Abstract

Adenocarcinoma pulmonar, o subtipo mais comum de câncer de pulmão cancro, é a principal causa de morte por cancro em todo o mundo. Apesar das tentativas para o tratamento do cancro do pulmão que foram acumulando, novas terapias promissoras são ainda necessários. Aqui, descobrimos que AMP-cíclico resposta proteína (CREB) de ligação ao elemento -CREB ligação às proteínas (CBP) fatores de transcrição inibidor complexo, fosfato de naftol AS-TR (NASTRp), é um agente terapêutico potencial para o câncer de pulmão. Mostramos que NASTRp inibiu as propriedades da célula oncogênicos através de parada do ciclo celular com supressão concomitante de autofagia com down-regulamentação da Atg5-12 e Atg7 e acúmulo de p62 em linhas celulares de cancro do pulmão humano indutor de tumores. Além disso, NASTRp induzida a expressão de marcadores retículo endoplasmático de stress, tais como DDIT3 /CHOP, e levou a apoptose, juntamente com a indução Bim. Estes achados sugerem que o complexo fator de transcrição /co-activador, CREB-CBP, pode ser um potencial alvo terapêutico e sua inibição pode ser uma nova estratégia terapêutica para o cancro do pulmão

Citation:. Lee JW, Parque HS, Parque SA, Ryu SH, Meng W, Jürgensmeier JM, et al. (2015) A Novel pequena molécula inibidor Targeting Complex CREB-CBP possui propriedades anti-câncer efeitos com regulação do ciclo celular, Autophagy Supressão e retículo endoplasmático stress. PLoS ONE 10 (4): e0122628. doi: 10.1371 /journal.pone.0122628

Editor do Academic: Hyun-Sung Lee, Baylor College of Medicine, United States |

Recebido: 17 de julho de 2014; Aceito: 23 de fevereiro de 2015; Publicação: 21 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Cancer Institute subvenção R01-CA126801 (JSK), um Grant piloto do Yale Comprehensive Cancer Center (JSK) e Nacional de Câncer cancer Institute Support Center Grant CA-16359 (de Yale Comprehensive cancer Center)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do pulmão é uma das principais causas de mortalidade por cancro em todo o mundo, e estima-se que pacientes com câncer de pulmão 159.480 morrerão nos Estados Unidos em 2013 [1]. Aproximadamente 25% dos adenocarcinomas do pulmão, a forma dominante de câncer de pulmão abrigar

KRAS

mutações oncogênicas, e isso representa um desafio terapêutico, como

KRAS

mutações são geralmente associados com mau prognóstico e resistência à quimioterapia [2, 3]. segmentação farmacológica direta de proteína KRAS mutante activado sido vencida até agora, assim, abordagens alternativas para bloquear via de sinalização de ativação KRAS estão sendo considerados. Notavelmente, KRAS mutante leva a ativação do AMP-cíclico de resposta de ligação elemento (CREB) através de via de sinalização /MEK /ERK RAF para forçar o crescimento de células de câncer e sobrevivência. Assim, uma opção para inibir o crescimento de tumores KRAS mutante pode ser alvo factores de transcrição (por exemplo, CREB), que são muitas vezes o regulador final dos vários processos de sinalização, e poderia potencialmente ser alvo, independentemente de alterações de componentes de sinalização a montante envolvidos no desenvolvimento do cancro, progressão e invasão /metástase.

CREB é um factor de transcrição essencial envolvida na homeostase normal [4-6], no metabolismo [7], de memória /aprendizagem [8], vários tipos de cancro [9-12] e doenças imunes [13]. Nossos estudos anteriores mostraram que CREB é altamente regulada positivamente e hyperphosphorylated na maioria dos espécimes de tumor de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e que esta regulação positiva é significativamente associada a menor sobrevida [10-12]. CREB é fosforilada nos resíduos de serina /treonina, dependendo dos estímulos de componentes extracelulares e várias quinases a montante. Activado /CREB fosforilado recruta a sua região de transcrição co-activador, a proteína de ligação a CREB (CBP) a um elemento de resposta a cAMP (CRE) de genes alvo [14]. Este recrutamento de PFC é um passo crítico para a activação da transcrição de CREB [15]. Por conseguinte, bloqueando a interacção entre CREB-CBP poderia ser uma abordagem para inibir a actividade de transcrição CREB. Na verdade, a identificação de inibidores de moléculas pequenas que interferem com a formação do complexo de CREB-CBP através de segmentação da criança e domínios KIX de CREB e CBP, respectivamente, foi avaliado usando uma abordagem de rastreio RMN [16]. Além disso, nós anteriormente mostraram que um destes inibidores, fosfato de 2-naftol-AS-E (KG-501), que tem como alvo directamente o domínio KIX do CBP, resultou num complexo de CREB-CBP interrompido, inibiu a indução de genes de CREB-alvo e inibiu a IL-1β mediada atividade angiogênica em NSCLC [10].

