Abstract
Os radioisótopos que emitem elétrons (partículas beta), tais como rádio-iodo, pode eficazmente matar células alvo , incluindo células cancerosas. Aquosa
32 P [PO
4] é um beta-emissor puro que tem sido utilizado por várias décadas para tratar doenças reumáticas humanos não malignas.
32 P [PO
4] foi comparado diretamente com um mais poderoso beta-emissor puro, o clinicamente importante
90Y isótopo.
In vitro
,
32 P [PO
4] foi mais eficaz em matar células do que foi o 90Y mais potente isótopo
(P ≤ 0,001) e também causou substancialmente mais DNA de cadeia dupla breaks que fez
90Y.
In vivo
, uma dose intravenosa de baixa dose única de
32P crescimento aquosa elemental inibiu significativamente tumor no modelo de câncer murino singeneicos (
P
≤ 0,001). Este efeito é exercida pela incorporação directa de ADN em cadeias nascentes, resultando na quebra de cadeia dupla, um mecanismo único não duplicatable por outros mais poderosos, radioisótopos de emissão de electrões.
32 P [PO
4] deve ser considerado para ensaios clínicos humanos como um potencial droga anti-câncer romance
Citation:. Cheng Y, Kiess AP, Herman JM, Pomper MG, Meltzer SJ, Abraham JM (2015) fósforo-32, uma droga clinicamente disponível, inibe o crescimento do câncer por indução de DNA de fita dupla ruptura. PLoS ONE 10 (6): e0128152. doi: 10.1371 /journal.pone.0128152
Editor do Academic: Abhijit De, ACTREC, Tata Memorial Centre, Índia |
Recebido: 19 de dezembro de 2014; Aceito: 22 de abril de 2015; Publicação: 01 de junho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Cancer Institute CA133012-01, National Institutes of Health Roteiro DK087454-01, National Cancer Institute CA146799, National Cancer Institute CA190040, e uma Kimmel Cancer Sidney centro de Projeto piloto Grant. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
As partículas beta (elétrons) emitidos por radioisótopos são conhecidos por matar de forma eficiente as células cancerosas. Esta descoberta tem já sido clinicamente explorada usando
131I para tratar o cancro da tiróide [1], uma estratégia ainda empregues com êxito em mais de 50% de tais doentes nos Estados Unidos, com mais de uma taxa de cura de 90%. Da mesma forma, os anticorpos radiomarcados emitem partículas beta dirigido contra CD20, incluindo
131I-Bexxar (tositumomab) e
90Y-Zevalin (ibritumomab tiuxetan), foram usadas contra o linfoma não-Hodgkin [2,3]. Além disso,
ligando do receptor de somatostatina marcado com 90Y é utilizada para tratar tumores neuroendócrinos [4]. Elétrons emitidos por
32P tem um nível de energia intermediária entre as de
131I eo mais poderoso
90Y, resultando num comprimento de percurso de até 5 mm de tecidos humanos [5]. Electrões emitidos a partir de radioisótopos podem atacar milhares de células. O efeito espectador resultante amplifica o potencial letal de cada partícula beta emitida em ou perto de um tumor. No entanto, como veremos a seguir, descobrimos que entre todos os isótopos emissores beta disponíveis,
32 P possui um mecanismo de quebra de cadeia dupla único quimicamente e baseada radiologicamente, o que confere maior eficácia anti-tumoral do que outros beta-emissores de potência comparável.
linhas celulares derivadas de cancro humano estabelecidos em ratinhos imunocomprometidos são uma ferramenta valiosa para testar a eficácia de agentes anti-câncer candidatos [6-9]. Nós encontramos anteriormente de que uma única dose baixa de injecção, por via intravenosa de [
32P] ATP inibe significativamente o crescimento do tumor durante várias semanas em modelos de xenoenxerto de murinos [10,11]. Uma vez que o ATP é uma pequena molécula de ocorrência natural, a sua forma marcada radioactivamente levanta algumas vantagens sobre compostos sintéticos maiores como um potencial terapêutico anti-cancro, incluindo imunogenicidade menor, uma maior penetração no tumor, e a farmacocinética superiores [12]. Inorgânica [
32P] PO
4, um ião aquosa simples, tem sido utilizado durante décadas como um agente terapêutico para a policitemia vera e trombocitemia essencial [13]. Este ião também foi anteriormente utilizado para tratamento paliativo da dor do osso devido a metástases, onde ele foi pensado para ser incorporado na matriz extracelular [14]. No entanto, aquosa
uso 32P nunca foi estabelecido como uma estratégia anti-câncer primário
per se
.
