Sumário

mouse modelos foram desenvolvidos para investigar a etiologia do câncer colorretal e avaliar novas terapias anti-câncer. Enquanto engenharia genética e modelos de rato induzida por carcinogénico forneceram informação importante no que diz respeito aos mecanismos subjacentes ao processo oncogénico, modelos de xenoenxerto do tumor sendo o padrão para a avaliação de novos tratamentos quimioterapia e orientada de drogas para uso clínico. No entanto, ainda não está claro até que ponto explantado tecidos tumorais colorretais mantêm as características patológicas inerentes ao longo do tempo. Neste estudo, nós geraram um painel de 27 explantes derivados de pacientes Câncer Colorretal (PDCCEs) por transplante direto de tecidos de câncer colorretal em humanos em camundongos NOD-SCID. Usando esse painel, foi feita uma análise da histologia, expressão gênica e estado de mutação entre PDCCEs e os tecidos humanos originais de onde foram derivadas. Nossos resultados demonstram que PDCCEs manter as características histológicas chave, padrões de expressão genética básica e

KRAS

/

BRAF

estado de mutação através de múltiplas passagens. No seu conjunto, estes resultados sugerem que PDCCEs manter semelhança com o tumor do paciente a partir do qual eles são derivados e podem ter o potencial de servir como um modelo pré-clínico de confiança que podem ser incorporados em futuras estratégias para optimizar a terapia individual para pacientes com cancro colo-rectal.

Citation: Uronis JM, Osada T, McCall S, Yang XY, Mantyh C, Morse MA, et al. (2012) histológica e molecular Avaliação do Paciente-Derived Colorectal Cancer explantes. PLoS ONE 7 (6): e38422. doi: 10.1371 /journal.pone.0038422

editor: Alana L. Welm, Instituto de Câncer Huntsman da Universidade de Utah, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de março de 2012; Aceito: 09 de maio de 2012; Publicação: 04 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Uronis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Mentored Scholars Research Grant (119824-MRSG-10-195-01-TBG) a partir da American Cancer Society (www.cancer.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum ea segunda causa de morte por câncer nos Estados Unidos. Em 2010, cerca de 142.000 pessoas foram diagnosticadas com CRC, e cerca de 40% desses pacientes apresentavam doença avançada [1]. O tratamento para a CRC avançado com a quimioterapia é geralmente destinada ao controle de doenças e cuidados paliativos de apenas os sintomas, e, como resultado, irressecável CRC continua a ser uma doença incurável. A fim de melhorar os resultados clínicos e desenvolver novas abordagens terapêuticas, o desenvolvimento de um modelo pré-clínico confiável para estudar CRC biologia e drogas sensibilidades é necessária.

modelos do rato do CRC continuam sendo uma das ferramentas mais úteis para decifrar o biológico mecanismos subjacentes ao processo oncogênico. Até à data, uma variedade de tecnologia de engenharia genética, modelos induzido por carcinógenos e mouse xenoenxerto foram estabelecidos [2], [3] e é geralmente aceite que existe um modelo único é suficiente para elucidar todos os aspectos da CRC etiologia.

rato geneticamente (GEM) foram inestimáveis ​​para estabelecer o papel de muitas mutações genéticas diferentes e vias de transdução de sinal que contribuem para o processo de oncogénica e permitir a investigação no contexto de um sistema imune activa [2], [3]. No entanto, muitos destes modelos GEM, principalmente aqueles que envolvem mutações da

APC

gene supressor tumoral, desenvolvimento de tumores no intestino delgado em vez de no cólon. Isso faz com que a progressão da doença estudos longitudinal difícil além de não ter a complexidade genética observada em cancros humanos [2], [3].

