Abstract

Fundo

O objetivo deste estudo foi comprovar a viabilidade de uma plataforma longmer oligonucleotídeo microarray ao perfil alterações no número de cópias do gene em linhas celulares de cancro da próstata e para indicar rapidamente novela candidato genes, que podem desempenhar um papel na carcinogênese.

Métodos /resultados e achados

Genome-wide triagem para regiões de ganhos genéticos e perdas em linhas celulares de cancro da próstata nove (PC3, DU145, LNCaP , CWR22 e sublinhas derivados) foi realizada usando hibridização genômica comparativa em um microarray oligonucleotídeo 35.000 recurso (arrayCGH). Em comparação com cromossômica convencional CGH, mais deleções e pequenas regiões de ganhos, particularmente em regiões pericentroméricas e regiões próximas aos telômeros, foram detectados. Como validação da alta-resolução de arrayCGH analisamos ainda um pequeno fragmento amplificado de 1,7 MB em 9p13.3, que foi encontrado em CWR22 e CWR22-RV1. Aumento do número de cópia foi confirmada por fluorescência

in situ

hibridação usando o RP11-165H19 clone BAC da região amplificada compreendendo os dois genes interleucina 11 receptor alfa (

IL11-RA

) e dinactina 3 (

DCTN3

). Usando quantitativa PCR em tempo real (qPCR), poderíamos demonstrar que

IL11-RA

é o gene com o maior ganho de número de cópias nas linhas celulares em comparação com

DCTN3

sugerindo

IL11-RA

a ser alvo de amplificação. Triagem de 20 carcinomas da próstata primários por qPCR revelou um

IL11-RA

cópia ganho número em 75% dos tumores analisados. Ganho de

DCTN3

só foi encontrada em dois casos, juntamente com um ganho de

IL11-RA

.

Conclusões /Significado

arrayCGH utilizando microarrays de oligonucleotídeos longmer é viável para a análise de alta resolução de desequilíbrios chomosomal. Caracterização de uma pequena região ganhou em 9p13.3 em linhas celulares de cancro da próstata e amostras de câncer de próstata primários por fluorescência

in situ

hibridação e quantitativa PCR revelou interleucina gene da alfa 11 receptor como um alvo candidato da amplificação com uma amplificação frequência de 75% em carcinomas da próstata. amplificação frequente de

IL11-RA

no câncer de próstata é um mecanismo potencial da

IL11-RA

superexpressão nesse tipo de tumor

Citation:. Kamradt J, Jung V, Wahrheit K, L Tolosi, Rahnenfuehrer J, Schilling M, et al. (2007) Detecção de Novos amplicons em cancro da próstata por Comprehensive Genomic Profiling de linhas celulares de cancro da próstata Usando arrayCGH Oligonucle�ido-base. PLoS ONE 2 (8): e769. doi: 10.1371 /journal.pone.0000769

Editor do Acadêmico: Stefan Maas, da Universidade Lehigh, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de julho de 2007; Aceito: 18 de julho de 2007; Publicação: 22 de agosto de 2007

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. Deutsche Forschungsgemeinschaft, conceda número KA1793 /1-1, Bundesministerium für Bildung und Forschung, conceda número 01GR0453, Rede BioSapiens de Excelência , número do contrato UE LSHG-CT-2003-503265

competir interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As alterações genéticas são acreditados para ser a chave eventos no desenvolvimento da maioria dos tumores, incluindo cancro da próstata [1]. a progressão do tumor parece depender a aquisição sucessiva de aberrações cromossómicas que levam a ganhos ou perdas de parte do genoma da célula tumoral. Caracterização dessas anormalidades genómicas no câncer de próstata pode, portanto, ajudar a compreender a patogênese molecular e pode revelar marcadores genéticos de progressão.

