Abstract

Fundo

O câncer colorretal (CRC) tem a terceira maior taxa de mortalidade entre a população dos Estados Unidos. De acordo com o mais recente conceito de carcinogênese, tumores humanos são organizados hierarquicamente, e cujo topo é ocupado pelas células malignas estaminais (células-tronco cancerosas, CSCs, ou células iniciadoras de câncer, CICs), que possuem ilimitada de auto-renovação e tumor -initiating capacidades e alta resistência a terapias convencionais. Para refletir a complexidade e diversidade de tumores humanos e proporcionar clinicamente e fisiologicamente relevantes modelos de cancro, grandes bancos de linhas celulares de baixa passagem derivadas de pacientes caracterizados, e linhas celulares especialmente CIC-enriquecidos, são urgentemente necessários.

achados principais

Aqui nós relatamos o estabelecimento de um romance CIC enriquecido, altamente linha tumorigénico e clonogênica câncer de cólon celular, CR4, derivado de metástase hepática. Esta linha celular estável foi estabelecida através da combinação de cultura 3D e 2D cultura em meio de células-tronco, subclonagem de células com determinada morfologia, co-cultura com carcinoma associado fibroblastos (FAC) e transplante de série para NOD /SCID. Usando o RNA-Seq perfis transcriptoma completa da fracção tumorigénico das células CR4 em comparação com as células tumorais a granel, foram identificados aproximadamente 360 ​​transcritos expressos diferencialmente, muitos dos quais representam stemness, pluripotência e resistência ao tratamento. Maioria das células CR4 estabelecidos expressam marcadores comuns de stemness, incluindo CD133, CD44, CD166, EpCAM, CD24 e Lgr5. Usando imunocitoquímica, FACS e análises de Western blot, demonstrámos que uma proporção significativa das células CR4 expressam marcadores chave de marcadores de pluripotência, incluindo Sox-2, OCT3 /4 e de c-Myc. overactivation Constitutivo transportadores ABC e NF-kB e ausência de supressores de tumor p53 e p21 pode explicar parcialmente a resistência aos medicamentos excepcionais das células CR4.

Conclusões

O altamente tumorigénico e clonogênica CR4 CIC enriquecido linha de células pode fornecer uma nova e importante ferramenta para apoiar a descoberta de novos biomarcadores de diagnóstico e /ou prognóstico, bem como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes

Citation:. Rowehl RA, Burke S, Bialkowska AB, Pettet DW III, Rowehl G, Li E, et al. (2014) Estabelecimento de Altamente Oncogenia linhagem celular de câncer colorretal humano (CR4) com propriedades de Câncer putativo Stem Cells. PLoS ONE 9 (6): e99091. doi: 10.1371 /journal.pone.0099091

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Janeiro, 2014; Aceito: 10 de maio de 2014; Publicação: 12 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Rowehl et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por Fusion concessão TRO (PI Dr. Botchkina; 1104347-5-37298), SBU Cancer Center, e vice-presidente SBU para a Investigação (RSR 1111963-3-63845). De acordo com as condições da fusão TRO, do Departamento de Patologia, do Instituto de Química Biologia Drug Discovery (ICB DD) ea Fundação Simons também parcialmente contribuíram para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal tem a terceira maior taxa de incidência e mortalidade entre a população dos Estados Unidos [1]. A atual falta de quimioterapias curativos e a maior taxa de atrito de drogas anticâncer em comparação com outras doenças (apenas 5% de agentes que têm atividade anticancerígena em desenvolvimento pré-clínico são licenciados; [2]) cria uma necessidade urgente de mais fisiológica e fontes clinicamente relevantes de células cancerosas, bem como para mais relevante

in vitro Comprar e

in vivo

modelos. investigação do cancro tradicional e avaliação pré-clínica de fármacos antineoplásicos candidatos são baseadas no uso de longa duração não seleccionada, de alta passagem estabelecido linhas celulares de cancro cresceu como culturas em monocamada. No entanto, a longo prazo

In vitro

manutenção inevitavelmente leva à acumulação de alterações genómicas e epigenômicos adicionais, bem como a selecção das subpopulações de células dominantes. De facto, foi recentemente demonstrado que as linhas celulares de cancro estabelecidas mais vulgarmente utilizados têm nenhuma correlação com amostras clínicas originais [3]. Isto sugere que a utilização de linhas celulares estabelecidas para o estudo de alterações genómicas, a descoberta de alvos moleculares clinicamente relevantes, e desenvolvimento de fármacos no tratamento é questionável, visto que a utilização destas linhas de células não leva em conta a complexidade e fisiopatologia da

In vivo

tumores.

