Abstract

Para explorar os padrões de expressão genética no cancro gástrico, um total de 26 emparelhado cancerosas e não cancerosas tecidos gástricos de pacientes foram inscritos para análises de expressão gênica por microarrays. limma métodos foram aplicados para analisar os dados, e os genes foram considerados significativamente expresso diferencialmente se a Falso Descoberta Classificação (FDR) valor era 0,01,

P

-valor era 0,01 e a mudança vezes (FC) foi 2. Posteriormente, Gene Ontology (GO) categorias foram utilizadas para analisar as principais funções dos genes diferencialmente expressos. De acordo com a Enciclopédia Kyoto de Genes e banco de dados Genomas (KEGG), encontramos caminhos significativamente associados com os genes diferenciais. Gene-Acto de rede da rede e co-expressão foram construídos respectivamente com base nas relações entre os genes, proteínas e compostos na base de dados. 2371 mRNAs e 350 lncRNAs considerados genes como significativamente diferencialmente expressos foram selecionados para a análise posterior. O GO categorias, via de análises e a rede Gene-Act mostrou um resultado consistente que up-regulamentado genes foram responsáveis ​​por tumorigênese, migração, angiogénese e formação de microambiente, enquanto os genes-down regulamentada estavam envolvidos no metabolismo. Estes resultados deste estudo fornecem algumas novas descobertas sobre codificação RNAs, lncRNAs, vias e da rede co-expressão no câncer gástrico que será útil para orientar uma investigação mais aprofundada e alvo terapia para esta doença

Citation:. Li H , Yu B, Li J, Su G, Yan M, Zhang J, et al. (2015) Caracterização de genes diferencialmente expressos envolvidos nas vias Associated com câncer gástrico. PLoS ONE 10 (4): e0125013. doi: 10.1371 /journal.pone.0125013

Editor do Academic: Francisco J. Esteban, Universidade de Jaen, Espanha

Recebido: 09 de novembro de 2014; Aceito: 06 de março de 2015; Publicação: 30 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Todos os arquivos de microarray estão disponíveis a partir da expressão do gene NCBI Omnibus (GEO) do banco de dados (número de acesso “GSE65801”; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801).

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por subsídios para a análise da National Natural Science Foundation da China [No. 81172324, 91229106 No., No. 81272749, e No. 81372231], Ciência e Tecnologia da Comissão, de Xangai Município [No. 13ZR1425600] e projectos chave na Science Programa de Tecnologia Coluna de China (No. 2014BAI09B03). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) é um dos cânceres mais comuns em todo o mundo, e sua incidência é particularmente elevada no Leste da Ásia, especialmente na China. Cerca de 952 mil novos casos de câncer de estômago foram diagnosticados em todo o mundo em 2012, e metade delas ocorreu no Leste da Ásia (principalmente na China) [1]. Na China, a maioria dos pacientes com GC são diagnosticados numa fase tardia com mau prognóstico. Portanto, elucidar os mecanismos moleculares subjacentes a progressão GC é essencial para a identificação de biomarcadores-chave e desenvolver terapias específicas eficazes.

Durante a última década, microarrays de expressão de genes tornaram-se uma ferramenta comum para examinar os níveis de transcrição de genes na pesquisa do câncer. dados de microarray é utilizado para uma grande variedade de análises, como agrupamento sem supervisão, classificação, a análise da expressão diferencial, e mapeamento de loci de características quantitativas [2] expressão. Ela não só ajuda a identificar genes disfuncionais chave no cancro, mas fornece informações de todo o genoma na expressão do gene de uma só vez, bem [3,4]. Neste estudo, foi realizada uma pesquisa de todo o genoma da expressão de lncRNAs e mRNAs de amostras pareadas de tecidos de câncer gástrico primários e tecidos não cancerosos, para perfilar os lncRNAs diferencialmente expressos e RNAs de codificação. O estudo destes dados irá fornecer informações valiosas sobre o mecanismo de carcinogênese e permitir a descoberta de genes-chave que podem actuar como futuros alvos da terapia anti-câncer.