Desde a sua primeira descrição por Kallioniemi et al. (1992) [2] cromossômica hibridização genômica comparativa (cCGH) tornou-se a técnica mais frequentemente utilizada para detectar ADN número de cópias mudanças no genoma do tumor. Nós e outros autores analisaram o genoma de linhas celulares de cancro da próstata e amostras de cancro da próstata primário com esta técnica [3] – [5]. Fluorescência

in situ

hibridização de DNA (FISH) e quantitativa PCR em tempo real têm sido demonstrado ser ferramentas valiosas para a descoberta do gene-alvo dentro de regiões cromossômicas identificadas de ganho, por exemplo,

/gene TLOC1 sec62 Restaurant at 3q26.2 no câncer de próstata [6]. Aplicação de modelos de bioinformática avançadas em dados cCGH demonstrado que os padrões de aberrações cromossómicas conter informações valiosas prognóstico de um tumor [7].

Por causa da resolução relativamente baixa espacial (~20MB) de cCGH e sua imprecisão na centromérico como bem como regiões teloméricas esta técnica não é nem capaz de detectar adequadamente pequenas regiões do ganha ou perde, nem alterações genômicas próximos ao centrômero ou telômero. Além disso, para a identificação do gene alvo em regiões ganharam como encontrado por cCGH, fine-mapeamento com técnicas como FISH é trabalhoso e demorado.

Em comparação com cCGH,-microarray baseado CGH, referido como matriz CGH (aCGH ) ou matriz CGH [8] – [9], tem cerca de 1.000 vezes mais elevada resolução (ou mesmo superior) e permite a análise de regiões cromossómicas perto do centrómero e dos telómeros. Diferentes abordagens de aCGH foram seguidos ao longo dos anos. Vários grupos utilizaram matrizes BAC genômicas [10], enquanto outros optaram arranjos de cDNA ou de oligonucleotídeos que foram originalmente concebidos para análise de expressão [9], [11]. Matrizes concebidos para a expressão do gene são vantajosos para a comparação directa das alterações genómicas e de expressão do gene na mesma plataforma. Vários estudos têm demonstrado que esta abordagem mostra uma associação significativa entre o número de cópias do gene e nível de expressão [12], [13]. Ultimamente, a utilização de séries de oligonucleótidos especificamente concebidas para aCGH já foi relatada [14] e é agora comercialmente disponível como uma plataforma aCGH. Para o aCGH análises de linhas de células de câncer de próstata, bem como amostras clínicas quer BAC ou cDNA matrizes têm sido utilizados [12], [13], [15] – [20].

Aqui nós apresentamos o primeiro estudo 35000 utilizando um recurso de matriz de oligonucleótido 70-mer, concebidos originalmente para análise de expressão, para caracterização detalhada genómico de linhas celulares de cancro da próstata nove. Resultantes perfis aCGH são comparados com resultados cCGH. A ocorrência de um pequeno fragmento amplificado recém-detectado na sub-banda pericentromérica 9p13.3 em várias linhas celulares é validado por FISH e PCR quantitativo em tempo real e também é confirmado em amostras de câncer de próstata primários.

Material e Métodos

linhas de células tumorais e o isolamento do DNA

O linhas celulares de cancro da próstata humano DU145, PC3, LNCaP, CWR22 e CWR22-RV1 foram obtidos a partir de cultura celular Colecção American Type (ATCC, Rockville, MD, EUA) e cultivadas de acordo com os protocolos recomendados pelo ATCC. De PC3 e DU145, dois ramos diferentes estavam disponíveis, uma realizada no laboratório do Poder Genética do Câncer, NHGRI, NIH (PC3

NIH

, DU145

NIH

) , o outro no laboratório urológica em Homburg (PC3

HOM

, DU145

HOM

). PC3-N, PC-125-1L, e DU145-MN1 foram estabelecidas como previamente descrito [21], [22]. LNCaP-CN4-2 foi gentilmente cedido por Z. Culig, Departamento de Urologia, Medical University, Innsbruck, Áustria.