é amplamente aceito que os tumores humanos são organizados hierarquicamente, e no topo dessa hierarquia é ocupada por células-tronco malignas, que possuem ilimitada de auto-renovação e capacidades de iniciação do tumor. De acordo com o mais recente conceito de carcinogênese, que revolucionou o entendimento da tumorigênese e tratamento do câncer, única subpopulação fenotípica específica (s) de células-tronco cancerosas (CICs) ou células iniciadoras de câncer (CICs) são responsáveis ​​pelo desenvolvimento do tumor, a produção de todo o espectro da progénie diferenciada que compõem uma massa de tumor, metástase, e resistência a terapias anti-cancro [4] – [6]. Tais células foram recentemente isolados a partir de todos os principais tipos de cancro humanos, incluindo os cancros colo-rectais [7] – [9]. Numerosos estudos demonstraram que fenótipos específicos de células cancerosas de iniciação do tumor de haste semelhante são altamente resistentes ao fármaco e são capazes de auto-renovação após intervenções terapêuticas normais [10] – [17]. Todas as considerações acima destacar o papel crucial dos CICs na descoberta de alvos moleculares clinicamente relevantes e desenvolvimento droga anticâncer.

A identificação e caracterização de CICs derivado do paciente, o desenvolvimento de melhor

In vivo

e

in vitro

modelos pré-clínicos e análises CIC-alvo de alterações induzidas pela droga representam passos críticos na avaliação de terapias anti-cancro novos. É evidente também que, a fim de manter a fidelidade adequado para os tumores originais, as células de iniciação de cancro (CICs), bem como outros tipos de células utilizadas para o perfil genómica e proteómica, deve ser isolado a partir de um largo espectro de tumores primários e metastáticos , não a partir das linhas celulares de cancro estabelecidas. No entanto, é notoriamente difícil estabelecer linhas de células primárias e em particular linhas de CIC de espécimes tumorais frescas [18]. Em primeiro lugar, existem dificuldades objectivas para o isolamento de populações de células puras a partir de tecidos tumorais heterogéneas. impureza tumor (diferentes níveis de contaminação de células não tumor) e multiclonality são problemas bem documentados [19], [20]. No nível molecular, não existem actualmente marcadores definitivos para provar a natureza maligna ou não maligna das células, bem como para distinguir com precisão entre as células-tronco normais e cancerosas. A evidência crescente sugere também que os AIC pode representar uma subpopulação heterogénea das células tumorais de iniciação [21] – [25]. No entanto, uma combinação de abordagens múltiplas e vários marcadores de superfície celular, seguido por uma caracterização funcional completa dos fenótipos de células isoladas pode permitir a purificação da maior parte funcionalmente significativo, isto é, do tumor e a metástase de iniciação e as células mais resistentes aos medicamentos. Várias linhas celulares colorrectais de diferentes características celulares, bioquímicos e moleculares têm sido estabelecido durante as últimas duas décadas [26] – [30]. Aqui nós relatamos o estabelecimento de um romance CIC enriquecido, linha de células de cancro colo-rectal altamente tumorigênico isolado de metástase hepática de um paciente CRC.