Com o objectivo de melhorar as tentativas terapêuticas para o câncer de pulmão abrigar KRAS mutante, encontramos um inibidor do factor de transcrição multi-funcional chamado Naphthol aS-TR fosfato (NASTRp), tendo como alvo o complexo CREB-CBP, como um agente anti-câncer potente para câncer de pulmão. Colectivamente, NASTRp mostrou eficácia claro em vários ensaios biológicos e pode e será uma potencial abordagem terapêutica para cânceres humanos, especialmente para câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

cultura celular

linhas celulares de cancro de pulmão humano, A549, NCI-H1734, NCI-H1792, NCI-H441, NCI-H23, NCI-H1975 e NCI-H520 células foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) . As células normais traqueobrônquica epitelial humana (NHTBE) foram obtidos a partir de Lonza (Walkersville, MD, EUA). As linhas de células foram subcultivadas por menos de 6 meses após a reanimação e não foram autenticado. Todas as linhas celulares de cancro foram mantidos sob 5% de CO

2 a 37 ° C em meio RPMI-1640 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% de calor-inactivado soro fetal de bovino (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 1% Antibotic-antimicótico (anti-anti, Life Technologies). As células foram cultivadas em NHTBE BEBM suplementado com factores de crescimento e hormonas fornecidos pela oficina (Lonza), e a interface ar-líquido organotípicas de três demensional (ALI) Método de cultura de células foi utilizado para a cultura de células NHTBE, como descrito anteriormente [5, 17-19 ]. células HEK293T foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% FBS e 1% de anti-anti.

proliferação, a formação de colónias e os ensaios de agar mole

As células foram semeadas em placas de 96 poços a 2 x 10

3 células /cavidade com meio RPMI-1640 suplementado com FBS inactivado com calor a 5% e sem anti-anti. As células foram tratadas com naftol AS-TR sais de fosfato dissódico (NASTRp, Sigma-Aldrich, N6125) como 0-80 umol /L durante 96 horas. A proliferação celular foi medida com MTT ou CellTiter Glo ensaio de viabilidade celular luminescente (Promega, Madison, WI, EUA). A viabilidade celular das células tratadas com o veículo foi definida como 100% de proliferação. Para o ensaio de formação de colónias, as células foram semeadas em placas de 6 poços a 1 × 10

3 células /poço. As células foram tratadas com NASTRp como 0, 5, 10, e 20 umol /L e foram alteradas por meio fresco contendo NASTRp em dias alternados durante 10-17 dias, altura em que 0,1% (p /v) de violeta de cristal (Thermo Scientific, NJ , EUA) foi utilizado para visualizar as colónias. ensaio de agar mole foi realizado como descrito anteriormente [12]. Resumidamente, as colónias foram coradas com violeta de p-iodonitrotetrazólio (Sigma-Aldrich) para seleccionar colónias vivas e, em seguida, as colónias coradas foram contadas utilizando o software Image J. (NIH, EUA). Uma colónia foi definida como qualquer coisa que contenha mais de 10 células, como se indica 50 pixels na imagem J.