A aplicação clínica da
32P foi tentada pela primeira vez na década de 1930 [15 -18]. Desde essa altura,
Uso de 32P tem geralmente sido restringidas a uma forma de suspensão coloidal, em que
32P forma um componente de um complexo de partículas, insolúvel [19-22]. Esta forma de
32P é tipicamente injectado directamente para dentro do tumor, com a suspensão coloidal impedindo o radioisótopo de sair do alvo pretendido e disseminar por todo o corpo. A administração de aquosa
32 P como um agente anti-câncer primário não foi estudado, além de seu uso paliativo para alívio da dor devido a metástases ósseas.
achados experimentais recentes levaram ao desenvolvimento e uso do alfa e beta-emissor
223Ra para alvejar seletivamente metástases ósseas em pacientes com câncer de próstata resistente à castração [23,24]. Originalmente desenvolvido por uma empresa norueguesa ALGETA, Alpharadin foi aprovado para uso nos Estados Unidos em 2013, e agora é comercializado pela Bayer sob o nome Xofigo [25]. Assim,
223Ra é o mais recente elemento radioativo simples para se tornar um medicamento eficaz anti-cancro.
Temos agora relatam que uma única dose baixa de injeção, intravenosa de aquosas
32P resulta na rápida, significativa inibição de crescimento de tumor de crescimento pré-estabelecida num modelo murino imunocompetente (singeneicos). Mostramos também que
32 P é mais eficiente do que doses equivalentes de elétrons extracelulares de maior energia, como aqueles emitidos por
90Y, um radioisótopo emissor de beta em uso comum hoje em dia. Nós fornecemos evidências de que esta maior eficiência resulta da incorporação direta de
32P no DNA nascente, causando a quebra de dupla cadeia de DNA através de um mecanismo químico e radiológico combinado que não pode duplicado por outros radioisótopos emissores beta, tais como
131I e
90Y. Esta descoberta tem implicações imediatas para o tratamento expandido de cancros humanos primários.
Métodos
Medição da
in vitro
morte celular por
32 P e
90Y
Dois mil células da linha de células CRL2836 murídeo BALB /c ou a linha de células HeLa S3 humano foram cultivadas em meio completo numa placa de 96 poços e foram expostas no Dia 0 para 0, 1, 2,5, ou 5 uCi de
radioisótopo 90Y ou [
32P] PO
4 radioisótopo em meio completo. Depois de 24 h de incubação, o meio contendo o radioisótopo foi removido e substituído com meio completo não radioactivo (Dia 1). ensaios de WST-1 proliferação (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foram realizados nos dias 1, 2, 3, 4, ou 5 para medir diretamente o crescimento celular. Cada experiência foi realizada em triplicado. As linhas celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e utilizado no prazo de seis meses após a compra.