próstata primário amostras de câncer

cópia do gene quantitativas medições numéricas foram realizadas em 20 de primária amostras de adenocarcinoma de próstata, que foram obtidos após a prostatectomia radical de pacientes com cancro da próstata não tratados previamente. Seguindo prostatectomia, os espécimes foram dissecados por um patologista, congelado rapidamente e armazenado a -80 ° C. Somente as amostras que contêm . Células tumorais 50% foram incluídos no estudo

isolamento de ADN e quantificação

ADN foi isolado utilizando o kit de isolamento de ADN QiAmp (Qiagen, Hilden, Alemanha) e subsequentemente quantificados através de um ensaio f luorimétrico (Quant-iT Pico verde dsDNA Kit, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). A fluorescência foi medida utilizando um leitor de microplacas de fluorescência SpectrafluorPLUS TECAN (Salzburg, Áustria) com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 535 nm. As concentrações de DNA foram calculados a partir de uma curva padrão de ADN de cadeia dupla de controle fornecido com o kit, que foi medida em triplicado, nas concentrações de 30, 3, 0,3 e 0,03 ng /mL (medido por fluorometria).

Total amplificação do genoma e purificação

Um volume de 2,5 ul de 4 ng /ul de diluições a partir de linhas de células e controlo de ADN foi utilizada como material de partida para a amplificação. O phi29-amplificação foi levada a cabo de acordo com as instruções do fabricante do kit da Repli-G (Qiagen), utilizando um tempo de incubação de 16 h. reações repli-G foram verificados por um intra baseada em tempo real

Alu-PCR

ensaio. Além disso concentração de ADN foi fluorimétricamente quantificado com Quant-iT Pico Verde dsDNA Kit (Invitrogen), variando entre 10-30 mg.

Alu-PCR ensaio

Devido a uma síntese de fundo frequentemente observada no repli-G amplificado no-modelo de controle, foi realizado um controle de qualidade extra em 1 ml (diluição 1:50) do DNA amplificado-phi29 não purificada. Um

Alu

banda específica deve estar presente em todas as amostras Repli-G amplificados e ausente nos Repli-G amplificado no-modelo de controle. Cada 2 ul de amostra foi comparado com diluições em série de 1 ul de ADN de controlo macho (Promega, WI, EUA) (10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,01, 0,001 ng /ul). Os 25 reações ul continha 1 × Hot início SYBR master mix verde (Qiagen), MgCl 1,5 mM

2, 0,2 Mix dNTPs mM, 400 primers nM cada (

Alu

-forw: 5′-GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT- 3 ‘e

Alu

-Rev: 5′-ATTCAAAGGGTATCTGGGC TCTGG-3′). As condições dos ciclos foram como se segue: 1 min a 94 ° C; 35 ciclos de 20 s a 94 ° C, 20 s a 55 ° C e 20 s a 72 ° C; 10 min a 72 ° C. Os produtos de amplificação foram verificadas por análise da curva de fusão usando o software do LightCycler quantificação ™ 3,5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) e electroforese em gel. A amplificação foi considerado bem sucedido, quando a quantidade de humano

Alu

sequências em fragmentos de ADN gerados phi29 variou de 10-30% e quando uma mancha de fragmentos de ADN, que varia de 1 a 20 kb, foi visíveis por electroforese em gel.

arrayCGH

10 ug de ADN amplificados e purificados foram marcadas utilizando o kit de matriz BioPrime CGH genómico Rotulagem (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante, num volume de 50 ul com uma mistura de dNTP modificados contendo 120 ? M de cada dATP, dGTP, dCTP e; 60 uM de dTTP; e 60 uM Cy5 ou Cy3-dUTP-dUTP. ADN marcado foi purificado usando colunas de purificação de PCR QIAquick (Qiagen). E tumor de referência ADN foram reunidas, misturou-se com 50 ug de ADN Cot-1 (Invitrogen) e concentrou-se até um volume de 20 ul numa centrífuga de vácuo. O DNA foi então misturado com uma quantidade igual de 2 × tampão de formamida, desnaturadas a 95 ° C durante 5 min e pré-incubadas a 37 ° C durante 30 min num banho-maria.