reversa quantitativa PCR de transcrição-

análise de qRT-PCR foi realizada como descrito anteriormente [11 ]. Em resumo, o ARN total foi purificado a partir de células utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA). A transcrição reversa do RNA total foi realizada utilizando a transcriptase reversa de MMLV (Promega). Quantitative PCR foi realizada utilizando SYBR Green PCR Reagentes núcleo (Applied Biosystem, Life Technologies). Todos os primers foram adquiridos a partir de Keck (New Haven, CT, EUA). Todas as reacções foram realizadas em triplicado e os níveis de proteína ribossómica L32 de ADNc foram utilizados como um controlo endógeno. As sequências dos iniciadores utilizados na qRT-PCR eram como se segue: A ciclina A2; mais adiante; 5′-CCAAGAGGACCAGGAGAATA-3 ‘, reverso; 5’-CGGTGACATGCTCATCATT-3 ‘, ciclina B1; mais adiante; 5’-AGTCACCAGGAACTC GAAAA-3 ‘, reverso; 5’-GTTACCAATGTCCCCAAGAG-3 ‘, ciclina D1; mais adiante; 5’-CTTC AAATGTGTGCAGAAGG-3 ‘, reverso; 5’-AGCGGTCCAGGTAGTTCAT-3 ‘; Ciclina E2; mais adiante; 5’-AGAGAGGAGGTCACCAAGAAA-3 ‘, reverso; 5’-CAGGCAAAGGTGAAGGAT TA-3 ‘, GRP78; mais adiante; 5’-CACAGTGGTGCCTACCAAGA-3 ‘, reverso; 5’- TGTCTTTTGTC AGGGGTCTTT-3 ‘, CHOP; mais adiante; 5’-AGCCAAAATCAGAGCTGGAA-3 ‘, reverso; 5’-TGG ATCAGTCTGGAAAAGCA-3 ‘, IRE1; mais adiante; 5’-CTCTGTCCGTACCGCCC-3 ‘, reverso; 5’- GAAGCGTCACTGTGCTGGT-3 ‘, Perk; mais adiante; 5’-TCATCCAGCCTTAGCAAACC-3 ‘, reverso; 5’-ATGCTTTCACGGTCTTGGTC-3 ‘, ATF6; mais adiante; 5’-GCAGAAGGGGAGACAC ATTT-3 ‘, reverso; 5’-TTGACATTTTTGGTCTTGTGG-3 ‘, XBP1; mais adiante; 5’-CGAATGAG TGAGCTGGAACA-3 ‘, reverso; 5’-GGCCATGAGTTTTCTCTCGT-3 ‘, L32; mais adiante; 5’-CAC CAGTCAGACCGATATGT-3 ‘, reverso; 5’-ACGTTGTGGACC AGGAACT-3 ‘. A análise dos dados de PCR em tempo real foi realizada usando o método (TC) por iCycler programa analisador termociclador (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) ciclo limiar comparativa.

preparação de banco de dados, pesquisa e modelagem molecular de ancoragem

Todos os cálculos de modelagem foram conduzidos em um Sybyl 7.1 suíte de modelagem quatro processadores MIPS R16000 Silicon Graphics Tezro execução. As bases de dados estruturais que contenham mais de 600.000 estruturas que consistem de compostos disponíveis a partir de cerca de 50 fornecedores comerciais de bases de dados químicos [20]. bibliotecas de compostos foram recebidos no formato de arquivo SDF [21] e uma pesquisa de dois semelhança dimensional foi executado em cada banco de dados utilizando o comando de pesquisa DB. As listas de sucesso resultantes foram combinados em uma lista de acertos comum de três SLNs tridimensionais (3D). O DBslnfilter foi usado para filtrar para fora as estruturas que contêm as seguintes propriedades: misturas, metais, isótopos, não há coordenadas 3D, MW 100, ou MW 500. O gerente da lista hit foi aplicada para eliminar todos os compostos que contenham menos carboxilatos, fosfatos e sulfonamidas. coordenadas de domínio KIX foram obtidos pela média das estruturas de RMN de domínio KIX (PDB ID: IKDX). KIX e NASTRp coordenar foi gerado usando phenix.elbow [22]. cálculos de ancoragem foram realizadas com HEX 6.3 [23]. O tipo de correlação utilizado no acoplamento é “Shape + Electrostatistics”. O rastreio de compostos de similaridade foi realizada usando PubChem compostos.

análise de citometria de fluxo e ensaio de apoptose

citometria de fluxo e ensaios de TUNEL foram realizados como descrito anteriormente [12]. Células de adenocarcinoma do pulmão humano NCI-H441 foram tratados com NASTRp seguido de coloração com tampão de coloração de PI /RNase (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). a distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo BD LSRII (BD Biosciences) e software FlowJo (Treestar, Ashland, OR, EUA). Para o ensaio de TUNEL, células de adenocarcinoma do pulmão humano A549 foram tratadas com NASTRp durante 48 horas e seguido de coloração com fluoresceína ApopTag directa in situ de apoptose Detection Kit (Merck Millipore, Billerica, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