Resultados

Amostras de pacientes e culturas primárias

suspensões de células dissociadas de 13 carcinomas colorretais recentemente ressecados de vários graus histológicos e 3 metástases hepáticas foram testados para clonogênica e tumorigénico potencial

in vivo

e

in vitro

como descrito na secção de Métodos. Duas amostras foram severamente contaminados com bactérias, e apesar de repetidos tratamentos com antibióticos, as colónias primárias também estavam contaminadas e, por conseguinte, descartados. Duas culturas primárias desenvolvidas a partir de amostras de tumores primários e metastáticos de pacientes previamente tratados com quimioterapia foi submetido a morte celular profunda após 1-2 dias em cultura e não mostrou quaisquer células viáveis ​​durante a próxima semana de observação. Os outros nove amostras continha uma subpopulação de células rápidos-aderente (FA) para o colagénio do tipo I, que inicialmente proliferaram em meio para mastócitos isento de soro e induzida esferóides, que são característicos da AIC, bem como agregados multicelulares soltas em 3D flutuante culturas. No entanto, 6 de 9 culturas primárias perderam as suas capacidades clonog�icas e formando-esfera depois de várias passagens, o que está em linha com numerosas observações que as células cancerosas primárias têm uma vida útil limitada (cerca de 5-6 passagens) [31]. Em contraste, as células tumorais isoladas da metástase do fígado do paciente do sexo masculino com estágio 4 de câncer de cólon continuam a longo prazo

in vivo

e

in vitro

crescimento (15 passagens, atualmente) e representam um estabelecido, CIC enriquecido linha de células de cancro do cólon, CR4. Três outras culturas primárias estão actualmente em evolução semelhante à linha celular de CR4. Estas células estão em processo de caracterização funcional, genómico, celular e molecular.

heterogeneidade celular e clonal de células tumorais CR4

Após o isolamento inicial do aderente rápido ao colagénio tipo I de células de tumor primário e sua propagação

in vitro

em MSCB ou SPC mídia, vários tipos diferentes de forma e morfologia celular clone eram evidentes: (i) densamente células fusiformes longos representam carcinoma associado fibroblastos (FAC) e fibroblastos normais, que foram fenótipo celular dominante logo após isolamento e durante diversas passagens iniciais da cultura (Figura 1A); (Ii) células alongadas grandes esparsas com processos dychotomized (Figura 1B); (Iii) os clones pequenos raras contendo células redondas pequenas cerca de 7-10 um de diâmetro, com um rebordo muito fina do citoplasma e grandes núcleos alongadas (Figura 1C, D); e entre eles, (iv) rara, muito grande (≥100-200 uM), muitas vezes multinucleados células (PTM; Figura 1E). Nós muitas vezes observamos tais células em ambas as linhas celulares de cancro do cólon e próstata estabelecidos e primários cultivados em condições de promoção stemness. Estas células gigantes multinucleadas foram capazes de tanto a proliferação lenta, produzindo tanto EMNs adicionais (Figura 1F) ou células mononucleares grandes.

(a) Inicialmente dominando população de células semelhantes a fibroblastos alongados densamente embalados. células tumorais alongadas com processos (B) esparsa. (C) Aparecimento de pequenos aglomerados de células muito pequenas (~ 7 ^ M) adjacente para as células semelhantes a fibroblastos. (D) holoclone típica induzida por células CR4 pequenas. células multinucleadas (E) gigante dentro CR4 holoclone de células pequenas. (F) Colônia de células multinucleadas.

Cultura

Temos continuado das populações de células mistas em condições de promoção stemness definidos espera que esta abordagem, semelhante ao nosso de próstata primário previamente estabelecido CIC enriquecido linha celular, ppt2 [32] vai conduzir à propagação dos CICs raras. De acordo com as nossas observações, foi demonstrado anteriormente que a co-cultura das células de cancro do cólon com fibroblastos associada a carcinoma levaram a anincrease no número de CICs através da activação da via β-catenina [33]. Finalmente, Passaging limitado de células primárias de um meio de células-tronco conduziu ao aparecimento de numerosos esparsos, pequenas, clones densamente empacotados contendo células com extremidades lisas (holoclones) rodeadas por células alongadas (Figura 2A). Este padrão é característico para embrionário, pluripotente induzida e outros tipos de células estaminais co-cultivadas com fibroblastos [32], [34]. Sucloning de tais holoclones levou ao estabelecimento da linha de células de câncer de cólon purificada, CR4, com todas as características básicas de CICs, incluindo alta tumor de iniciação, 3D esferóides e capacidades e expressão da pluripotência de formação de holoclone e células-tronco relevantes marcadores (descrito abaixo). Juntamente com os holoclones lisas gumes putativos, células CR4 pode induzir paraclones com bordas difusas (Figura 2C), que são característicos de células progenitoras. Durante as passagens anteriores, quase todos os holoclones CR4 continha uniformemente embalado células pequenas do centro para a periferia do clone (Figura 2B). No entanto, as passagens posteriores tinham taxas muito mais elevadas de grandes células multinucleadas predominantemente localizados na periferia do clone, enquanto que as células pequenas ocupou a parte mais central do clone (Figura 2 E, F). Os ultra-baixas passagens das células CR4 são mantidos em alíquotas em nitrogênio líquido; Atualmente, esta linha está na passagem 14. Para a caracterização descrito, as alíquotas congeladas foram propagadas quer como NOD /xenotransplantes tumorais SCID, flutuando esferóides 3D ou tipo I culturas de colágeno-aderente.