Métodos e Materiais

Declaração ética

O consentimento informado foi obtido de todos os participantes. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa em Seres Humanos Ética de Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University, School of Medicine.

As amostras de tecido

Os tecidos foram retiradas de carcinomas gástricos primários de pacientes não tratados que foram submetidos D2 gastrectomia radical em Xangai Ruijin Hospital. Para cada tecido de cancro, uma amostra de tecido não canceroso emparelhado foi recolhido a partir da região adjacente ao mesmo tempo. O tamanho de cada amostra foi de cerca de 0,1 centímetros

3. Todas as amostras foram colocadas em RNAlater no prazo de 15 minutos após a excisão e armazenado em azoto líquido até à extracção do ARN. Neste estudo, 32 tecidos emparelhados foram recolhidos para o microarray e 26 amostras pareadas foram inscritos para a análise da próxima etapa da GO, via e rede após o controle de qualidade usando a análise 3D principal componente (3D-PCA) e análise de cluster.

microarrays experimentos

Agilent SurePrint G3 Humano GE 8x60K Microarray (projeto ID: 028004) foi empregado neste estudo. O RNA total foi isolado e amplificado utilizando uma baixa entrada do amplificador rápida Labeling Kit, de uma cor (Cat # 5190-2305, tecnologias de Agilent, EUA). Em seguida, os ARNc marcadas foram purificadas por um RNeasy Mini Kit (Cat # 74106, Qiagen, Alemanha).

com base nas instruções do fabricante, cada lâmina foi hibridado com 600 ng de cRNA etiquetado com Cy3 utilizando um kit Gene Expression hibridação (Cat # 5188-5242, tecnologias de Agilent, EUA) e banhada pelo Gene Expression tampão de lavagem Kit (Cat # 5188-5327, tecnologias de Agilent, EUA).

Um Agilent Microarray Scanner (Cat # G2565CA, Agilent tecnologias, EUA) e dispõem de software de extração de 10,7 (tecnologias de Agilent, EUA) foram aplicados para digitalizar cada slide com as mesmas configurações mostradas como segue, canal Dye: verde, resolução de digitalização = 3 �m, 20bit. Os dados brutos foram normalizados pelo algoritmo Quantile, Gene Primavera Software 11.0 (tecnologias de Agilent, EUA) (detalhadas no S5 Tabela).

Limma

modelos lineares e métodos de Bayes empíricos foram aplicados para analisar os dados deste estudo. Os resultantes

P

-Valores foram ajustados usando o algoritmo BH FDR. Havia três padrões para nós considerarmos que um gene foi significativamente diferencialmente expressos, o valor FDR era 0,01,

P

-valor era 0,01 e a mudança vezes era 2. (Detalhado no S5 Table)

GO categoria

Realizamos Gene Ontology (GO) analisa a analisar as funções dos genes diferencialmente expressos em nossa microarray de acordo com a classificação funcional fundamental do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI). Geralmente, o teste exato de Fisher e

χ

2 de teste foram aplicados para classificar a categoria GO, e a taxa de descoberta de falsas (FDR), foi calculado para corrigir o

P

-valor (

N

k

refere-se ao número de teste de Fisher

P

-Valores menos do que o

χ

2 test

P

-Valores). O Re enriquecimento foi dada por: Re = (

n

f

/

n

) /(

N

f

/

N

) nas categorias significativas (

N

f

é o número de genes diferenciais dentro da categoria particular,

n

é o número total de genes dentro da mesma categoria,

n

f

é o número de genes diferenciais em todo o microarray, e

N

é o número total de genes no microarray) (detalhado na Tabela S5)

analisa Caminho

anotações Pathway dos genes diferenciais exressed foram obtidos a partir de KEGG (http: //www .genome.jp /KEGG /). Categorias da via com um FDR 0,01 foram marcadas. O enriquecimento de vias significativas foi dada por: enriquecimento = /, que nos ajudou a localizar as vias mais significativas em nosso estudo (

n

g

é o número de genes diferenciais dentro do determinado modo,

n

a

é o número total de genes dentro do mesmo caminho,

N

g

é o número de genes diferenciais, que têm, pelo menos, uma via de anotação, e

N

um

é o número de genes que têm, pelo menos, uma via de anotação em todo o microarray.) (detalhados na Tabela S5).

rede gene-Lei

de acordo com a base de dados KEGG, um gene pode estar envolvida em várias vias ou interagir com vários outros genes. Todas as interações gene-gene foram reunidos para construir a rede Gene-Lei com base nos percursos diferenciais, o que nos ajudou a revelar as vias de sinalização e genes reguladores chave no GC.