os ensaios de immunobloting, co-imunoprecipitação e imunofluorescência

electroforese em dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferência de western foram realizadas para analisar a expressão de várias proteínas. Os lisados ​​celulares foram lisadas por tampão de lise RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0, 0,1% de SDS, 1% de desoxicolato de sódio, 1% de NP-40) suplementado com EDTA completa Livre de inibidores de protease e fosfatase cocktails (Roche, South San Francisco, CA, EUA) e submetidos a imunotransferência utilizando vários anticorpos. Foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-ciclina A2 (# 4656), B1 anti-ciclina (# 4138), anti-ciclina E2 (# 4132), anti-LC3B (# 3868), anti-ATG7 (# 8558), anti -ATG5 (# 12994), anti-GRP78 /Bip (# 3177), anti-caspase 3 (# 9665), caspase 3 anti-clivada (# 9579), anti-fosfo-CREB (S133; # 9198) e anti- Bim (# 2933) a partir de Cell Signaling Technology, anti-ciclina D1 a partir Epitomics (# 2261-1, Burlingame, CA, EUA), anti-p62 /SQSTM1 da América Research Products (03-GP62-C, Waltham, MA, EUA ), anti-CHOP de Novus Biologicals (NBP2-13172, Littleton, CO, EUA), anti-β-actina e anti-FLAG a partir de Sigma-Aldrich (A2228). Para o ensaio de co-immunoprecipiation, as células HEK293T foram co-transfectadas com pcDNA3-HA-KIX (CBP; aminoácidos 586-666) e pcDNA3-Myc-KID (CREB; aminoácidos 87-146 da variante transcrição A) usando Lipofectamine 2000 ( life Technologies). 48 horas após a transfecção, as células foram pré-tratadas com NASTRp durante 3 horas após a 10 uM forscolina (Sigma-Aldrich) a administração durante mais 1 hora. Os lisados ​​celulares foram preparados com tampão (Tris-HCl 50 IP, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, 10% de glicerol, 0,5% de NP-40, 0,5% Triton X-100) suplementado com completos de protease e inibidores de fosfatase cocktails isento de EDTA. Os lisados ​​pré-limpas foram sujeitos a imunoprecipitação utilizando o anticorpo monoclonal de ratinho anti-HA (MMS-101P, Covance, Princeton, NJ, EUA) com conjugado de proteína A /G PLUS-agarose (sc-2003, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA). Usando Bandeira-CREB1 estavelmente expressando células 293T, estas células estáveis ​​foram transfectadas com pcDNA3-HA-KIX, seguida de tratamentos ou forscolina NASTRp como descrito acima. Os complexos imunes por suspenso com anticorpo anti-fosfo-CREB foram sujeitos a SDS-PAGE e Western blot. Para o ensaio de imunofluorescência, linhas celulares humanas adenocarcinoma do pulmão A549 foram tratadas com as concentrações indicadas, durante 24 horas e seguido de fixação com paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. As células fixadas foram permeabilizadas com 50 mg /ml de digitonina em PBS (D141, Sigma-Aldrich) durante 10 min adicionais. células bloqueadas com albumina de soro bovino 3% (BSA, A9647, Sigma-Aldrich) foram sondados com anticorpos primários e seguido de conjugação com Alexa Fluor 488 e 568 burro anticorpos anti-IgG de coelho (Life Technologies), para p62 /SQSTM1 e CHOP, respectivamente . As células coradas foram montadas com Prolong Antifade Ouro Reagente com DAPI (Life Technologies) e seguiu observação ao microscópio de fluorescência (Olympus America Co., Center Valley, PA, EUA).

Kaplan-Meier análise traçando

Para analisar a correlação entre a sobrevivência do paciente no adenocarcinoma de pulmão e as expressões da proteína de autofagia, como ATG7 (Affymetrix ID: 218670_s_at), Atg5 (210639_s_at) ou p62 /SQSTM1 (201471_s_at), adotamos as bases de dados resultados de Kaplan-Meier Plotter (https://www.kmplot.com) [24] com os critérios; (1) a sobrevida global (OS), (2) os pacientes divididos por média, (3) acompanhamento limiar 9, (4) Histologia como adenocarcinoma, (5) de regressão de Cox como uni-variada e (6) o controle de qualidade matriz como excluídos matrizes tendenciosa.

Análises estatísticas

Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes independentes. Para a geração de gráficos e análises estatísticas, foi utilizado o software Graph Pad Prism (v.6).

valores P

entre os grupos foram determinados por um e dois rabos Student não pareado

t

testes.