Avaliação de quebras de ADN de cadeia dupla
Dez mil células HeLa S3 foram semeados em lâminas de câmaras Lab-TekII (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). No dia 0, as células foram tratadas com 0 ou 3 uCi de
32P ou
90Y em meio completo. No dia 1, todos os poços foram lavados suavemente e foi adicionado meio fresco não radioactivo. No Dia 1, Dia 2, ou no dia 3, as células foram fixadas com formalina a 10% à temperatura ambiente durante 10 min, lavou-se com PBS durante dois minutos, e permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 com 10% de FBS em PBS durante 15 min . Após uma lavagem com PBS, o anticorpo H2AX primário de ratinho anti-humano em diluição 1: 1000 (Millipore, Billerica, MA) foi incubado durante 1 h à temperatura ambiente, depois lavou-se duas vezes com PBS durante 5 min. Uma diluição de 1: 400 de IgG de cabra anti-rato com Alexa Fluor (Life Technologies, Grand Island, NY), foi incubada durante 1 h à temperatura ambiente e lavada duas vezes com PBS durante 5 min. As células foram coradas com solução de Hoechst. (1: 1000)
Avaliação de marcadores
32P incorporado no ADN
Cento e cinquenta mil CRL2836 rato ou humana HeLa S3 células foram semeadas em um prazo de seis -bem placa de cultura de células e cultivada durante 24 h (definido como o dia 0). As células foram então incubadas durante a noite, quer com o
32P [PO
4], cultivadas durante 2 d em forma não radioactivo e o DNA extraído (3 dias); ou cultivadas durante 24 h, incubados com
32P [PO
4] durante 24 h, cultivados durante 24 h em meio não-radioactiva e o DNA extraído (2 dias); ou cultivados por 48 h, incubadas com
32 P [PO
4] durante 24 horas, lavada com meio completo e o ácido nucleico extraído (1 dia). O DNA foi extraído usando o DNAeasy sangue e Kit de tecido (Qiagen, Valencia, CA) e as alíquotas foram incubadas com ou sem quatro unidades de ADNase I (New England Biolabs, Ipswich, MA) durante duas horas a 37 ° C antes de as amostras foram corridas num gel de poliacrilamida a 5%, exposto a película durante a noite a 4 ° C e desenvolvido.
Ensaio de apoptose em linhas de células incubadas com
32P.
Cem mil células de rato ou CRL2836 As células HeLa S3 foram inoculadas em cada poço de placas de cultura de 6 poços e crescidas durante 24 h. As células foram então incubadas com 0, 2,5, 5, 10 ou 20 uCi
32P [PO
4] em dois ml de meio completo durante 24 h, e meio não-radioactivos para adicionado um adicional de 24 h. A proteína foi extractada a partir de cada cavidade utilizando tampão RIBA (Cell Signaling Technology, Boston, MA), a proteína foi quantificada utilizando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL) e quantidades iguais foram corridos num gel de poliacrilamida a 10 a 20% , e transferidos para nitrocelulose. Uma transferência de Western utilizando um anticorpo primário a proteína clivada da caspase-3 (Cell Signaling Technology, Boston, MA) foi utilizado para ensaiar a apoptose. Um segundo western blot com quantidades idênticas de proteína foi sondada com anticorpo contra a beta-actina (Cell Signaling Technology, Boston, MA).
Estabelecimento de tumores de ratinho
singeneicos BALB /c foram estabelecidos tumores de ratinho através da injecção de 2 x 10
6 BALB tumor /c células CRL2836 (Type Culture celular americana, Manassas, VA) em um volume de 0,2 mL (50% de Matrigel, 50% 1 X PBS) por via subcutânea na parte posterior esquerdo e traseiro direito flanco. Todos os ratos eram do sexo feminino, 10 semanas de idade, e comprado de Charles River Laboratories (Wilmington, MA).
32 P-Mediated crescimento do tumor inibição
Depois de dez dias, durante os quais os tumores tornaram-se bem vascularizado bem estabelecida, uma injecção de 5 uCi de forma monofosfato de
32P (Perkin-Elmer, Cat. # NEX06000, Waltham, MA) foi injectado por via intravenosa
através da veia da cauda em 0,1 ml de 1 X HBSS. Seis tumores (três animais) foram estudadas por cada grupo. Após a injecção, o crescimento do tumor foi medida três vezes por semana com um paquímetro, e o volume foi determinado utilizando a fórmula: volume = ½ (largura)
2 X (comprimento). Os ratos foram mantidos no Centro Johns Hopkins University, em conformidade com as normas de Animais de Laboratório da Comissão de Recursos sob a supervisão e aprovação do Comitê Animal Care e Use a Johns Hopkins University Institucional (IACUC).
A análise estatística
os dados da proliferação celular WST-1 foram apresentados como média ± desvio padrão e a significância foi determinada utilizando
t
teste de Student não pareado. Os volumes tumorais dos ratos não tratados e tratados foram apresentados como média ± SE; não há valores extremos foram excluídos por qualquer motivo. A significância foi determinada utilizando
t
teste de Student não pareado.