(A) Clone de células CR4 pequenos cercados por células longas fibroblasto com processos dychotomized. (B) Após subclonagem, pequenas células CR4 semeadas a baixa densidade em SPCM sem soro em colágeno tipo I produzido holoclones típicos densamente característicos de células-tronco de origem diferente. (C) Paraclone de células maiores alongados adjacentes a células pequenas CR4. (D) Baixo número de pequenas células purificadas produzidas predominantemente holoclones gumes redondas e paraclones raros aderentes ao colágeno tipo I com alta eficiência. (E) Maior ampliação das células holoclone com grandes núcleos e borda fina de citoplasma. (F) as multinacionais grandes (≥200 mm; hematoxilina e eosina). Geralmente estão localizados na periferia das holoclones

Caracterização funcional de células CR4

Para confirmar o estado stemness da linha celular CR4, vários ensaios funcionais foram realizadas incluindo a avaliação da iniciadora do tumor potencial (capacidade de formar tumores subcutâneos em NOD imunodeficiente /SCID), a capacidade de formação de esfera (capacidade para formar esferóides flutuantes densas em culturas 3D não aderentes) e clonogenicidade (capacidade de formar aderente ao colágeno tipo I holoclones). Foi determinado que as células CR4 possuem alta eficiência na indução de tumores em ratinhos NOD /SCID (Figura 3A) após o transplante subcutâneo em série do número de células relativamente baixa. Assim, 1 × 10

3 CR4 células ou 2-3 esferóides de flutuação induzidas grandes tumores em todos os ratinhos (6 ratinhos por cada grupo). Para determinar as capacidades clonogénicas e formando-esfera das células CR4, um número conhecido de células foram semeadas em placas aderentes do tipo I de colagénio revestidas ou ultra-baixo, respectivamente. Após uma semana de incubação, os clones induzidos ou aderentes esferóides flutuantes foram contadas e a eficiência clonogénicas foi calculada como a razão entre o número de células semeadas em comparação com o número de colónias induzidas ou esferóides. Em particular, determinou-se que após a sementeira de células, não triados CR4 de passagem 13 em diluição em série (250, 100, 50 e 25 células /poço de placas de 96 poços) sobre uma célula em 10 (10%) holoclones perfeitas induzidos (Figura 2B, D). eficiência da fração CD133 positivo das células CR4 na cultura 3D com tipo 5% I colágeno em SPCM formando Sphere-se maior em comparação com as populações de células com depleção de CD133 (8,4 ± 2,6 contra 3,7 ± 0,6 esferóides por 100 células semeadas /bem , respectivamente). Ambos os holoclones e esferóides foram embalados com células muito pequenas que expressam níveis elevados de marcadores stemness comuns, incluindo EpCAM, CD133, CD44, CD166 e Lgr5 (descrito abaixo). Embora o CD133 (clone 293C3), bem como quaisquer outros marcadores usuais, não é ideal para CICs cólon, no entanto, permite o enriquecimento adicional da esfera e formando-fracção das células CR4-iniciando tumor.