Resultados

Identificação de análogos de naftol como CREB-CBP transcrição /fator de co-ativador complexos inibidores

Nós já demonstrou que CREB é um fator de transcrição crítico no desenvolvimento do câncer de pulmão através do seu envolvimento na sobrevivência celular, progressão do ciclo celular, proliferação e regulação da apoptose [5, 6, 10- 12]. O primeiro proposto que CREB pode ser um alvo molecular para a prevenção e tratamento do NSCLC [11]. Na verdade, nós demonstramos que CREB regula quimiocinas CXC IL-regulados-1p, críticos para a migração celular e angiogênese em NSCLC usando KG-501 [10]. Assim, estes estudos conduzem à lógica para a identificação de pequenas moléculas inibidoras de segmentação actividade de transcrição CREB descrito neste estudo. Para identificar os melhores compostos, inicialmente seleccionado um total de 4.547 compostos, que consistia de um corte de semelhança bidimensional de 80%, utilizando a estrutura de KG-501 como uma consulta. Uma vez que o fosfato na estrutura KG-501 foi considerado como sendo um elemento importante, no arrendamento uma parte, para a sua solubilidade, a selecção foi então ainda mais refinada para assegurar que os compostos contidos grupos considerados como sendo equivalentes ao fosfato e isto resultou numa 67 compostos candidatos. Destes, foram identificados 6 compostos de naftol análogos que têm efeitos anti-cancro, como mostra a Fig 1A.

(A) As estruturas químicas dos análogos do naftol s_elected. (B) Efeito inibidor de análogos de naftol sobre o crescimento celular na linha celular de adenocarcinoma de pulmão NCI-H1734. A viabilidade celular às 96 horas após os tratamentos foi medida pelo ensaio de MTT, com a absorvância a 590 nm. Os experimentos foram triplicado e repetidos pelo menos três vezes.

Para determinar se os compostos candidatos têm efeito anti-cancro, a linha de células humanas de pulmão adenocarcinoma, NCI-H1734, foi exposto a várias concentrações de 6 a compostos seleccionados. Todos os compostos mostraram efeito inibidor sobre a proliferação celular, tal como indicado pelos valores de IC50 (Fig 1B). Destes, NASTRp foi o composto mais potente nestes ensaios de proliferação, como mostrado:. CI50 = 3,701 umol /L

próxima conduzida a simulação e cálculo de ancoragem utilizando NASTRp e KIX domínio do CBP, como ligando e receptor, respectivamente . O resultado mostra que NASTRp está perto de Arg-600 do domínio KIX da CBP, um resíduo crítico para a interação CREB-CBP, de acordo com KG-501 (S1A Fig; Ref. [17]). Nós ainda observado que NASTRp aboliu completamente não só a interação entre KIX e KID em células HEK293T co-transfectadas mas também a interação entre fosforilada CREB de corpo inteiro e KIX em CREB marcada com Flag expressando estavelmente 293T ensaios de co-imunoprecipitação cellsby (S1B e S1C FIG). Portanto, NASTRp foi selecionado e investigado em outros ensaios biológicos descritos neste documento.

efeitos anti-câncer de NASTRp em linhas celulares de cancro do pulmão humano

Para determinar o effiect anti-câncer do NASTRp, várias linhas celulares de cancro de pulmão foram seleccionados para ensaio de proliferação celular. Inicialmente escolhemos células abrigando

KRAS

mutações; A549 (KRAS-G12S), NCI-H1792 (KRAS-G12C), NCI-H441 (KRAS-G12V) e NCI-H1734 (KRAS-G13C). Para determinar o efeito inibitório sobre a proliferação de células, cada linha de células foi exposto a várias doses de NASTRp. Coerente com o efeito anti-proliferativo em células de NASTRp NCI-H1734, como mostrado na Fig 2A, NASTRp suprimida drasticamente a proliferação de células em todas as linhas celulares de cancro do pulmão com

KRAS

mutações testadas (A549 CI50 =, 3,574 uM; NCI-H1792, 11,769 fiM; NCI-H441, 11,074 fiM; NCI-H1734, 4,025 mM). Dado o efeito inibidor potente na proliferação de células de NASTRp, estendemos as células de câncer de pulmão de linhas celulares de cancro do pulmão albergando

EGFR

mutações, NCI-H1975 (EGFR-L858R /T790M) e um carcinoma de células escamosas com altamente expressando FGFR e CREB, NCI-H520 (IC50 = NCI-H1975, 8,891 pM; NCI-H520, 4.363 uM; Ref. [11]). Observamos também que o crescimento celular inibiu significativamente NASTRp em baixa de soro continha condição durante o tratamento (S2 Fig). Descobrimos que NASTRp mostrou efeito anti-proliferativa significativa em linhas celulares de cancro do pulmão teses independentemente do seu estatuto de mutação genética.