Outros modelos de ratinho utilizada de CRC baseia-se na utilização de agentes cancerígenos para induzir o desenvolvimento do tumor colorrectal . Talvez o modelo baseado em cancerígena mais amplamente utilizado é o modelo Azoximetano (OMA). Aqui, o desenvolvimento do tumor colo-rectal é iniciada por AOM, uma potente cancerígeno específico do cólon através da formação de aductos de ADN [4]. tumores colorrectais derivadas usando este modelo recapitular características patológicas humanas principais observados em seres humanos e permitir a investigação dos estágios iniciais de CRC. No entanto iniciação e desenvolvimento do tumor é um processo demorado, muitas vezes levando até 6 meses com a multiplicidade de tumores e penetrância dependendo fortemente da estirpe de ratinhos [2], [5], [6].

Enquanto GEM e cancerígena modelos baseados em ter melhorado significativamente o nosso conhecimento das genética e etiologia da CRC, estes modelos não permitir um teste preciso do cancro terapêutica para ser usado no ambiente clínico [7]. O

in vivo

modelo mais amplamente utilizado para o teste de eficácia da droga anti-câncer e combinações é o modelo de xenotransplante. Historicamente, os xenoenxertos foram estabelecidas através da injecção subcutânea de linhas celulares derivadas de humanos geneticamente definidas em ratinhos nus imunocomprometidos [8]. No entanto, até à data, a maioria desses baseados em modelos de xenoenxerto linha celular não conseguiram gerar dados de sensibilidade ao fármaco que se traduz em informações clinicamente relevante [7]. Além disso, relatórios recentes sugerem que as interacções de tumor de estroma não apresentar em xenoenxertos-baseado numa linha celular pode constituir um componente essencial na resposta do tumor e o potencial oncogénico droga [9], [10]. Portanto, mais recentemente, os explantes de tecido inteiro derivada de cancros humanos incluindo cancro da mama [11], do pulmão [12], da próstata [13] e do cancro colo-rectal [14] – [16] foram estabelecidas em uma tentativa para gerar mais clinicamente preciso e modelos de xenoenxerto de confiança. No entanto, estes estudos examinaram explantes de passagem, principalmente no início ( 5 gerações) de tumores predominantemente primárias e, portanto, continua a haver a necessidade de caracterizar ainda mais esses modelos e avaliar quão bem eles mantêm características importantes do tumor humana original especialmente na doença metastática

H e seções manchadas de dois adenocarcinomas bem diferenciados independentes (CRC039 e CRC075) mostram que a arquitetura tumor permanece semelhante após 11 passagens em NOD /SCID. As imagens mostradas são de 20 × ampliação.

A. PDCCE Representante (CRC039) mantém expressão CDX2 nuclear após 11 gerações em camundongos. As imagens mostradas são de 20 × ampliação. B. PDCCEs passagem precoce reter morfologia anel de sinete observado em tumores colorectal paciente inicial. As imagens mostradas estão em ampliação de 40 ×. C. Os xenoenxertos gerado a partir de linhas de células WiDr e HT29 CRC falta histológica características consistentes com explantes derivados de doentes, incluindo a presença de estroma e a formação de glândulas. As imagens mostradas são de 20 × ampliação.

Neste estudo, realizamos uma análise molecular e histológica mais abrangente de um painel de 27 explantes combinados derivados de pacientes Câncer Colorretal (PDCCEs) de ambos os primário e sítios metastáticos como uma extensão do nosso trabalho anterior [17], no qual comparamos o perfil de 14 PDCCEs combinados e seus tumores humanos correspondentes a expressão do gene. Nós agora demonstrar que PDCCEs manter os padrões globais de expressão gênica, estado de mutação oncogene e parâmetros histológicos presentes nos cancros humanos originais. No total, estes resultados sugerem que PDCCEs têm o potencial de servir como um modelo pré-clínico confiável, que pode ser usado para desenvolver e caracterizar novos alvos terapêuticos para pacientes com CRC.