(a) Grande tumor subcutâneo induzido por transplante das células CR4 (1 × 10

3) em NOD /rato SCID (passagem 2). (B) esferóides densas flutuantes induzidas por passagens em série das células CR4 na cultura 3D nas placas ultra-low-aderente. (C) esferóide tridimensional induzida sobre a superfície do holoclone CR4 aderente. (D) formação de um grande 3D organ�de na superfície do holoclone CR4 aderente. (E) Aparecimento de processos longos em células induzidas por células esferóides CR4 em cultura 3D contendo 15% de gel de colagénio, o que indica o seu elevado potencial invasivo [35]. (F) longa dychotomized processos desenvolvidos por células CR4 pequenas aderentes. (G) processos longos de multinacionais aderentes.

A natureza agressiva e excepcional capacidade /clonogênica de células CR4 foram demonstrados por sua capacidade de produzir esferóides flutuantes não apenas em culturas não-aderentes (Figura formadoras de esfera 3B), mas também por gemulação do aderente ao colagénio do tipo I holoclones e consequente desprendimento dos esferóides formadas (Figura 3C). Os holoclones CR4 também foram capazes de produzir grandes Organóides multicamadas aderentes directamente acima da superfície do holoclone (Figura 3D). Flutuante esferóides CR4 comportado de forma diferente em sistemas de cultura 3D com e sem colágeno tipo I géis em media de células estaminais (MSCBM ou SPCM). Assim, esferóides cultivadas sem ou com baixo por cento de gel de colagénio (até 5%) geralmente têm cantos arredondados (Figura 3B), ao passo que a concentração de gel superior (até 10-15%) conduziu ao aparecimento de múltiplos processos, que se formou asterisco -como estruturas circundantes esferóides (Figura 3E). Tal fenótipo de esferóides flutuantes foi recentemente associado com alta capacidade metastática de células de cancro particulares [35], o que está de acordo com o facto de a linha de células de CR4 foi estabelecida a partir de metástases do fígado do paciente com cancro do cólon. Da mesma forma para a cultura em 3D, a natureza invasiva das células CR4 foi reflectida pela sua capacidade de desenvolver processos longos, grandes, dicotomizados no bordo exterior dos clones aderentes (Figura 3F). As grandes células multinucleadas na periferia dos clones, descrito acima, bem como células gigantes multinucleadas individuais, também muitas vezes exibida longas e dychotomized processos (Figura 3G).

profiling fenotípica de células CR4

Como mencionado acima, a subclonagem das pequenas de células contendo holoclones levaram ao enriquecimento dramático de células que expressam níveis elevados de marcadores stemness e pluripotência (Tabela 1; Figuras 4 e 5). Em geral, caule fenótipo celular

in vitro

é dinâmico devido à natureza dual da CICs (isto é, sua capacidade de se auto-renovar e gerar progenitores comprometidos). Assim, iniciais e intermediários passagens das células CR4 primárias teve fenótipo instável expressando níveis altamente variáveis ​​de CD133, CD44 e EpCAM (Tabela 1 e Figura 4A). Os NOD /SCID xenoenxertos de tumor ratinhos induzidos por estas células expressaram níveis similares de todos os marcadores estudados (Figura 4B). Em contraste, as células purificadas CR4 reter fenótipo relativamente estável em 3D e aderente ao colagénio de tipo I culturas. Assim, três FACS independente analisa durante os últimos 7 meses (passagens 6-14) mostraram que virtualmente toda a população de células CR4 permanece indiferenciado (apenas 3-5% marcador expresso de diferenciação, Pan-queratina), e a maioria das células expressam níveis elevados de CD133 (62-82%), CD44 (65-99%), CD166 (97-98%), EpCAM (98-99%) e Lgr5 (80-83%; os dados de FACS representativos são mostrados na figura 4C). Em particular, cerca de 65% das células co-expressa níveis elevados de CD44 e CD133. Importante, cerca de 20% de células são positivas para CR4 marcador da actividade metastática, CXCR4.

