW620 foram particularmente interessantes, pois mostram montante mutuamente exclusivos de alta do ativo (36 kDa) e forma-pro inactiva (56 kDa) da legumain, respectivamente. imunotransfer�cias Uncut (Fig. S2A).

A atividade legumain divergentes linhas de células HCT116 e mostrar SW620

células HCT116 predominantemente exibido o maduro 36 kDa forma de legumain, enquanto SW620 também mostrou substancial quantidades de pro-forma 56 kDa (Fig 1 e TL;. a Fig. 2B) [6]. Os lisados ​​a partir destas duas linhas de células foram ainda analisados ​​pela sua capacidade de clivar um substrato específico legumain. Estas medições da actividade revelaram uma correspondência constante entre a intensidade observada a banda de 36 kDa e a actividade legumain em lisados ​​totais (TL; Fig. 3B). Além disso, as células HCT116 e SW620 tratadas com um siRNA específico para legumain demonstrado uma diminuição de 70-90% na actividade legumain (dados não mostrados). Tendo em evidência estabelecida para as diferenças na quantidade de legumain activo em HCT116 e SW620 era de grande interesse para determinar se esta podia ser atribuído a mutações em Asn323 localizados no exão 12, que foi reivindicado necessária para a clivagem do pró-enzima na activa forma [5], [6], [36]. No entanto, a sequenciação revelou ausência de mutação em

LGMN

sequência nucleotídica correspondente ao local de reconhecimento de clivagem nestas linhas de células (dados não mostrados), e assim, não pode explicar as diferenças observadas na actividade de protease. Além disso, cistatina E /M foi mostrado como o inibidor endógeno mais potente de legumain e expressão de proteína, portanto, esta foi investigada. Interessantemente, os níveis celulares e secretados de cistatina E /M foram encontrados para ser bastante diferente entre as duas linhas celulares. Em HCT116, duas formas (14 e 17 kDa) de cistatina E /M foram encontrados no meio condicionado (CM; Fig. 2B), com uma quantidade mais modesto e, principalmente, a forma de 14 kDa no lisado celular total (TL). Em contraste, SW620 expressou nenhuma quantidade detectável de cistatina E /M nem segregada nem intracelular.

(A) imuno de legumain em lisossômico (L) e frações nucleares (N) enriquecidos a partir de células HCT116 e SW620 usando gradiente de densidade centrifugação. Todas as pistas foram carregadas com 15 ug de proteína total de cada fracção. controlos da pureza das fracções subcelulares foram avaliados por coloração para ARSB (proteína lisossómica solúvel) e SP1 (factor de transcrição nuclear). (B) As imunotransferências de legumain (painéis superiores), E cistatina /M (segundo painéis) e catepsina L (terceiro painéis) em compartimentos sub-celulares enriquecidas isoladas a partir de células HCT116 e SW620, utilizando um kit comercial: citosol (C), membranas /lisossomas ( M /L), solúvel nuclear (NS), cromatina nuclear ligado (NC), lisado total (TL) e meios condicionados (CM). Todas as pistas foram carregadas com 15 ug de proteína total de cada fracção, excepto meios condicionados onde as proteínas precipitadas a partir de 1 ml foi carregado. controlos da pureza das diferentes fracções subcelulares foram avaliados por coloração para α-tubulina (proteína citosólica), ARSB (proteína lisossómica solúvel), lamp-2 (proteína associada à membrana de lisossomas), SP1 (factor de transcrição nuclear) e histona H3 (cromatina nuclear proteína ligada). imunotransfer�cias Uncut de legumain e catepsina L (Fig. S2C).

(A) A actividade proteolítica de legumain determinada por clivagem do substrato (Z-Ala-Ala-Asn-NHMec) em relação ao teor de proteína total de cada compartimento subcelular de HCT116 (barras pontilhadas) e as células SW620 (barras xadrez) após a centrifugação de gradiente de densidade. Lisossomal e fracções nucleares foram preparados e analisados ​​a pH 5,8 e 7,4, respectivamente, o que demonstra a actividade proteolítica de legumain em ambos lisossomal e fracções nucleares de ambas as linhas celulares em ambas as condições de pH, embora mais elevada no compartimento lisossómico ensaiada a pH 5,8. (B) A actividade proteolítica de legumain medida a pH 5,8, em fracções subcelulares preparados por um kit comercial verificou-se ser maior nas fracções de H /L, mas também estava claramente presente nas fracções NS e observada apenas com actividade menor nas fracções C de ambas as linhas celulares. legumain extracelular não demonstrou qualquer actividade em qualquer linha de células (dados não apresentados). (C) Total de legumain montantes (pró e forma activa) medidos por ELISA em fracções subcelulares (isolado utilizando um kit comercial) e calculadas em relação ao teor de proteína total em cada fracção foram também mais elevada nas fracções M /L, ainda claramente presente na fração NS.