As hibridações foram realizadas em personalizado (impresso na os slides Facility) de vidro NHGRI /NIH Microarray núcleo contendo o 70mer oligonucleotídeo Operon versão 3 ajustado com 34.580 oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos foram originalmente concebidos para análise de expressão. Para arrayCGH todos os oligonucleotídeos foram sequência alinhada contra o genoma humano (build 34), ENSEMBL, RefSeq, dbEST e UCSC genes conhecidos, resultando em 29.383 oligonucleotídeos com um mapeamento cromossômico específico.

amostras de DNA foram hibridizados para a matriz para 16 -18 horas a 42 ° C utilizando o MAUI sistema de hibridação 4-bay e MAUI Mixer A0 (sistema BioMicro, Salt Lake City, UT, EUA). Depois de matrizes de hibridação e Maui misturador foram desmontados em 42 ° C 1 x SSC e SDS a 0,05% (solução de lavagem 1) e subsequentemente lavadas duas vezes em solução de lavagem de 1 durante 5 minutos, seguido por duas lavagens em 0,1 x SSC (solução de lavagem 2) para 5 minutos. lâminas de matriz secas foram digitalizados utilizando um scanner de microarray ScanLite Express (Perkin Elmer, Wellesley, MA, EUA). arquivos de imagem RAW de matrizes foram processadas utilizando o software DeArray [23] e resultando dados de imagem foram importados para o ambiente: R usando pacotes Bioconductor [24] para uma análise mais aprofundada.

O processamento de dados e análise estatística de dados microarray

A análise estatística para identificação de regiões cromossômicas com números cópia alterada em matrizes individuais consistiu em duas etapas. Em primeiro lugar, depois de mapear os log-rácios número de cópias do gene medidos a seus respectivos locais de cromossomos, alisando foi aplicado. Os pesos adaptativos algoritmo GLAD suavização baseado em [25] para identificar regiões do número de cópias constante foi usada. Este algoritmo se encaixa uma função constante por partes ao longo do cromossomo para o log-ratios. Então, para foram identificados a cada regiões de amostra que são amplificados ou excluídos. Aqui, distribuições normais foram ajustados de forma robusta para o log-ratios suavizados de cada matriz. Em particular, a mediana e o intervalo interquartil foram calculados, e uma distribuição normal foram ajustados a estes parâmetros. Finalmente, as regiões constantes com valores acima ou abaixo do pontos de corte especificadas foram detectados como regiões de ganhos ou perdidos, respectivamente. A fim de discriminar entre sinais fortes e fracos, a mediana mais ou menos um ou dois desvios padrão foram seleccionados como pontos de corte para aberrações fortes e fracos, respectivamente. Os algoritmos foram implementados na linguagem de programação R (www.r-project.org). Os resultados foram obtidos utilizando R versão 2.3 ea biblioteca GLAD fornecido pelo projeto Bioconductor (www.bioconductor.org), versão 1.7.

cromossômica CGH

A hibridação foi feito como descrito anteriormente com menor modificações [26]. 500 ng biotina ADN sonda marcada, 500 ng digoxigenina marcado com ADN de referência (ADN de referência humano do sexo masculino, Promega, WI, EUA) e 50 ug berço-DNA não marcado humano (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) foram precipitados com acetato de sódio 0,3 M em a 2,5 vezes o volume de etanol e dissolveu-se em 2,5 ul de formamida desionizada. Após 30 minutos, foram adicionados os 2,5 ml da mistura de hibridação dupla (tampão de 100 mM de fosfato de sódio, 4 × SSC e 20% de sulfato de dextrano, a pH 7,0) e desnaturados durante 5 minutos a 75 ° C seguido de 15 min preannealing a 37 ° C. A hibridação foi efectuada sob lamelas seladas durante 3 dias a 37 ° C numa câmara húmida. Após a hibridação, as lâminas foram lavadas três vezes durante 5 minutos em uma solução de lavagem (50% de formamida em 2 x SSC, pH 7,0) a 45 ° C, duas vezes em 2 x SSC (pH 7,0) a 45 ° C, e uma vez em 0,1 x SSC (pH 7,0) a 45 ° C.

ADN sonda biotinilada foi detectada com estreptavidina marcada com FITC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). O ADN de controlo digoxigenized foi detectada com anticorpos marcados com rodamina anti-digoxigenina (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Finalmente, as lâminas foram contrastadas, e uma solução antifade aplicado no mesmo passo (Vectashield com DAPI, Vector Laboratories).