Materiais e Métodos

amostras de tumor /ética Declaração

Um total de 27 amostras humanas foram obtidas para análise genômica e histológica. Todos os pacientes forneceram consentimento por escrito para ter tecido armazenados e utilizados para a investigação. As amostras utilizadas para análise em laboratório foram de-identificados e não está ligado a qualquer informação pessoal de saúde (PHI). Todas as partes deste estudo foram aprovados pelo Duque Institutional Review Board. Todos os estudos com animais foram realizados sob um Comitê Animal Care Institucional e Use Duke University (IACUC) aprovou o protocolo.

análise de agrupamento não supervisionado de 27 paciente tumor-PDCCE pares combinados mostram que 22 pares (81%) caiu dentro do mesmo agrupar e 18 PDCCE combinado (66%) directamente agrupados em pares com o tumor original é paciente (caixas cinzentas). nomes da amostra contendo um PDCCE X denotam (xenoenxerto) amostras. O número imediatamente a seguir ao X indica o número de geração /passagem dessa amostra particular.

Geração de Patient-Derived Colorectal Cancer explantes (PDCCEs)

tumores colorretais (ambos metastático primário e ) no momento da cirurgia foram recolhidas ao abrigo de um protocolo aprovado Duke IRB (Pro00002435). Os tecidos foram lavados com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em seguida, triturada em pedaços de aproximadamente ~ 2 mm de tamanho e injectado nos flancos de NOD.CB17-PrkdcSCID-J ratinhos de 4 semanas de idade, obtidos de Jackson Laboratories sob uma Duque IACUC aprovados protocolo. Os ratinhos foram observados e os tumores medidos com compassos de calibre de vernier até que o volume do tumor ((V = L × 2W × 0,52 (L = maior diâmetro, W = diâmetro mais curto)) atingiu ~1,000 mm

3. Os tumores foram então colhidas, picados e re-implantado como descrito acima, até PDCCEs estáveis ​​foram estabelecidas. em cada geração, os tumores foram colhidos e quer fixadas em formalina a 10% tamponada neutra (NBF), congelados rapidamente em azoto líquido ou congelados em temperatura de corte óptima (OCT) forma em gelo seco, para posterior análise

histológica Elaboração e Exame

parafina-embedded tecidos PDCCE foram seccionados em 6 mm intervalos e corados com hematoxilina e eosina (H e).. Cada amostra . foi avaliada por um patologista treinado para os seguintes critérios histológicos: tipo histológico, CDX-2 positivo, e percentagem relativa de tumor, necrose, estroma, a formação da glândula tumor e CDX-2 núcleos positivos Todos os tecidos foram examinados usando 10 alto campos movidos por núcleos de tumor seção. foram avaliados para CDX-2 coloração utilizando uma escala quantitativa padrão de 0, 1+, 2+ e 3+. Coloração de núcleos de tumor em 2+ e 3+ foi considerado positivo e todos os casos considerados positivos exibiram pelo menos 20% de núcleos de tumor com coloração.

Oncogene Análise de Mutantes

O DNA genômico foi isolado de pressão PDCCE tecidos congelados usando um kit de isolamento de ADN genómico Qiagen. As amostras foram diluídas para 10 ng /mL e a PCR foi efectuada utilizando os seguintes iniciadores para

KRAS

: directo 5 ‘GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA 3’; reverter 5 ‘GAATGGTCCTGCACCAGTAA 3’ e

BRAF

: forward 5 ‘TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA 3’; reverter 5 ‘GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA 3’. Amplicões foram sequenciadas por métodos convencionais, utilizando os iniciadores para a frente.

Microarray Analysis

O ARN foi isolado a partir de tecidos PDCCE congelados instantaneamente usando um kit Qiagen de ARN /ADN Allprep, convertido em cDNA e rotuladas por um IVT ciclo. FPI marcado ADNc foram preparados de acordo com as instruções do fabricante, e os alvos hibridado com a 2.0 GeneChip U133A humano e lidas num leitor de matriz Affymetrix. Os dados em bruto foi convertido para. arquivos CEL e RMA normalizada. arquivos CEL (GSE35144) estão disponíveis no repositório de dados Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Para verificar a existência de outliers da amostra e efeitos em lote, foi realizada 3D análise de componentes principais da expressão gênica global. efeitos de lote foram normalizados utilizando o algoritmo de combate (https://jlab.byu.edu/ComBat/) [18]. agrupamento hierárquico não supervisionada dos tumores humanos e PDCCEs correspondentes foi realizada em 20% dos genes com maior coeficiente de variação. clusters de aglomerativos foram gerados utilizando o coeficiente de correlação de Pearson e ligação completa utilizando o programa R (A Fundação R para Statistical Computing).