Co-expressão de rede

Gene de co-expressão de rede foi construída de acordo com a intensidade do sinal normalizado de genes de expressão específicos. Grau central é definida como o número de ligações de um nó tenha a outra, o que determina a importância relativa de genes. Além do mais, k-núcleos foram aplicados como um método de simplificar analisa a topologia de gráfico. factores reguladores centrais (genes) que têm os maiores graus ligar mais genes adjacentes e construir a estrutura da rede (detalhado na Tabela S5).

-PCR quantitativo em tempo real

O ARN total foi extraído a partir de tecidos, utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O tempo real de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (PCR) foi realizada através da utilização de PCR Master Mix-SYBR verde num Fast-PCR em tempo real do sistema 7500 (Applied Biosystems). Os iniciadores dos 10 genes foram apresentados na Tabela S4. As reacções de PCR foram realizadas a 50 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. ΔCt foi calculado subtraindo o Ct de ARN β-actina (controlo) a partir do Ct de ARN de amostra, respectivamente. ΔΔCt foi então calculada por subtracção da ΔCt do controlo do ΔCt da amostra. Dobre mudança foi calculada pela equação 2-ΔΔCt.

A análise estatística

software SPSS 19 e Microsoft Excel 2010 foi utilizado para analisar os dados. Os níveis de expressão entre os tecidos de câncer e tecidos não cancerosos adjacentes foram analisados ​​pela amostra emparelhado testes t.

P

-Valores abaixo de 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.

Resultados

analisa Microarray

No total, 42,405 genes humanos foram perfilado em nosso estudo por utilizando um microarray da Agilent G3 GE humano 8x60K. Apresentámos o nosso conjunto de dados no repositório de “Gene Expression Omnibus” e o número de acesso foi “GSE65801” (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65801). Usamos modelos lineares e métodos empíricos de Bayes para analisar os dados (ver Métodos). Havia 2371 mRNAs e 350 lncRNAs considerados como os genes diferencialmente expressos por limma para a análise da próxima etapa (Fig 1A).

A parcela) Volcano mostrando os genes diferenciais (pontos vermelhos) no microarray de expressão (

P

-valor 0,01, FDR 0,01). B) Clustering heatmap mostrando os lncRNAs diferenciais. Cada coluna representa uma amostra e cada linha representa um lncRNA diferencial. C) heatmap Clustering mostrando os ARNm diferenciais. Cada coluna representa uma amostra e cada linha representa um mRNA diferencial.

Entre todas 2371 mRNAs diferenciais, há 1142 mRNAs down-regulamentados e 1229 mRNAs-regulada em nossa observação sobre a alteração da expressão do gene entre tecidos e controlo do cancro gástrico (Fig 1C). A maioria dos mRNAs diferenciais têm sido provado ser correlacionada com a carcinogênese e metástase na maioria dos tipos de câncer (Tabela 1). Os genes tais como GKN2, PGC, MUC6, CHIA, PSCA e FBP2 estavam entre os top 20 regulada genes, enquanto KLK8, SFRP4, INHBA, CLDN1, CST1, FAP, SPP1, OLFM4, e KRT17 estavam entre os top 20 até genes -regulated (Tabela 1). No entanto, alguns genes tais como Hoxc9, FNDC1, Stra6, KCNE2, PGA3 e KCNJ16 não foram relatados no câncer gástrico e suas funções permanecem desconhecidos (Tabela 1).

Além disso, encontramos 193 lncRNAs sub-regulada e 156 lncRNAs-regulada entre um total de 350 lncRNAs diferenciais com base no perfil (Fig 1B). A maioria dos lncRNAs não tiver sido dado um nome oficial e as suas funções permanecem desconhecidos. No entanto, alguns têm sido relatados desempenhando papéis críticos em câncer, como H19, GUCY1B2, MEG3 e AKR7L (Tabela 2).