As lâminas foram analisadas utilizando um sistema de análise de imagem digital (MetaSystems, Altlussheim, Alemanha), com base numa Olympus AX 70 microscópio equipado com uma câmera CCD refrigerado (fotométricos, Tuscon, AZ, EUA). Para analisar os dados de fluorescência diferencial foi utilizado o software MetaSystems ISIS 3. As imagens de três cores com vermelho, verde e azul foram adquiridos a partir de 15-20 metáfases. desequilíbrios de cromossomas foram detectados na base do perfil de taxa de fluorescência, se desviar do valor equilibrada (FITC: rodamina = 1). Para cada cromossoma os valores de relação finais foram preparados a partir dos valores médios de, pelo menos, dez homólogos do cromossoma de metáfase separadas. resultados CGH foram representados como uma série de verde para perfis de razão vermelhos, e a interpretação dos resultados seguiu protocolos previamente descritos [3].

Fluorescência hibridização in situ

FISH foi realizada em núcleos e metaphase os spreads da CWR22 linhas celulares e CWR22-RV1. metáfase de linfócitos de um dador saudável foram usadas como controlo. O RP11-165H19 clone BAC (9p13.3, número de acesso GenBank AQ382511) foi obtido a partir Hospital (Instituto Oakland Research, Oakland, CA, EUA) BacPac Resource Crianças do Centro e cohybridized com uma sonda específica para o centrômero do cromossomo 9 (D9Z1; Oncor, Gaithersburg, MD, EUA). As culturas de bactérias e isolamento de ADN foram realizados de acordo com o protocolo miniprep BacPac (https://www.biologia.uniba.it/rmc).

Alu-PCR

produtos do CCB foram utilizados como sondas e foram biotinilados utilizando tradução nick. fluorescência de duas cores

in situ

hibridação e detecção de sinais de fluorescência foram feitos como descrito anteriormente [6].

quantitativo em tempo real PCR

tempo real PCR quantitativa para o número de cópias do gene medida foi baseada numa abordagem recentemente descrito [27]. No presente estudo, foram utilizados ensaios SNP pré-desenhados e validados (Applied Biosystems, CA, EUA) com o sistema AB 7900 (Applied Biosystems). Para a validação do amplicão 9p13.3 dois genes dentro do fragmento amplificado (IL-11RA, AssayID: C__11340987_10 e DCTN3, AssayID: C__25472566_10) e um gene em pelo 3p24.2 localizada numa região não alterada no cancro da próstata (TOP2B, AssayID :. C__8063527_10) foram analisados ​​

num primeiro passo, todos os ensaios de SNP utilizados neste estudo foram executados em uma série de diluições de ADN de sangue normal para determinar a eficiência da PCR (E) de cada conjunto de iniciadores pela fórmula E = 10

-1 /s, onde s representa o valor absoluto da inclinação em uma trama do ciclo limiar (C

T) contra o registro da quantidade de entrada. Todos os iniciadores foram mostrados para ter uma eficiência igual de cerca de E = 2 e em parcelas de eficiência relativa comparando os diferentes primers (log do valor de entrada

vs.

Sc

T) o valor absoluto da inclinação era menos do que 0,1. número de cópias do gene relativo foi então calculada seguindo a equitação: 2

-ΔΔCT (boletim de Usuário # 2, Applied Biosystems). Para a calibração de DNA de sangue normal foi adicionado em cada série PCR. Para genes que têm ambos os alelos detectados pelo ensaio do C

T valor foi subtraído por uma base sobre a eficiência demonstrada de 2. Para determinar se os resultados obtidos por análise de PCR em tempo real das amostras de cancro da próstata eram significativamente diferentes dos obtidos para amostras de indivíduos saudáveis, determinou-se um intervalo de tolerância (TI) para os números de cópias do gene relativos, usando o desvio padrão (DP) de C

valores de T para genes alvo e de referência em 8 indivíduos saudáveis ​​de acordo com a equação: TI = 2 ± (SDΔC

T × 2). A TI variou 1,62-3,17 para

DCTN3 Comprar e 1,77-2,94 para

IL11-RA

.