software utilizado para análise

O pacote de software estatístico R está disponível em www .R-project.org. O pacote Bioconductor R está disponível ao www.bioconductor.org. O combate é disponível como um script R na https://jlab.byu.edu/ComBat/. Graphpad Prism é um produto da Graphpad Software (La Jolla, CA, EUA) e está disponível em www.graphpad.com/prism/prism.htm.

Resultados

histológica Avaliação de PDCCEs

Um painel de 27 explantes de cancro colorectal derivado do paciente (PDCCEs) por transplante direto de câncer colorretal humano (CRC) tecidos em ratinhos NOD-SCID foi criado neste estudo. A Tabela 1 mostra a origem do tumor do paciente e um total de 5 PDCCEs primários e metastáticos PDCCEs 22 foram gerados. Para avaliar a extensão em que

in vivo

modelos de derivados de pacientes colorectal explantes de cancro (PDCEEs) recapitulam com precisão e pode, portanto, servir de modelo da condição humana, nós investigamos se PDCCEs mantêm as características biológicas fundamentais inerentes à pessoa cancros colo-rectais humanos (CRC) ao longo do tempo. Em primeiro lugar, para avaliar a medida em que os parâmetros histológicos são mantidas após xeno-transplante, dois PDCCEs independentes foram passadas através de 10 gerações e avaliado histologicamente. Ambos os PDCCEs examinados exibiu características patológicas notavelmente consistentes com o tumor do paciente original através de 11 gerações (Figura 1). Em seguida, uma avaliação histológica abrangente realizada num sub-painel de 15 PDCCEs combinados e tecidos originais inclinadas revelou que 15/15 mantida PDCCEs características patológicas semelhantes aos observados no tumor humano combinado e foram caracterizados como histologicamente idêntica à sua correspondência original é depositado amostra (Mesa 2). Mesmo após 11 gerações, PDCCEs reteve a capacidade de formar e continha glândulas CDX-2 núcleos positivos comparáveis ​​aos PDCCEs primeira geração (Figura 2). Estes dados demonstram que as características histológicas presentes no cancro colo-rectal, incluindo a formação de glândulas e na presença de componentes do estroma são mantidas mesmo em explantes de passagem final, sugerindo que, ao contrário xenoenxertos derivado da linha de células de CRC, o modelo PDCCE fornece-nos uma ferramenta de pesquisa que recapitula a condição humana em geral, não observado em outros modelos.

PDCCEs Reter Gene global básico Expressão Perfis Inerente ao câncer colorretal humano

em seguida, para avaliar melhor a extensão em que PDCCEs representam os seus homólogos humanos primários , analisamos 27 tumores de pacientes pareados e PDCCEs por análise de microarray. dados de expressão de tumor do paciente e de genes PDCCE foi normalizado primeiro usando combate para minimizar os efeitos de lote. análise de agrupamento hierárquico não supervisionado foi então executada no conjunto de dados normalizado e revelou três grupos distintos (Figura 3). Dos 27 correspondida tumor e PDCCEs paciente, 22 pares (81%) caiu dentro do mesmo cluster baseado no dendrograma e 18 PDCCEs (66%) em cluster diretamente com a amostra de tumor original. Em conjunto, esses dados sugerem que os padrões básicos de expressão genética globais são preservados entre PDCCEs e os seus homólogos humanos originais.