No nosso relatório anterior [36], a mudança vezes (FC) de H19 em 74 cancro gástrico contra tecidos não cancerosos emparelhados foi 6.015, com um

P

-valor de 0,017. Este resultado foi consistente com os dados de H19 (absoluto FC = 6,06) em analisa essa micromatriz. Além disso, a sobre-expressão de H19 contribui para a proliferação, migração, invasão e metástase de câncer gástrico.

categorias Gene Ontologia

Todos os genes diferencialmente expressos foram classificados em diferentes categorias funcionais de acordo com a gene Ontology projeto (GO) para os processos biológicos. Com base em nossos dados de microarranjos, GO análises indicaram que 208 termos GO foram enriquecidos (

P Art 0,01, FDR 0,01) (S1 Tabela). As categorias GO primárias para 170 termos ir até regulamentados se concentraram na adesão celular, angiogênese, desenvolvimento organismo multicelular, orientação axônio, o desenvolvimento do sistema esquelético, colágeno organização fibrilas, regulação positiva da angiogênese, ferindo e regulação negativa da proliferação celular (Fig 2A) . As principais categorias ir para genes regulados por plumas foram digestão, metabolismo de xenobióticos, transporte transmembranar, transporte de íons, pequenas processo metabólico molécula, a regulação negativa de crescimento, processo metabólico da glutationa, a resposta celular ao íon cádmio e processo metabólico (Fig 2B).

A) As principais categorias ir para genes up-regulamentados. B) As principais categorias ir para genes regulados por baixo.

P

-valor 0,01 e FDR. 0,01 foram utilizados como um limite para se inscrever significativas categorias GO

De acordo com os genes e funções diferenciais, nós construímos uma árvore GO para explorar as interações entre todas as categorias GO diferencial. A diversidade nestas categorias quando comparados tecidos cancerosos e de controlo sugeriram que o cancro gástrico pode ser associada com significativamente regulada para cima a migração celular, a proliferação celular, a angiogénese, a adesão célula-célula e receptor de superfície vias de sinalização celular, enquanto os processos de metabolismo celular e transporte de iões transmembranar está regulada para baixo (Fig 3).

Os pontos vermelhos representam-regulada categorias ir e pontos verdes representam regulada categorias GO.

Pathway analisa

pathway análises foram utilizados para identificar as vias significativas associadas com os genes expressos diferencialmente de acordo com KEGG. Havia 32 caminhos up-regulamentados e 31 vias regulada com base em nossos dados (Fig 4). Além disso, o perfil de via era consistente com os resultados para as categorias Go em funções biológicas relacionadas com o cancro. Nossos dados mostraram alguns genes diferenciais altamente regulado para cima que sugeriam suas vias envolvidas foram activiated. Por exemplo, SFRP4, WNT11, FZD2, MYC foram altamente expresso em tecidos de cancro, que representam a via Wnt foi activiated e BCL2A1, ICM1, TNFSF14 na via de NF-kB foram altamente expresso bem. A maioria das vias de sinalização relacionadas com o cancro, tais como JAK /STAT, Wnt, NF-kB, PI3K, mTOR, Hedgehog e vias Notch foram ativadas no câncer gástrico em comparação com os tecidos não cancerosos com base em nossos dados (S2 tabela). Os caminhos-regulada que foram focadas na adesão celular, a desregulação da transcrição, carcinogênese e diferenciação foram correlacionados com tumorig�ese e metástase (Fig 4A). No entanto, as vias reguladas-down eram geralmente responsáveis ​​pelo metabolismo (Fig 4B).

A) Top-ranking-regulada vias identificadas por KEGG. B) Top-ranking vias regulada identificadas por KEGG. percursos diferenciais são listados de acordo com a

P

-valor 0,01 e FDR 0.01.C) rede Caminho-Act mostrando a interação de percursos diferenciais. Os pontos vermelhos representam-regulada vias e os pontos verdes representam vias regulada para baixo.