Resultados

regiões recorrentes mínimas de alterações

por causa de seus genomas altamente alterados e o grande volume de dados gerados pela matriz análises, simples inspeção visual dos loci alterada se mostrou ineficiente para identificar regiões recorrentes mínimas de aberração. Para analisar o conjunto de dados, nós combinamos de identificação automática de aberração com um processo gráfico de frequência modificado. Aplicação de análise de frequência ponderada para os autossomos de linhas celulares de cancro da próstata revelou várias regiões de mudanças altamente recorrentes. Em comparação com o nosso cCGH analisa várias pequenas ampliações e unidades de eliminação só foram detectados por aCGH, especialmente em regiões pericentroméricas e regiões próximas aos telômeros (Fig. 1). O tamanho das menores regiões de aberração poderia ser determinado para 110 kb para perdas em 19q13.41 em linhas celulares DU145

NIH

, DU145-MN1, PC3 125-1L e CWR22-RV1, e 760 kb para ganhos em 14q32.11-q32.12 em PC3

HOM

, PC3-N e PC3-125-1L. A maioria das aberrações cromossómicas detectadas por cCGH também foram vistos em aCGH. No entanto, mais perdas foram detectados com microarrays e mais grandes regiões de ganhos com a técnica de metáfase. Para as regiões comumente detectados de aberrações, nenhuma discrepância entre os dois métodos na atribuição de ganhos ou perdas para a região indivíduo foi observado (tabela 1).

Uma pequena região de ganho em 9p perto do centrómero (B, ponta de seta) e uma pequena deleção em 14q (D, seta) só são detectados por arrayCGH.

constituição citogenética de diferentes ramos de linhas celulares de cancro da próstata e linha de células parental vs. comparação sublinha

os resultados aCGH das linhas de células parental PC3

HOM

, DU145

HOM

, LNCaP e CWR22 e suas sublinhas são resumidos na Figura 2. Para PC3 e DU145, dois ramos diferentes podem ser comparados (

HOM vs. NIH

). Mais surpreendentemente, a constituição citogenética de PC3

HOM

marcadamente diferente da PC3

NIH

. De um total de 54 aberrações em ambas as linhas celulares, apenas seis aberrações fortes podiam ser encontrados em comum: perdas no 1T, 8p, 10p e 13 e os ganhos em 10q e 17q. O ganho de 8q11.2-8q24.3 no PC3

HOM

também foi observada em PC3

NIH

mostrando uma variação de tamanho mínimo de 100 kb. Para DU145

HOM Comprar e DU145

NIH

, uma boa concordância global da composição genética foi encontrada.

Os números acima do terreno indicam números cromossômicos e linhas limites verticais entre cromossomos.

linhas celulares Comparando PC3

HOM

, DU145

HOM

, LNCaP e CWR22 com sua PC3 sublinhas derivado -N, PC3-125-1L, DU145-N, LNCaP-CN4-2 e CWR22-RV1, respectivamente, uma alta congruência das aberrações citogenéticas entre as linhas de células correspondentes foi proporcionado por aCGH. Vale ressaltar que, além de pequenas variações do número de regiões extra com ganhos ou perdas de diferenças de material genético entre as linhagens de células parentais e sublinhas predominantemente em causa a extensão das regiões com alterações no número de cópias correspondentes, como, por exemplo, foi observado para as regiões com ganhos em 12q e 15q no PC3

HOM vs.

PC3-N e para as regiões com perdas no 2T, 4T, 6q e 13q21.33 em LNCaP

vs

. LNCaP-CN4-2.