Oncogene Mutation Status é mantido na PDCCEs

Para pacientes com câncer colorretal avançado, o teste do estado de mutação de oncogenes, tais como

KRAS

é necessária para guiar a terapia. Especificamente, os pacientes com

KRAS

mutações mostrar nenhum benefício do tratamento com inibidores do EGFR, tais como cetuximab ou panitumumab, enquanto os pacientes cujos tumores são

KRAS

WT beneficiar das terapias anti-EGFR base [19] , [20]. Para determinar se esses parâmetros genômicas clinicamente significativas são mantidos em PDCCEs, 27 PDCCEs combinados e amostras originais de pacientes foram analisadas para

KRAS Comprar e

BRAF

estado de mutação. Dos 27 pares combinados avaliados, 13 apresentaram com a ativação

KRAS

mutações (códon 12 = 11; Codon 13 = 2) (Tabela 3). Destes 27 pares combinados, 26/27 PDCCEs (96%) correspondeu a sua contraparte humana original sugerindo que os tecidos de cancro colorrectal humanas mantidas como PDCCEs rato são geneticamente estáveis ​​e conservar o estatuto mutação oncogénica fundamental para CRC fisiopatologia. Todas as amostras apresentaram resultados negativos para

BRAF

mutações. No seu conjunto, estes dados sugerem que PDCCEs manter as histológico, a expressão genética e com base em características de mutação biologicamente complexas observadas em humanos CRCs.

Discussão

Até à data, um número de modelos de xenotransplante de rato foram estabelecidas para investigar CRC etiologia e tratamento. Em grande medida, estes modelos têm sido gerado utilizando linhas celulares derivadas de passagem tardia CRCs humanos e enquanto as respostas tumorais induzidas pelo tratamento significativos foram observados nestes modelos, eles raramente são preditivos da resposta do tumor em doentes humanos [7]. Isto é provavelmente devido nestes modelos, pelo menos em parte, à falta inerente de estroma em linhas de células epiteliais derivadas de tumor. Evidências crescentes indicam que a sinalização parácrina e componentes da matriz extracelular fornecidos pelas células do estroma vizinhos desempenham um papel importante no potencial oncogénico do carcinoma colo-rectal e que a modulação destas interacções do estroma ter impacto directamente a eficácia da quimioterapia em resposta tumoral [9], [10].

recentes tentativas têm sido feitas para gerar modelos de murganho de xenoenxerto de CCR por transplante directo de tumores de cólon humano em ratinhos imunocomprometidos [14] – [16], [21]. Poupon e colegas de trabalho relataram que a passagem de tecidos de câncer de cólon humano por uma fase de xenotransplante melhora significativamente a taxa de sucesso da linha de células de derivação a partir de metástases CRC humanos [15]. Mais recentemente, Hohenadl e colaboradores relataram que as características histológicas e os níveis de expressão de oncogenes são retidos no início de passagem xenoenxertos CRC [21] enquanto Fichtner et ai., E Messersmith et al, painéis utilizados de 15- e 10 explantes CRC humanos, respectivamente, para avaliar a sensibilidade ao fármaco [14], [16]. Além disso, esses estudos utilizaram explantes derivados de pacientes, principalmente a partir do site principal e, como tumores metastáticos tendem a ser mais agressivos e são mais propensos a diferenciar, ainda não está claro se PDCCEs gerados a partir de sítios metastáticos manteria semelhança com o tumor original. Embora esses estudos começaram a destacar o valor dos modelos de explantes em pesquisa CRC, uma análise histológica e molecular mais abrangente em um painel maior de explantes CRC humanos são necessários para justificar a sua utilização como um modelo pré-clínico para realizar análise de eficácia da droga precisa e biomarcador preditivo identificação.

neste estudo, demonstrámos que PDCCEs gerados a partir de adenocarcinomas humanos com diferentes características histológicas cada reter os parâmetros do tumor a partir do qual eles foram derivados no histológica, expressão de ARN global e níveis de mutação de oncogenes. Apesar da existência de diferenças no percentual de estroma tumoral presente entre os tecidos humanos originais e aqueles xenoenxerto em ratos, o nosso estudo centra-se nas células epiteliais malignos. Em primeiro lugar, a arquitectura histológica inerente ao adenocarcinoma colorrectal, principalmente a capacidade de formar glândulas displásicas, bem como a presença de dois núcleos CDX-positiva é mantida em todo o PDCCEs múltiplas passagens ( 10). Em seguida, compararam-se os perfis de expressão de gene entre PDCCEs correspondente e seu correspondente tumor paciente e observou-se que 18/27 (66%) das amostras directamente agrupados em conjunto e 22/27 (81%) agrupadas dentro do grande aglomerado como definido pelo dendrograma .