legumain ativo está localizada no endo-lisossômico e compartimentos nucleares

legumain é geralmente considerada uma proteína alvo de e residente em endo-lisossomos, e tem também foi relatado para executar funções celulares importantes no interior deste compartimento especializado [22], enquanto que a sua distribuição e características em outros compartimentos subcelulares não tem sido elucidado. Para investigar ainda mais este foram utilizados dois métodos para isolar e enriquecer as proteínas a partir de compartimentos subcelulares, um ser baseada na centrifugação em gradiente de densidade de sacarose em tampão e sendo o outro um kit de isolamento de subcelular disponíveis comercialmente. Para examinar a distribuição de legumain, imunotransferência foi realizada em 15? G de lisado total de proteínas de cada fracção subcelular enriquecido, para além de lisado total de células e meio de crescimento condicionado correspondentes (Fig. 2). Isto também permitiu para controlo de pureza das fracções usando várias proteínas de distribuição limitada presumida, mostrando alta enriquecimento de cada compartimento e com quase nenhuma contaminação cruzada detectável (Fig. 2, os marcadores específicos do compartimento apresentado abaixo linhas pretas). Em ambos os métodos de enriquecimento subcelulares a 36 kDa legumain activo estava presente em quantidades substanciais no lisossomal (L) e as fracções de membrana /lisossomal (H /L), bem como no nuclear (N) e fracções nucleares solúveis (NS) em ambos ambas as linhas celulares. Percebeu-se novamente que HCT116 geral em comparação com células SW620 continha um nível mais baixo do pró-forma 56 kDa em todas as fracções subcelulares, confirmando as observações feitas a partir de lisados ​​de células totais (Fig. 1 e 2), enquanto que o prolegumain 56 kDa foi também observada nas fracções nucleares em ambas as linhas celulares. As células HCT-116 também exibiram quantidades mais pequenas de 36 kDa legumain na citosólica (C) e ligada cromatina nuclear (CN) fracções (Fig. 2B e Fig. S2C, deixadas painéis do meio). O pro-forma 56 kDa de legumain foi encontrado para ser secretado e detectada em meio condicionado (CM; A Fig. 2B), mas somente a partir de HCT116. De interesse particular foi a presença clara de 36 kDa legumain activa nas fracções nucleares a partir de ambas as linhas celulares, para além da presença prevista nas fracções lisossomais. Além disso, o enriquecimento subcelular foi efectuada utilizando um kit de isolamento segundo subcelular disponível comercialmente (Qiagen), o que demonstra também a localização nuclear de 36 kDa madura legumain (Fig. S2B). No que diz respeito a expresso endogenamente cistatina inibidor de E /M, apenas quantidades vestigiais da forma de 14 kDa foi observada em ambos o H /L e NS fracção de HCT116. Finalmente, a distribuição subcelular de catepsina G também foi avaliada e esta protease foi encontrado ser muito menos proeminente em SW620 em comparação com células HCT-116 (Fig. 2B e Fig. S2C, painéis inferiores), como também foi evidente em lisados ​​de células totais (Fig. 1 e 2B). Em HCT116 o presumível de 25 kDa forma de duas cadeias activa da catepsina L [37] era claramente presentes no H /L e fracções NS, bem como em TL e CM, mas também em certa medida nas fracções C e NC. Embora esteja presente sob a forma activa na CM, esta fracção também mostrou a forma pró-de catepsina L vista por uma forte banda de aproximadamente 38 kDa. A forma de cadeia simples da catepsina L de 30 kDa estava presente principalmente nos M /L e NS fracções de ambas as linhas celulares. Em SW620, foram observadas bandas mais fracas de catepsina G apenas no H /L e fracções NS, bem como em TL, e também com uma fraca presença da forma-Pro em CM.