Validação da região pericentromérica amplificado 9p13.3 usando análise de FISH e PCR quantitativo em tempo real

A região romance 1,7 Mb com número de ganhos de cópia foi reconhecido consistentemente na célula linhas CWR22 e CWR22-RV1 e foi mapeada para a sub-banda pericentromérica 9p13.3. A presença deste fragmento amplificado no CWR22 linhas celulares e CWR22-RV1 foi confirmada por FISH metafase utilizando um clone de BAC (RP11-165H19) a partir da região amplificada e uma sonda específica para o centrómero de cromossoma 9 (Fig. 3A e B). óptimo sinal e falta de hibridação cruzada foi verificada utilizando os spreads metáfase normais (Fig. 3C). Este clone BAC continha dois genes,

IL-11RA

e

DCTN3

, que já foram pensados ​​para desempenhar um papel no crescimento do câncer de próstata [13].

Identificação do aumento cópias de sinais do clone BAC RP11-165H19 mapeados para 9p13.3 fragmento amplificado numa linha celular de CWR22 e CWR22-RV1 (a e B). sinal Optimal C e a falta de hibridação cruzada foi verificada utilizando metaphase normais espalha mostrando dois sinais para cada sonda. sinais clone RP11-165H19 BAC são verdes; sinais vermelhos indicam cromossomo 9 centrômero (D9Z1).

Com base na localização de genes e função do gene anotada, selecionamos esses dois genes candidatos para medições no número de cópias do gene nas linhas de células de câncer de próstata e 20 carcinoma da próstata primário amostras utilizando quantitativa PCR em tempo real.

IL-11RA

mostraram um aumento significativo no número de cópias do gene acima do normal em CWR22 e CWR22-RV1 e em 15 dos 20 (75%) amostras de tumores de cancro da próstata primário (Fig. 4). Para

DCTN3

, nenhum ganho do número de cópias foi detectada em qualquer linha celular e em apenas 2 das 20 amostras (10%) de tumores do cancro da próstata. O gene de controle

TOP2B Restaurant at 3p24.2 foi provado inalterado em comparação com o sangue normal (dados não mostrados).

IL-11RA

mostrou um aumento significativo no número de cópias do gene acima do normal em CWR22, CWR22-RV1, DU145

HOM Comprar e DU145-MN1 e em 15 das amostras de 20 (75%) de câncer de próstata. Para

DCTN3

, nenhum ganho número de cópias foi detectada em qualquer linha celular e em apenas 2 das amostras de 20 (10%) de câncer de próstata. Valores acima de cortar linha que está sendo atribuído como número aumentou de cópias do gene em relação ao normal.

Discussão

Apesar de linhas celulares de cancro da próstata tenham sido previamente analisados ​​por aCGH utilizando plataformas cDNA microarray [12] [13], [15] – [20], que demonstram neste estudo a viabilidade de um conjunto longmer oligonucleotídeo, originalmente projetado para análise de expressão, para um perfil genômico de alta resolução de linhas celulares de cancro da próstata nove. Os dados de microarranjos para este estudo foram submetidos a NCBI GEO com GSE7376 adesão. Em comparação com cCGH, foram detectados mais deleções e pequenas regiões de ganhos com aCGH, especialmente em regiões pericentroméricas e regiões próximas aos telômeros, onde cCGH é conhecida a entregar informações confiáveis ​​sobre os desequilíbrios de DNA. Por outro lado, grandes regiões de ganhos como revelado pelo cCGH abrangendo quase todo o braço de cromossomos foram negligenciados por aCGH. Observações semelhantes também foram relatados por Saramaki et al. (2006) [13] usando baseado no ADNc aCGH. Além de artefatos de normalização pode-se argumentar que essas diferenças podem resultar da etapa de amplificação de DNA para aCGH em nosso estudo, ao passo que o ADN não amplificado foi utilizado para cCGH. Apesar de amplificação de todo o genoma de polimerase phi29 pode adicionar um pouco de preconceito e aumentar o ruído de fundo, é considerada a abordagem mais imparcial em relação a procedimentos de amplificação de DNA baseados em PCR [28]. Como qualquer passo de amplificação de DNA parece inevitável no estudo de amostras de cancro da próstata primário, foi utilizado um passo de amplificação em nosso estudo, embora a quantidade de DNA não era um fator limitante quando se trabalha com linhas de células.