(A) Efeito inibidor de NASTRp sobre a proliferação celular em linhas celulares de cancro do pulmão humano. A549, NCI-H1792, NCI-H441, NCI-H1734, NCI-H1975 e NCI-H520 linhas celulares foram tratadas com várias concentrações de NASTRp em meio RPMI suplementado com FBS a 5% durante 96 horas. A proliferação celular foi avaliada por ensaio CellTiter Glo como descrito nos Métodos. (B) ensaio de formação de colónia de baixa densidade com o tratamento NASTRp. As células foram plaqueadas como culturas de uma única célula e tratados com várias concentrações de NASTRp autorizados a cultura até grandes colónias eram visíveis. As colónias foram coradas com violeta de cristal e fotografado para contar. (C) Supressão do crescimento independente Anchorage por NASTRp. As células foram plaqueadas com baixa densidade de agarose (0,4%) contendo várias concentrações de NASTRp. células NCI-H1734 foram mostrados como imagens representativas de ensaio em agar mole. Os dados são apresentados como a média ± DP de poços em triplicado. *

P Art 0,05 comparativamente ao veículo.

A seguir, caracterizado se NASTRp afeta a formação de colónias e crescimento celular independente de ancoragem. Coerente com o efeito inibitório de NASTRp sobre a proliferação celular, número de colónias de todas as células de cancro de pulmão foram drasticamente diminuída por tratamento em NASTRp dependentes de ancoragem e o crescimento celular independente (Fig 2B e 2C, S3 figura). Para determinar se o efeito anti-cancro de NASTRp é específico para o cancro do pulmão, realizamos ensaios de proliferação celular e formação de colónias semelhantes em células de cancro do pâncreas e da mama. Observou-se os efeitos inibidores de NASTRp sobre a proliferação celular e a formação de colónias em células do cancro do pâncreas (PANC-1, AsPC-1 e SU.86.86.) E células de cancro da mama (MCF-7, MDA-MB-231 e SKBR3), bem (S4 Fig). Assim, estes resultados sugerem que NASTRp inibe a proliferação celular, a formação de colónias, e crescimento independente de ancoragem em células de cancro humanas, incluindo, pelo menos, do pulmão, pancreático, e linhas celulares de cancro da mama.

Indução da paragem do ciclo celular através a sub-regulação das ciclinas por NASTRp

tem sido demonstrado que CREB regula a progressão do ciclo celular através de regulação positiva de proteínas ciclina, incluindo a ciclina D1 e ciclina A2, que contêm elementos CRE nas suas regiões promotoras [25, 26] . Também confirmou que as ciclinas conter elementos CRE em seus promotores de análise baseada em sequência utilizando bases de dados públicas (por exemplo BIOBASE ou TESS). Como mostrado na Fig 3A, ciclina A2, B1, D1, e E2 conter regiões CRE putativos nos seus promotores. Para determinar se um inibidor de CREB, NASTRp de facto regula negativamente ciclinas, foram examinados os níveis de expressão de ciclinas relacionada com o ciclo celular em tratamento NASTRp por Western blot qRT-PCR e. Como se mostra a Fig 3B e 3C, NASTRp dramaticamente regulada negativamente as expressões de ciclinas incluindo ciclina A2, B1, D1 e E2 no ARNm e os níveis de proteína. Além disso, NASTRp reduziu a população de células em ciclo celular fase S e levou a paragem do ciclo celular em G1 e G2 em fases células NCI-H441 (figura 3D). Estes dados indicam que NASTRp suprime a proliferação de células NSCLC, pelo menos em parte, através da regulação negativa dos principais reguladores do ciclo celular, as ciclinas.

(A) CRE nos promotores dos genes de ciclina. A análise da sequência dos promotores dos genes indicou os locais de ligação potenciais para CREB-CBP. (B e C) Efeito de NASTRp da expressão de ciclinas no ARN (B, qRT-PCR) e proteína (C, Western blot) em A549 (esquerda), NCI-H1792 (meio) e NCI-H441 (à direita). controlo do veículo é definida como 1 no ensaio de qRT-PCR. Para os dados de qRT-PCR estão representados como a média ± DP de três experiências independentes realizadas em triplicado. *

P Art 0,05 comparativamente ao veículo. células (D) NCI-H441 foram tratados com 10? M NASTRp durante 24 horas e a distribuição do ciclo celular foi determinado por coloração com iodeto de propídio, seguido de análise de FACS.