(a) Análises FACS representativas da expressão diferentes marcadores de superfície celular em cultura primária precoce das células CR4 rápidas-aderentes cultivadas em colágeno tipo I em meio MSCB. Análise (B) de FACS da primeira passagem de células tumorais isoladas de FA NOD /SCID xenoenxertos de tumores induzidos por células CR4-precoce de passagem. (C) aumento dramático na expressão dos marcadores comuns de stemness, incluindo CD133, CD44, CD166, Lgr5 e EpCAM na tarde da passagem (p13) Células CR4. Note-se que 19% das células também expressaram marcador de CICs com actividade metastática, CXCR4, que foi identificada em vários cancros humanos.

(A) A localização nuclear de marcadores chave de pluripotência, c-Myc, Sox- 2 e OCT3 /4. (B) co-localização de nuclear c-Myc com expressão alta de membrana de CD133. (A, B: Análise imunocitoquímica de células CR4 cultivadas em colágeno tipo I revestido de lâminas de câmaras). (C) Análise de Western blot, confirma a expressão de c-Myc e Out-3/4 nas fracções nucleares de células CR4. Em contrapartida, eles são negativos para p53 e p21. fracção nuclear também expressa a níveis mais elevados de p65 fosforilado (que indicam a activação constitutiva do NF-kB), enquanto que o p65 unphosphorilated foi localizado predominantemente no citoplasma. (D, E) Representante FACS análises mostram maior expressão de Sox-2 e c-Myc em células CD133-positivos em comparação com células não triados. (F) A análise imunohistoquímica mostra a expressão nuclear alta de Sox-2 na SCID xenotransplante NOD-induzida CR4 /mice tumor. (G) Controlo negativo (secção de tecido sem incubação com primário anti-Sox-2 Abs).

Usando imunocitoquímica, FACS e análises de Western blot, nós mostramos que uma proporção significativa da CR4 células expressam diversos marcadores chave de pluripotência, incluindo Sox-2, OCT3 /4 e de c-Myc. A localização nuclear destes marcadores mostrado por ICC (Figura 5A, B) foi confirmada por Western blotting (C), o que demonstrou a sua expressão na fracção de proteína nuclear e a sua ausência na uma citoplasmática. Verificou-se que a CD133

+ fracção das células CR4 expressar proporções mais elevadas de vários marcadores de pluripotência em comparação com as células não triados CR4. Assim, a análise de FACS mostrou que mais do que um quarto da CD133

+ população expressa Sox-2 e 10% da população eram positivos para c-Myc (Figura 5D). Em contraste, células não triados e CR4 fracção CD133-negativas expressaram níveis inferiores destes marcadores de pluripotência (6 e 4%, e de 1,4 e 0,8%, respectivamente; Figura 5E; fracção negativa não é mostrado). análise de co-localização mostrou que apenas as células com a maior expressão de CD133 geralmente têm coloração nuclear para os marcadores pluripotancy (Figura 5B; única de c-Myc é mostrado). Alta proporção dos Sox-2positive células e sua localização nuclear também foi confirmada por IHC dos NOD /xenotransplantes tumorais SCID (Figura 5F). [De notar, a utilização do anti-OCT3 /4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) para análise FACS fornecida suspiciously elevadas percentagens de células positivas (mais de 90%) e estes dados não foram incluídos.] Importante, o CR4 células, linha celular semelhante à próstata enriquecido CIC ppt2 [32], não expressaram os dois principais reguladores dos genes supressores de tumores e apoptose, p53 e p21 (Figura 5C). Além disso, a fracção nuclear das células CR4 cultivadas em colagénio do tipo I em meio de células estaminais tal como holoclones separadas expressa fortemente p65 fosforilado, o que significa que o NFkB é constitutivamente sobre-expresso em AIC colorrectais. Em contraste, a p65 fosforilada foi localizada predominantemente na fracção citoplasmática. Todas as opções acima podem explicar parcialmente as altas capacidades tumorigênicos e clonog�icas e resistência aos medicamentos excepcional desta linha celular CIC-enriquecido. Em particular, as células CR4 são altamente tolerantes ao tratamento com fármacos citotóxicos vulgarmente utilizados, tais como o paclitaxel ou Taxol (Figura 6). Assim, após o tratamento de 72 horas no intervalo de concentração de 10 nM até 10 uM (ensaio MTT), células CR4 demonstraram pouca ou nenhuma citotoxicidade; Além disso, eles muitas vezes aumentada a sua proliferação em resposta a doses mais baixas de paclitaxel. Descobrimos que vários membros da tax�des de nova geração, incluindo SBT-1214, SBT-121602 e SBT-12834 são mais eficazes contra células iniciadoras de tumores CR4. A taxa de morte IC50 foi alcançado em todos ≥10 uM de concentração de fármacos. De notar que a eficácia promissora de baixas concentrações de taxóides de nova geração pode ser ainda melhorada pela sua combinação com o derivado sintético da curcumina, CMC2.24 (dados não publicados), o que está em consonância com o nosso estudo anterior [32].