Nós especulamos que as 9 amostras PDCCE que não se aglomeram diretamente com seu tumor original correspondente pode ter sido devido à natureza heterogénea inerente do CRC. É plausível que as amostras de tumor CRC originais correspondentes a estes 9 PDCCEs abrigava pequenos sub-populações de rolamento eventos oncogênicos adicionais. Isto, por sua vez conferem uma vantagem de crescimento para estas populações depois de ter sido transplantado para o rato, fazendo com que o PDCCE ter uma composição genética diferente do tecido original a partir da qual foi derivada. Em apoio a esta noção, parece que a maior parte da variação entre o tumor primário e a sua PDCCE ocorrer em passagens precoces PDCCE e que uma menor variação ocorre por meio do processo de passagem em. Por exemplo, PDCCE CRC105 agrupado com a amostra original do doente em PDCCE passagens 1 e 11, enquanto PDCCE CRC149 não cluster com sua amostra original em uma ou outra passagem 1 ou 5 sugerindo que mudanças genéticas ocorrem predominantemente nas primeiras passagens e são mantidos através de passagens posteriores. É também possível, que nestas amostras 9, pode ter havido uma maior contaminação do estroma, resultando em uma diferença no seu padrão de agrupamento. Estes resultados sugerem que existem de facto diferenças intrínsecas entre o tumor do paciente correspondente e PDCCE e extrapolações retiradas destes modelos devem ser feito com cuidado. No entanto, em geral, os nossos resultados sugerem que o modelo PDCCE tem o potencial de ser utilizado na investigação de novos agentes terapêuticos que têm como alvo tanto a arquitectura maligno epitelial do tumor e /ou componente do estroma e que PDCCEs pode ser mantida por 10 ou mais gerações, mantendo tecla histológicos parâmetros.

Finalmente, avaliou-se a

KRAS Comprar e

BRAF

estado de mutação dos PDCCEs e mostrou que o status de todos, mas uma das mutações de oncogenes foi mantida. Observou-se um caso (CRC020) em que um

KRAS

activação mutação estava presente no PDCCE mas não foi detectada nas amostras originais de doentes apesar do facto de essas amostras agrupados por análise de agrupamento sem supervisão. É mais provável que uma população pequena, não detectável de

KRAS

células mutantes estava presente no tumor pacientes na altura da ressecção cirúrgica, e que o crescimento vantagem conferida pela

KRAS

activação permitiu subsequente expansão do

KRAS

células mutantes durante passagens PDCCE início.

Embora nenhum modelo único rato nunca vai recapitular totalmente descobertas reais em pacientes, o uso de modelos pré-clínicos é necessário e prático para o desenvolvimento de terapêutica agentes e biomarcadores e um primeiro passo fundamental em trazer esses agentes para a clínica. Nós percebemos as limitações de nosso modelo e que qualquer conclusão deve passar por testes rigorosos para avaliar sua precisão, confiabilidade e reprodutibilidade e também deve ser retrospectivamente validados em múltiplas amostras. No entanto, sentimos que o nosso modelo pré-clínico do mouse tem o potencial de ser usado para identificar e testar novas combinações de agentes terapêuticos e também para desenvolver ambos os biomarcadores preditivos e prognósticos, que podem então ser sistematicamente levadas ao ambiente clínico.

Agradecimentos

os autores gostariam de agradecer a instalação de núcleo de microarray Duke para a coleta dos dados de microarranjos.