Resultados
As células expostas a [
32P] PO
4 foram comparados com aqueles expostos a idênticas contagens por minuto do mais poderoso emissor beta-partícula,
90Y, após o que foram realizados ensaios de proliferação de células WST-1 (Fig 1). linhas celulares diferentes foram esperado para demonstrar diferentes níveis de susceptibilidade de radioisótopos. A dose de 1 uCi mostrou que as células HeLa foram menos susceptíveis à isótopos emissores beta de células foram CRL2836 ratinho BALB /c, que se originaram como um osteossarcoma foram isolados e depois de ter metastizado para o pulmão. Tanto a 2,5 uCi e 5 doses uCi demonstrado resultados semelhantes em ambas as linhas celulares. Embora
90Y que era esperado para ser mais letal do que
32 P (com base em seus elétrons de alta energia),
32P células mortas de forma mais eficiente do que
90Y. Em comparações do 2,5 uCi e 5 doses uCi, [
32P] PO
4 produziu taxas de sobrevivência no dia 5 que eram apenas metade das produzidas pelas
90Y.
O WST- 1 ensaio de proliferação foi feito para determinar o nível de morte celular por
32P, ou por
90Y. BALB /c CRL2836 células de tumor ou células HeLa S3 foram expostas a 0 Ci, 1 uCi, 2,5 uCi, ou 5 uCi em meio completo. Após 24 horas, o meio foi mudado e as células foram cultivadas em meio completo não-radioactivos. WST-1 Os ensaios de proliferação celular foram realizadas nos dias 1, 2, 3, 4, e 5, em triplicado. A média é mostrada mais /menos o desvio padrão. Frente e verso t-teste do estudante determinou o
P
valor mostrado.
Os ensaios H2AX foram usados para comparar quebra do ADN de cadeia dupla em células incubadas com
32 P
vs
.
90Y (Fig 2) [26,27]. Este ensaio detecta com precisão a ruptura em ambas as cadeias de ADN no mesmo locus genómico. coloração nuclear de células HeLa S3 demonstrado, dependente do tempo quebra DNA dupla vertente substancial nas células expostas a
32 P, enquanto que aqueles expostos a níveis idênticos de
radiação com base em 90Y teve muito menos ou nenhum DNA detectável dupla vertente ruptura. A digestão com DNase I mostrou que administrado
32 P tinha sido diretamente incorporado no ADN celular (Fig 3A). Mais de metade do
32P retido pelas células que foram incubadas com
32P [PO
4] durante 24 h e, em seguida, cultivadas em meio não-radioactiva durante 48 h antes de o ADN foi extraído tinha sido permanentemente incorporado no ADN celular. Para determinar se a morte celular envolve a apoptose bem como a necrose, células de rato CRL2836 ou células HeLa S3 foram incubadas com quantidades variadas de
32P durante 24 horas, substituídos com meio não-radioactiva durante um período adicional de 24 horas, e as células analisadas pela western blot quanto à presença de apoptose clivada da caspase-3 que indica (Fig 3B). As células CRL2836 claramente demonstrado que a apoptose estava envolvido na morte celular, enquanto que as células HeLa S3 não mostrou detectáveis caspase-3 clivada (dados não mostrados). Anticorpo dirigido contra o beta-actina foi utilizada para verificar o carregamento igual de quantidades de proteína nos poços do gel. As células HeLa S3 expressar de E6 de HPV 18 e são tornados nulos p53, que inibe severamente funções de apoptose [28,29].
células HeLa S3 ou ratinho BALB /c CRL2836 células foram cultivadas em múltiplas secções de lâminas de câmara e expostos a 0 uCi ou 3 Ci de [
32P] PO
4 ou
90Y em meio completo no dia 0. Após 24 horas, o meio foi mudado e as células foram cultivadas em meio completo não-radioactivos. No Dia 1, 2, ou 3 a presença de quebras de DNA de cadeia dupla nas células foi determinada através da marcação de histonas H2-AX fosforilados que indicam danos dupla vertente DNA.
A.