usado comumente o paclitaxel (Taxol) em doses inferiores a 10 uM não é eficaz contra células CR4 e geralmente aumenta a sua proliferação. Em contraste, vários taxóides nova geração de induzir a inibição dependente da dose da proliferação destas células de iniciação do tumor potentes. (Ensaio MTT após tratamento com drogas durante 48 horas).

valores p

obtidos para todas as drogas e todas as concentrações da droga eram muito menores que 0,05. O maior

valor p

foi obtido para SBT-1214 a 10 concentração nM (

p

= 0,0131); em especial, a uma concentração de 10 mM de SBT-1214

p

= 0,00032.

histopatológica e IHC análises dos NOD /xenotransplantes tumorais SCID

Como nós mencionado acima, o transplante subcutânea de um número relativamente baixo de células CR4 (1 × 10

3 das células CR4 dissociados ou 2-3 esferóides flutuantes) induzidas grandes tumores vascularizados em todos NOD injectados /SCID (Figuras 3A e 7A) . As secções de tecido hematoxilina-e manchadas de eosina dos xenoenxertos de tumor ratos mostraram características histológicas clássicas de câncer de cólon metastático humano (Figura 7b, C). células epiteliais altamente atípicas formadas estruturas das vilosidades-like com núcleos alongados e proeminentes, de acordo com adenocarcinoma pouco diferenciado, inúmeras figuras de mitose atípicas. necrose central foi geralmente presentes. Numerosas células multinucleadas grandes eram evidentes na maior ampliação (Figura 7C; setas). A análise imunohistoquímica revelou que toda a área do tumor (mas não estroma tumoral) expressaram niveis elevados da EpCAM-localizado da membrana (Figura 7D, E). padrões e os níveis de expressão semelhantes eram característicos para CD166 (F). Em contraste, a imunocoloração com anticorpo policlonal CD44 (clone F10-44-2; Invitrogen /Biosources, EUA) revelou três padrões diferentes de expressão em diferentes áreas do mesmo tumor, isto é claramente membrana (Figura 7G), bem como citoplasmática e nuclear claramente em outras partes (Figura 7H). expressão cytolasmic alta do marcador comum de células-tronco do cólon e CICs, Lgr5, foi evidente em algumas partes do tumor (Figura 7J), enquanto que em outras partes, ou era moderada ou fracamente expresso (K), ou mesmo ausente. Grandes áreas de xenoenxertos de tumor expressa coloração nuclear forte para o marcador pluripotência Sox-2 (Figura 7L).

(A) tumor Grande induzida por transplante de 1 × 10

3 CR4 células. (B) Hematoxilina e secção de tecido manchado de eosina mostra características histológicas clássicas de câncer de cólon metastático humano. (C) Ampliação de alta potência da região mostrado em (B); setas mostram células gigantes multinucleadas dentro das estruturas papilares. (D, E) expressão na superfície celular forte do marcador epitelial, EpCAM. (F) expressão na superfície celular Forte de CD166. (G) expressão citoplasmática de CD44. (H) foco microscópico com nuclear forte e fraca expressão citoplasmática de CD44. (I), controlo negativo (Abs primária foram omitidas). (J, K) expressão forte e moderada, respectivamente, do marcador de células-tronco do cólon, Lgr5 /GPR49. (L) expressão nuclear forte do marcador pluripotência, Sox-2 em grandes áreas do tumor.