Supressão de autofagia e indução do stress e de células ER morte por NASTRp

Curiosamente, observou-se várias estruturas vacúolo como no citosol de células tratadas com NASTRp. Nós, então, a hipótese de que NASTRp pode suprimir a autofagia citoprotetora contrariar um papel de promoção do tumor funcionar como uma droga anti-câncer. A autofagia é muitas vezes considerado como uma fonte alternativa de alimentação para a sobrevivência células cancerosas quando estão sob fornecimento de crescimento limitado. Assim, examinamos autophagy marcadores, tais como a modificação LC3B e p62 degradação /SQSTM1 em tratamento NASTRp em células NSCLC humanas. De nota, p62 é uma molécula chave de gestão de apuramento autofágica de proteínas polyubiquitinated através diretamente ligação a LC3 em autofagossomas [27]. Defeito de autofagia provoca acúmulo de p62, agregados de proteína ubiquitina conjugar e organelas danificadas particularmente mitocôndria [28, 29].

Nós descobrimos que em todas as linhas celulares examinadas, p62 dramaticamente acumulada em consequência do tratamento NASTRp em uma dose forma dependente (Fig 4A). Enquanto outras proteínas relacionadas autofagia críticos, incluindo ATG7 e os níveis de conjugação ATG5-12 diminuíram significativamente após o tratamento NASTRp, indicando um efeito supressor de NASTRp na autofagia (Fig 4A). Além disso, o fluxo NASTRp bloqueado autofagia basal, como mostrado por nenhuma mudança de modificação LC3B ou degradação de p62 na presença de bafilomicina A1 (um inibidor da V-ATPase), que bloqueia as etapas tardias da autofagia (Fig 4B).

(a) células foram tratadas com várias concentrações de NASTRp em meio RPMI-1640 suplementado com 5% de FBS durante 24 horas. Os lisados ​​celulares foram submetidos a ensaio de Western Blot com os anticorpos indicados. (B) Inibição de fluxo autofagia por NASTRp. as células NCI-H441 foram tratados com 20? M NASTRp na presença ou na ausência de bafilomicina A1 (100 nM) durante 24 horas. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a SDS-PAGE, análise da mancha /Western, utilizando os anticorpos indicados. (C) A acumulação de agregados p62 por NASTRp. As células A549 foram tratadas com 20? M NASTRp durante 24 horas. As células tratadas foram seguidos a coloração por imunofluorescência com anticorpo anti-p62. Barra de escala: 10 ^ m. (D) benefício clínico potencial de NASTRp em pacientes de adenocarcinoma de pulmão. As curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para os conjuntos de dados de adenocarcinoma de pulmão humano, que comparam a sobrevida global entre os tumores com altos níveis de (vermelho) ou níveis baixos (preto) de ATG7 (painel esquerdo), Atg5 (painel do meio) e p62 /SQSTM1 (painel da direita) a expressão do gene da ferramenta de Kaplan-Meier Plotter. Log-rank

P

valores são mostrados.

O acúmulo de p62 foi células usando imunofluorescência no A549 ainda confirmada. Consistente com o resultado Imunoblotting, agregados P62 ( 2-4 ^ m) aumentaram significativamente no citosol após o tratamento NASTRp comparação com o veículo (Figura 4C). Estes resultados estão em linha com a hipótese de que NASTRp pode suprimir a autofagia indutor de tumores /citoprotetora, pelo menos em parte, por meio ATG7 infra-regulação e bloqueio de fluxo autofagia como mostrado pelo acúmulo de LC3B-II e p62.

uma vez que a correlação entre a sobrevivência do paciente no adenocarcinoma de pulmão e as expressões de proteínas autofagia, como ATG7, Atg5 ou p62 ainda não foram relatados, nós próxima realizou uma análise de sobrevivência de pacientes de adenocarcinoma de pulmão marcou para a

ATG7

,

Atg5

ou

expressões p62

mRNA usando bases de dados públicas. Na

ATG7

banco de dados -relacionados (ID: 218673_s_at), existem 242 (49,8%) casos para casos de alto

ATG7

expressão e 244 (50,2%) para baixo

ATG7

expressão. A análise de sobrevivência de Kaplan-Meier mostra que os pacientes abrigando baixo