Nossas descobertas aCGH estão em boa concordância com os dados relatados na literatura para PC3, DU145, LNCaP e CWR22 [12], [13], [15] – [20]. No entanto, um aspecto colateral interessante do nosso estudo é a constatação de uma diferença citogenética marcada entre os dois ramos PC3, que foram realizados em dois laboratórios diferentes (PC3

HOM vs.

PC3

NIH

). A instabilidade genômica presumido de linhas celulares pode levar a divergência genética, o que tem que ser considerado ao comparar resultados de diferentes laboratórios on aparentemente as mesmas linhas celulares. Um sistema de gestão da qualidade, que inclui pormenores da composição genética das linhas celulares utilizadas individualmente, parece ser prudente.

Em relação à comparação de linhas celulares parentais e sublinhas, não há diferenças grosseiras na composição citogenética foram encontrados por aCGH. Diferenças predominantemente causa dos limites das regiões com alterações no número de cópias correspondente. Estas descobertas estão em contraste com os nossos estudos anteriores que demonstram cCGH várias regiões extras de DNA copiar alterações numéricas nas sublinhas em comparação com as linhas celulares parentais [4]. Uma explicação pode ser técnica, como o relatado anteriormente diferenças regiões cromossômicas grandes, principalmente envolvidos, que são detectados com uma sensibilidade inferior em comparação com aCGH cCGH, como foi discutido acima.

Como uma validação da alta resolução de aCGH , analisou-se ainda uma unidade de amplificação pequena de 1.7 MB na região do cromossoma 9 pericentromérica em 9p13.3, que foi encontrado em linhas celulares derivadas de xenoenxerto de CWR22 e CWR22-RV1 por aCGH mas não por cCGH. Curiosamente, Saramaki et ai. (2006) [13] também encontrados nesta região por aCGH para ser amplificado no xenoenxerto de cancro da próstata LuCaP35. Eles confirmaram os seus resultados por BAC-FISH e demonstrou amplificação e superexpressão do gene da conjugação de ubiquitina enzima E2R2 (

UBE2R2

), o gene dinactina 3 (

DCTN3

) ea 40A WD domínio de repetição gene (

WDR40A

) em 9p13.3. Usando uma técnica de PCR em tempo real, foi quantificado o ainda mais o número de cópia do gene da alfa do receptor da interleucina 11 (

IL-11RA

) e o gene 3 dinactina (

DCTN3

) tanto revelando a maior log2 em relação aCGH dentro 9p13.3.

IL-11RA

foi encontrado com o maior ganho cópia número na CWR22, CWR22-RV1, DU145

HOM Comprar e DU145MN1 sugerindo

IL-11RA

como o putativo gene alvo deste amplicon. Nós, portanto, selecionados 20 amostras de câncer de próstata primário e encontraram 75% dos tumores abrigando um

IL-11RA

ganho de número de cópias sozinho, nenhum dos

DCTN3

sozinho, e 10% de ambos os genes . A média de ganho de número de cópias para

IL-11RA

foi de aproximadamente 4 vezes. Estes dados enfatizam a nossa hipótese inicial de que

IL-11RA

representa o alvo de amplificação em vez de

DCTN3

. Esta hipótese é reforçada por estudos de imuno-histoquímica [29], [30] ea base de dados de perfis de câncer Oncomine ™ (www.oncomine.org) que ambos revelam alta superexpressão de

IL-11RA

no câncer de próstata em relação ao normal tecido da próstata.

IL-11RA

codifica um receptor específico para a IL-11 e pertence à família de receptores de citocinas dependentes de gp130, os quais incluem receptores para a IL-6, factor inibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, oncostatina M, e cardiotrofina [31]. Um sistema de sinalização activados por importante

IL-11RA

e outros membros desta família de receptores é o transdutor de sinal-cinase Janus e (JAK-STAT) via com STAT3 ter uma importância bem estudada na carcinogénese da próstata [activador de transcrição ,,,0],32]. Além disso, acredita-se que a STAT3 activados desempenhem um papel chave na activação do receptor de androgénio, na ausência de androgénios, uma explicação da hormona do crescimento de cancro da próstata refractário [33]. Se

IL-11RA

é causador de crescimento do câncer de próstata precisa ser investigado em estudos futuros.