32 P é diretamente incorporado no ADN celular. Rato CRL2836 ou linhas de células HeLa S3 humanas foram incubadas durante a noite com
32P [PO
4] e em seguida cultivadas durante 48 h em meio não-radioactivos (pistas 1 a 4), ou cultivadas durante 24 h em não radioactivo médio, cultivadas por 24 h com
32P [pedido
4], e, em seguida, cultivadas por 24 h em meio não-radioativo (pistas 5 a 8), ou cultivados por 48 h em meio não-radioativo, então, cresceu por 24 h com
32 P [PO
4] (pistas 9 a 12). Os ácidos nucleicos extraídos foram incubadas com DNase I, os produtos de digestão foram separados num gel de poliacrilamida a 5% e expostos a filme. B. A apoptose induzida por
32 P em células de rato CRL2836. células de ratinho CRL2836 foram incubadas com 0, 2,5, 5, 10 ou 20 uCi
32P [PO
4] durante 24 h, e meio não-radioactivos para adicionado um adicional de 24 h. A proteína foi extractada a partir de cada cavidade e analisados para a apoptose por transferência de Western utilizando anticorpo a proteína clivada da caspase-3 (pistas 1 a 5). Anticorpo contra o beta-actina foi utilizada para verificar a quantidades iguais de proteína foram carregadas (pistas 6 a 10).
Anteriormente, demonstrou uma inibição significativa de HeLa S3 tumores de xenoenxerto de células em ratinhos nus por um único baixo -dose intravenosa (IV) A injecção de [
32 P] ATP. Aqui, escolhemos camundongos BALB /c singeneicos immunocomponent recapitular mais de perto malignidade humana. Uma única injecção IV de aquosa [
32P] PO
4 o crescimento do tumor singénico significativamente inibida estabelecida em ratinhos BALB /c (Figura 4). Não foram observados efeitos nocivos aparentes de [
32P] PO
4 comparando o peso dos murganhos tratados a dos grupos de controlo (dados não apresentados).
singeneicos BALB /c CRL2836 tumores foram estabelecidos em os flancos traseiros de ratinhos BALB /c no dia 0. Após dez dias, durante os quais os tumores se tornaram bem vascularizado, os ratinhos receberam uma injecção de 5 uCi de [
32P] PO
4 por via intravenosa através da veia da cauda. Os volumes dos tumores são apresentados como a média de seis tumores mais /menos o erro padrão da média. Frente e verso t-teste do estudante determinou o
P valor
mostrado. Detalhe: imagem representativa de 35 dias após a injecção de células CRL2836, mostrando dois ratos de controle do lado esquerdo, e um rato que recebeu um 5 uCi [
32P] PO
4 dose (direita)
.
Discussão
este estudo documenta a descoberta de que uma única dose intravenosa do
32P radioisótopo inibe significativamente o crescimento de tumores pré-estabelecidas em um modelo murino singeneicos, ao estabelecer, simultaneamente, o mecanismo subjacente a esta anti efeito -Câncer. Especificamente, mostra-se que aquosa
32P é incorporada no ADN nascente, onde tesouras decaimento isotópicos ambas as cadeias, causando a quebra de cadeia dupla tal como provado pela fosforilação da histona H2-AX. Os nossos
In vitro
experiências também demonstram que o beta-emissor puro
32P é superior ao mais poderoso puro beta-emissor
90Y em citotoxicidade tumoral, e, finalmente, que a apoptose contribui para esta citotoxicidade.
Figura 5 mostra um mecanismo proposto para a morte celular induzida por 32P
. Neste esquema,
32P é incorporado diretamente em um fio de replicação do DNA. decaimento radioativo do
32P para
32S provoca a quebra química do mesmo filamento de DNA. Em seguida, o elétron liberado por este evento decadência precisa viajar apenas 2 nm para chegar à vertente contralateral da dupla hélice, cortando-o e causando, assim, uma ruptura de fita dupla neste locus genômica. Este mecanismo está em contraste gritante com radioisótopos emissores beta não-incorporados, onde apenas uma pequena fração de elétrons emitidos viajam na orientação precisa necessário encontrar uma vertente mais sua vertente oposta e causar uma ruptura de fita dupla do DNA [30,31] . Com
32P, a extrema proximidade da cadeia alvo para a contralateral de electrões produzidas em decaimento faz com que este quebra de cadeia dupla muito mais provável que ocorra [32].