ATG7

expressão tinha uma sobrevivência significativamente melhorada em comparação com aqueles com alta

ATG7

expressão (Fig 4D, superior,

P

= 2.7e-06). Os pacientes com baixa

Atg5

expressão tiveram melhor sobrevida consistente com o

ATG7

casos (Fig 4D, meio,

P

= 1.1E-08). Em contraste, os pacientes com alta expressão de

p62

teve resultado significativamente melhor sobrevida em comparação com os pacientes com baixa

p62

expressão (Fig 4D, inferior,

P

= 9,7 e-07).

tem sido relatado que a autofagia deficiente através ATG7 regulada para baixo resultou em estresse ER elevada na doença hepática metabólica [30]. Dada a supressão de ATG7 por NASTRp, examinamos mais expressão de marcadores de estresse ER, tais como GRP78, CHOP, IRE1, Perk, ATF6 e XBP1, para determinar se NASTRp induz estresse ER em células de câncer de pulmão. Como mostrado na Fig 5A, NASTRp induzida ER stress e activado resposta desdobrado proteína (UPR), demonstrada pela sobre-regulação de GRP78 [31] e CHOP. Além disso, os níveis de outros genes relacionados com o stress do ER, tal como IRE1, ATF6, vantagens e XBP1 expressão também aumentaram após o tratamento NASTRp em células de cancro humano (Figura 5A). Nós confirmou que NASTRp regulado para cima o nível de proteínas GRP78 e pique em um tempo e maneiras dependente da dose (Fig 5A e 5B) e observaram um aumento dramático de expressão CHOP no núcleo (Fig 5C). O ER stress tornou-se intransponível na presença de NASTRp e levou à morte celular, como mostrado pelo aumento de caspase-3, expressão Bim e TUNEL positivos pontos clivados (Fig 5B e 5D).

(A) qRT-PCR análise de biomarcadores de estresse ER /UPR genes relacionados em NCI-H441 tratadas com 20 mM NASTRp de maneira curso de tempo. (B) NASTRp induzida estresse ER e UPR activado levou a apoptose com a indução Bim em linhas celulares de NSCLC. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de NASTRp durante 24 horas e os lisados ​​celulares foram sujeitos a SDS-PAGE, análise da mancha /Western, utilizando os anticorpos indicados. (C) regulação positiva de CHOP por NASTRp. células NCI-H441 foram tratados com 20 NASTRp para 0-24 horas. Nos pontos de tempo indicados, as células foram fixadas e sujeitas a ensaio de imunofluorescência com anticorpos anti-CHOP. imagens de células foram microphotographed usando microscopia de fluorescência a 60x de ampliação. Barras de escala: branco; 10 μm. (D) As células-TUNEL positivo em NASTRp-tratada (durante 48 horas) as células A549 foram contados e analisados ​​como parente% de células positivas TUNEL. *

P Art 0,05 comparativamente ao veículo.

Em seguida, avaliamos o efeito on-alvo de NASTRp usando normais do epitélio traqueobrônquico humano (NHTBE) células em bidimensional (condição regular de cultura de tecidos) e organot�ica três dimentsional (ar sistemas de cultura ALI) [5, 17-19]; condição de cultura de interface líquido. Embora tenha havido menor efeito de morte de células em NASTRp NHTBE, a viabilidade celular não foi diminuída menor do que 50%, ainda 20 uM de tratamento NASTRp (Figura 6A e 6B). Considerando p62 foi acumulado em células de câncer de pulmão, p62 em células NHTBE era imutável após o tratamento NASTRp (Fig 6C). Estes dados indicam que pode NASTRp especificamente como alvo em células de cancro, em vez de células normais, especialmente dentro de gamas terapêuticas de janela. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que NASTRp suprime o papel da autofagia através ATG7 infra-regulação e acumulação de p62, induz estresse ER com a ativação da UPR, e, eventualmente, leva à morte celular nas células NSCLC humanas (Fig 6D) de promoção do tumor.

ensaio de viabilidade (a) celular em resposta a NASTRp de células NHTBE. células (B) NHTBE que foram cultivadas no sistema 3D organotípicas interface ar-líquido (ALI) sob tratamento NASTRp. NHTBE células foram tratadas com 10? M NASTRp durante 96 horas. imagens representativas foram obtidos usando microscopia óptica de contraste de fase. (C) Nível de p62 Inalterado na célula NHTBE tratados NASTRp. NHTBE células foram tratadas com as doses indicadas de NASTRp durante 24 horas.