As várias fracções subcelulares de células HCT116 e SW620 foram subsequentemente analisadas quanto à sua capacidade para clivar proteoliticamente um substrato peptídico específico legumain em relação à quantidade total de proteínas presentes em cada fracção medido. Em lisossomal e fracções nucleares separados por gradientes de densidade de sacarose, a actividade foi medida, tanto a pH 5,8 e 7,4, respectivamente, para imitar as condições fisiológicas (Fig. 3a). Em conjunto com os estudos anteriores, as fracções lisossomais demonstraram elevada actividade proteolítica legumain, mas mais imprevistas as fracções nucleares de ambas as linhas de células de medida a pH neutro também mostrou actividade legumain considerável. Nas fracções subcelulares isoladas utilizando o kit comercial, a actividade proteolítica da legumain medida a pH 5,8 foi também mais alta do H /L (Fig. 3B) fracção, no entanto, em correspondência com os resultados anteriores, a actividade legumain substancial foi encontrada nas fracções nucleares de ambas as linhas celulares, em particular as fracções solúveis (NS). Além disso, a expressão legumain nas fracções subcelulares obtidos usando o kit comercial foi avaliado usando ELISA sanduíche capaz de detectar legumain total (isto é, ambas as formas pró e activas) (Fig. 3C). Em todas as fracções foram observadas quantidades detectáveis ​​de legumain (em relação ao teor de proteína total em cada fracção), enquanto que os níveis mais elevados foram observados no H /L e fracções NS, como também se verificou nas imunomarcações (Fig. 2B). Um resultado inesperado foi a quantidade e actividade das legumain nas fracções subcelulares de 10 * 10

6 SW620 células que foram medidos como sendo de aproximadamente duas vezes tão elevado como nas fracções efectuadas a partir de 5 * 10

6 células HCT116, embora todos pistas foram carregadas com 15 ug de proteína. No entanto, em lisatos totais de toda a quantidade de legumain (e pró-forma madura) era quase igual, ainda células HCT116 tiveram maior actividade legumain global nos lisados ​​celulares totais o que corresponde ao valor observado de legumain activa nas imunomarcações (Fig. 2B).

In situ distribuição

de expressão legumain

Para examinar expressão legumain

in situ

, as células HCT116 e SW620 foram cultivadas em lâminas de vidro, imunofluorescência corados e visualizada utilizando microscopia confocal (Fig. 4A-4D e a Fig. S3A-S3B). Legumain distribuiu-se principalmente na região perinuclear, possivelmente sugerindo uma localização majoritariamente para o

trans

rede -Golgi (TGN) e endo-lisossomas, e mais claramente visível nas células HCT116 (Fig. 4A), ao passo que na células SW620 legumain contendo vesículas apareceu mais distribuída (Fig. 4C). Ambos HCT116 e SW620 também exibida legumain localizados nos núcleos das células. Ao visualizar apenas o legumain localizada nuclear nos três planos ortogonais das células, legumain foi observada para distribuir em torno de estruturas esféricas, possivelmente, nucléolos, no interior dos núcleos (Fig. 4B e 4D). Usando aritmética imagem em fatias ópticos de cinco z pilhas independentes, cada uma contendo 30-40 células marcadas imunofluorescência, a percentagem média de legumain intracelular localizada no núcleo de uma célula foi estimado em 12,8% em HCT116 e 16,5%, em SW620 (Fig. 5). Análise adicional das duas linhas de células cultivadas como xenoenxertos subcutâneos em ratinhos revelaram resultados comparáveis ​​para imunofluorescência quando imuno-histoquimicamente coradas para legumain (Fig. 4E e 4F, e a Fig. S3C-S3F), com HCT116 mostrando intensa coloração granulada enquanto que SW620 demonstrou um tanto padrão de coloração mais difusa. Além disso, em xenoenxertos de ambas as linhas celulares exibiram legumain expressão heterogénea, com áreas intensamente coradas, eventualmente, o tecido necrótico. A localização nuclear foi mais visível em células com elevada expressão legumain geral, mas manchas de coloração legumain também foram detectados no interior núcleos nas células coradas mais fracos (setas amarelas). A análise imunohistoquímica do tecido do tumor embebidas em parafina a partir de pacientes de CRC, também revelou expressão heterogénea de legumain que foi evidente tanto nas células tumorais e as células do estroma que rodeiam (Fig. 4G e a Fig. S3G).