O radioisótopo está incorporado na ribose-fosfato espinha dorsal do ADN em células em divisão. O processo de decomposição ao enxofre (
32S) quebra a ligação espinha dorsal da cadeia inicial a uma taxa de 67% e libera uma partícula beta de alta energia (elétrons) que só deve viajar dois nm através da hélice para a cadeia alvo oposto. Embora um electrão emitido que viaja na orientação perfeita desta
decaimento 32P para cortar a cadeia oposta só ocorrerá a uma pequena percentagem do tempo, ainda é muito maior e mais eficiente do que os electrões, que são geradas pelo outro beta -producing radioisótopos na superfície da célula ou no citossol que deve viajar distâncias que são normalmente mil vezes ou mais mais em comprimento.
aquosa [
32P] PO
4 oferece muitos vantagens potenciais sobre outros agentes terapêuticos anti-câncer. Em primeiro lugar, ela permite uma rápida distribuição sistémica e incorporação em tumores primários e
32P é preferencialmente absorvida pelas células de proliferação rápida, tais como células cancerosas. Além disso, [
32P] PO
4 melhora a injecção directa anterior do coloidal particulado
32P em tumores primários, uma vez aquosa [
32P] PO
4 permite uma injeção intravenosa simples [33-35].
em segundo lugar,
32 P já é um fármaco aprovado pela FDA, com um perfil de baixa toxicidade conhecido [36]. estudos clínicos anteriores do
32P-ortofosfato [PO
4] em solução aquosa para policitemia vera e trombocitemia essencial estabeleceram doses toleráveis, especialmente em relação à mielossupressão [36]. Neste contexto, é interessante notar que não há efeitos secundários tóxicos evidentes ocorreu em qualquer dos sistemas modelo que foram estudados até à data. A outra preocupação com a sua utilização nestes distúrbios hematológicos benignos tem havido um aumento da incidência de subsequente leucemia mielóide aguda (LMA) [37,38], mas em pacientes com tumores sólidos avançados esta é uma preocupação menor, uma vez que LMA subsequente ocorre em apenas 10%
dez anos
depois
tratamento 32P [39]. Além disso, esta nova indicação e método de uso para um medicamento existente poupa um tempo considerável e custos, em relação ao alto investimento necessário para novos agentes anti-cancro.
Em terceiro lugar, em contraste com outros isótopos emissores beta, tais como
131I e
90Y,
32P é incorporada diretamente no DNA nascente [40,41]. Nossos dados sugerem que essa incorporação aumenta drasticamente a eficiência de matar células de
32 P, uma vez que a decadência da incorporada
32P ao enxofre quimicamente quebra a primeira vertente do DNA e o elétron liberado precisa viajar apenas 2 nm para chegar sua cadeia de DNA contralateral. Assim, este processo de forma eficiente provoca quebra de DNA de cadeia dupla, que é necessária para superar vias de reparação do ADN inatas e atingir a morte celular. Em contraste com
32 P, outros isótopos de emissão de electrões (tais como
131I e
90Y) emitem elétrons de distâncias de 1.000 a 5.000 nm de distância do DNA, alguns 500- a 2.500 vezes mais longe do que a distância de um incorporados
32P átomo de sua cadeia de DNA irmã [42-44].
é intrigante notar que os primeiros pesquisadores realizando seqüenciamento Sanger com [
32P] dATP na década de 1980 observou que a sequenciação produtos necessários electroforese dentro de dois dias depois da reacção de sequenciação, de outro modo bandas pareceu dispersar e eram difíceis de interpretar [45]. Este mesmo princípio pode operar com
32 P como um agente anti-cancro. A decadência do
32P ao enxofre quimicamente corta a fita de DNA em que se integra. Nossa hipótese é que este evento, juntamente com a extrema proximidade do radioisótopo incorporou à sua cadeia de DNA irmã, resulta em um aumento dramático na eficiência de matar células
vs
. outros emissores beta-partículas, tais como
131I e
90Y, que não são incorporadas no ADN nascente. As implicações resultantes para o potencial tratamento clínico de tumores humanos primários são óbvias e de longo alcance.
Reconhecimentos
Queremos agradecer ao Sr. Gilbert verde para a assistência técnica especializada em injetar os camundongos.