Gene-Act rede

Com base em categorias ir e análise de caminho, um gene pode estar envolvido em várias vias ou interagir com vários outros genes. Nós reuniram os genes diferenciais e construiu uma rede de interações de genes diferencialmente expressos. Uma proteína de elevado grau regula ou é regulada por muitas outras proteínas, o que implica um papel importante na rede Gene-Act (S3 Tabela). A glutationa-S-transferase (GST) da família, família do citocromo P450 (CYP), UDP glucuronosiltransferase 2 (UGT2) familiar, Factor de Crescimento Epidérmico receptor (EGFR) familiar e dependente de cAMP de proteína cinase beta catalítica (PRKACB) estavam no núcleo do do gene para o gene de rede interacção. Eles podem desempenhar papéis-chave na rede, porque eles possuíam o grau mais forte (grau 25) centralidades (interações gene-gene) (figura 5). Tem sido relatado que a GST, EGFR e PRKACB são responsáveis ​​por vias de transdução de sinal envolvidos no crescimento do tumor e diferenciação em diferentes tipos de cânceres [42,43].

pontos vermelhos representam-regulada genes e os pontos verdes representam genes regulados negativamente. As setas indicam a conexão e relação regulatória entre dois genes. Genes que têm mais conexões com outros genes têm uma pontuação maior grau.

Gene co-expressão de rede

produziu uma rede de co-expressão do gene com base nos genes diferencialmente expressos, proteínas e complexo de proteínas em tecidos de câncer e tecidos não cancerosos (controle), respectivamente. Em comparação com o controlo, as ligações entre os genes em tecidos de cancro eram menos, o que sugere que a maior parte das interacções do gene para o gene fisiológicas e elos em tecidos normais tinham sido quebrado ou perdido nos tecidos de cancro (Fig 6A e 6B). Os genes com elevado grau e k-core, o que significa que eles possuíam a maioria das interações com outras geneswere conhecido como genes-chave na rede de interação (Fig 6B), incluindo TRO, GPR124, TIMP2, EMCN, SLIT3, HTRA1, SPARC, LAMA4 e MEOX2 (Tabela 3). Eles foram responsáveis ​​pela sinalização celular, adesão, angiogênese, migração, crescimento e metástase.

A) genes expressos-Co e sua rede no tecido não canceroso. B) genes expressos-Co e sua rede no câncer gástrico. Quanto maior o valor de K-pontuação, mais forte a genes expressos diferencialmente são co-expressos. A escala do K-score é de 1 a 21 no tecido normal, mas 1-5 no tecido canceroso.

Confirmação de resultados de microarranjos por qPCR

Realizamos quantitativa PCR em tempo real (qPCR) em 6 genes up-regulamentados (COL1A, BGN, SPP1 Melk, IGFBP4, SPARC) e 4 genes regulados negativamente (PGC, SST, MT1X, S100P) para verificar os nossos dados em tecidos com câncer gástrico (tumor) e tecidos não cancerosos (normal). As proporções destes genes 10 (Tumor /Normal) de qPCR de expressão são consistentes com os de microarray (S4 Tabela). Ele sugeriu que os dados de expressão de genes diferenciais de microarray foi confiável. Além do mais, a nossa equipa tem sido trabalhado em alguns dos genes diferenciais, como PHF10 [55], CEACAM6 [56], SFRP1 [57], SOX11 [58], CLDN1 [59] para investigar sua expressão e funções no câncer gástrico e os resultados perfeitos provou nossos dados microarray.

Discussão

microarray gene-expressão análises sobre câncer gástrico foram previamente usados ​​para prever marcadores de diagnóstico [60] e para identificar padrões de expressão de genes associados com o prognóstico [ ,,,0],61,62], mas que não foi usado para revelar interacções moleculares entre lncRNAs e ARNm em GC. Neste estudo, foram analisados ​​26 tecidos de câncer gástrico com tecidos não cancerosos emparelhados e perfilados os genes diferencialmente expressos de acordo com suas categorias GO, percursos, a rede de Gene-Act de rede e Co-expressão.