RNA-Seq completa profiling transcriptoma de CR4 pequena contra células tumorais granel

Usando RNA-Seq, foi realizada uma análise genómica funcional em fracções de iniciação do tumor de CR4 (pequenos), as células cultivadas aderentes a colagénio do tipo I contra cultivadas como esferóides 3D, em comparação com as células tumorais a granel (longas e dychotomized células cultivadas sob condições de cultura convencionais ). Usando um HiSeq 2000, sequenciado entre 40 e 50 milhões de leituras por amostra biológica, tal como descrito anteriormente [35], [36], [37]. Em resumo, as bibliotecas de NGS foram feitas a partir de 100 nanogramas de ARN total. A qualidade de amostras de ARN foi avaliada com um Agilent Bioanalyzer. Todas as amostras de RNA teve um RIN acima 8. bibliotecas de sequenciação foram criadas utilizando o kit Illumina TruSeq mRNA Stranded LT de acordo com as recomendações do fabricante. A qualidade de cada biblioteca foi avaliada com o ensaio de elevada sensibilidade Agilent Bioanalyzer, e quantificados por qPCR (Kappa Biosystem, CT). As bibliotecas foram reunidas em conjunto a 10 nM com base nos resultados qPCR, e, em seguida, o conjunto foi novamente quantificada por qPCR. A biblioteca agrupada foi sequenciado em uma pista de uma célula de fluxo de 100 pb final HiSeq2000 emparelhado. Isto permitiu-nos detectar quais são transcritos diferencialmente expressos entre estes tipos de células CR4, construindo assim uma imagem abrangente das vias de sinalização ativadas ou reprimidos. Verificou-se que células CR4 pequenas produzidas quer como holoclones separadas aderentes a colagénio do tipo I ou como flutuante 3D esferóides possuem um grande número de genes diferencialmente expressos em comparação com as células de tumor cultivadas em massa sob condições de cultura padrão. Assim, em células aderentes pequena CR4 e esferóides 3D, 357 e 365 genes, respectivamente, foram sobre-expressos em comparação com as células de longa (a granel) de tumor CR4. Entre estes genes, 287 foram geralmente regulada, o que significa que ambas as condições de cultura para permitir a manutenção das células pequenas CR4 em estado stemness. Em particular, tanto pequenas esferóides aderentes e 3D expressa-se a várias ordens de grandeza de regulação positiva no seguinte: (i) múltiplos marcadores comuns de stemness, incluindo CD44, CD24, EpCAM, ESA, Lgr5, ALDH1A1 e outros; (Ii) Os factores de crescimento, incluindo o epidérmico (EGF), fibroblastos (FGF) e factor de crescimento transformante-beta (TGF-p) membros da família; (Iii) os factores de transcrição (TFS), incluindo homeobox múltipla (CDX1, CDX2, CEACAM6, MSX 2) e TFs pluripotência (POU5F1B, Oct4, SOx-2, SOx-9; (iv) as citocinas inflamatórias e seus receptores, incluindo IL-18, IL20 , IL2RG, IL20RA e outras; (v) transportadores ABC, (vi) os genes responsáveis ​​pela transferência de fosfato de alta energia das mitocôndrias (CKMT1 e CKMT1B) e os membros da família citocromo P450, incluindo CYP2B6, CYP2J2, CYP2S1 e outros de interesse. , a fracção de iniciação do tumor das células CR4 sobre-expressa múltiplos genes que controlam a adesão célula-a-célula, incluindo caderinas (CDH 1, 3 e 17, e CDHR5); intergins (ITGB4), genes que codificam proteínas apertado-junção (CLDN3, 4 e 6, COL17A1 e outros);. e queratinas (KRT19, 20, 23 e KRTAP3-1) Esta descoberta apoia a nossa abordagem tradicionalmente utilizado para o enriquecimento inicial das células iniciadoras de tumores da próstata e cólon com base em sua capacidade de aderir ao tipo I os dados de RNA-Seq brutos obtidos foram submetidos ao Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO), um repositório de dados de genómica funcional pública superfícies dentro de 15-20 minutos de incubação revestidas de colágeno. (o número de ID é <