O gene foram obtidos resultados de expressão utilizando um microarray da Agilent G3 GE 8x60K humano, que abrange não só as bases de dados de transcriptoma para alvos de ARNm, mas também inclui sondas para lncRNAs (RNAs não-codificantes de comprimento). Com a combinação de ARNm e lncRNAs, ele pode executar duas experiências com um único micro-arranjo e predizer a função lncRNA e interacção com os mRNAs. As análises revelaram um conjunto de genes que foram diferencialmente expressos entre o cancro gástrico e tecido normal. Alguns deles têm sido relatados anteriormente em cancros gástricos ou outros. Por exemplo, a expressão de gastrokine-2 (GKN2) foi significativamente regulada para baixo ou ausente em linhas de células de cancro gástrico, metaplasia intestinal gástrica, e tecidos tumorais. A sobre-expressão de GKN2 contribuiu para a proliferação celular, migração e invasão do cancro gástrico e prendeu o ciclo celular na fase de transição G1-S [6]. Em contraste, os níveis de expressão da beta inibina A (INHBA) foram significativamente maiores no tecido de cancro do que em mucosa normal adjacente, e é considerado como um factor independente de prognóstico no cancro gástrico [22]. Além disso, descobrimos alguns novos genes, como TMEM184A, PSAPL1, KIAA1199, CLRN3 e FNDC1, que não foram relatados no câncer gástrico anteriormente, e seus papéis no cancro permanecem desconhecidos.

Uma das vantagens de a análise de micro-arranjo a expressão do gene é representado que a expressão de ARNm e lncRNAs de modo que tanto pode ser investigado em conjunto. O nosso relatório anteriormente sobre o papel do lncRNA H19 e sua rede no GC [36] foi com base nesses dados microarray. No entanto, a maioria dos lncRNAs como DRD5, FMO6P, SNAR-A3 e TPRXL mostrou em nosso microarray não foram identificadas e necessitam de mais investigação para esclarecer seu papel no câncer gástrico.

Com base em nosso perfil de expressão gênica dados, os genes e suas funções ativadas no câncer gástrico foram responsáveis ​​pela proliferação, adesão, migração e metástase, que era consistente com os resultados de análises a partir percurso. Curiosamente, descobrimos que a maioria das vias de sinalização relacionadas ao câncer relatados anteriormente, como Notch, mTOR e Hedgehog foram ativados em GC com base em nossos dados. Estes resultados sustentam a perspectiva de que a heterogeneidade é a característica do GC. Comparação da rede de co-expressão entre tecidos normais e do cancro sugeriu que a expressão, as funções e interacções da maioria do gene fisiológico foram perdidos ou danificados no cancro gástrico, enquanto que a proliferação, migração e metástase foram anormalmente aumentada. Estas descobertas interessantes corresponder às características de câncer, como o anaplasia e desdiferenciação. Estes genes diferencialmente expressos envolvidos em vias de sinalização agiu como genes-chave na rede de co-expressão pode ser potenciais alvos da terapia anti-câncer ou marcadores de diagnóstico no futuro.

Informações de Apoio

Tabela S1. Caminho análises de genes diferenciais

DOI: 10.1371 /journal.pone.0125013.s001

(XLSX)

S2 Table. GO análises de genes diferenciais

DOI: 10.1371 /journal.pone.0125013.s002

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S3 Tabela. rede Gene-Act de genes diferenciais

DOI: 10.1371 /journal.pone.0125013.s003

(XLSX)

S4 Table. Primers e verificação

doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s004

(DOCX)

S5 Table. Métodos e Materiais

doi: 10.1371 /journal.pone.0125013.s005

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Reconhecimentos

Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Fred Bogott no Centro Médico Austin , da Universidade de Minnesota, e Dr. Joshua Liao no Instituto Hormel, Austin de Minnesota, para a sua edição Inglês deste manuscrito. Nós gostaríamos de agradecer aos financiadores para apoiar este estudo. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Natural Science Foundation da China [No. 81172324, 91229106 No., No. 81272749, e No. 81372231], Ciência e Tecnologia da Comissão, de Xangai Município [No. 13ZR1425600] e projectos chave na Science Programa Pillar Tecnologia da China (No. 2014BAI09B03).