Abstract

O câncer de próstata é o tumor maligno sólido mais comum em homens, com 32.000 mortes por ano. A piperina, um constituinte principal alcalóide de pimenta preta, anteriormente foi relatado como tendo actividade anti-cancro em grande variedade de linhas celulares de cancro. O efeito da piperina contra o cancro da próstata não é actualmente conhecido. Portanto, no presente estudo, foram investigados os mecanismos anti-tumorais de piperina em células de cancro da próstata independentes de androgénio e dependentes de androgénio. Aqui, mostramos que a piperina inibiu a proliferação de células LNCaP, PC-3, as células de cancro da próstata 22RV1 e DU-145 de uma forma dependente da dose. Além disso, Anexina-V demonstraram que o tratamento de coloração piperina induzida apoptose em células de cancro da próstata dependentes de hormonas (LNCaP). Usando o ensaio de activação de caspase global, que mostram que a apoptose induzida por piperina resultou na activação da caspase em células LNCaP e PC-3 células. Estudos adicionais revelaram que o tratamento com piperina resultou na activação da caspase-3 e a clivagem de PARP-1 em proteínas LNCaP, PC-3 e DU-145 células de cancro da próstata. tratamento piperina também interrompido andrógeno receptor (AR) expressão em células de cancro da próstata LNCaP. Nossas avaliações mostram também que há uma redução significativa dos níveis de antigénio (PSA) específico da próstata após o tratamento piperina em células LNCaP. STAT-3 factores de transcrição NF-kB e que tenham sido previamente demonstrado que desempenham um papel na angiogénese e invasão de células cancerosas da próstata. Curiosamente, o tratamento de LNCaP, PC-3 e DU-145 células de câncer de próstata com piperina resultou em redução da expressão de STAT-3 fosforilada e fatores de transcrição nuclear fator-kB (NF-kB). Estes resultados correlacionam com os resultados do ensaio de câmara de Boyden, em que o tratamento reduziu a piperina migração de células de LNCaP e PC-3 células. Finalmente, mostramos que o tratamento piperina reduziu significativamente o crescimento andrógeno dependente e independente tumor andrógeno no modelo de ratos sem pêlo xenotransplantadas com células cancerosas da próstata. Tomados em conjunto, estes resultados suportam uma investigação mais aprofundada da piperina como um potencial agente terapêutico no tratamento de câncer de próstata

Citation:. Samykutty A, Shetty AV, Dakshinamoorthy G, Bartik MM, Johnson GL, Webb B, et al . (2013) piperina, um componente bioativo de Pimenta Spice exerce efeitos terapêuticos sobre andrógeno células dependentes e câncer de próstata andrógeno-independente. PLoS ONE 8 (6): e65889. doi: 10.1371 /journal.pone.0065889

editor: Bart O. Williams, Van Andel Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de novembro de 2012; Aceito: 30 de abril de 2013; Publicação: 18 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Samykutty et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

CONFLITO dE iNTERESSES:. Os autores declaram que Mary Margaret Bartik e Gary Johnson são empregados com Imunoquímica Technologies, LLC, Bloomington, MN, e Brian Webb é empregado na Thermo Fisher Scientific, Rockford , IL. Além disso, os autores afirmam que isso não altera a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

homens ocidentais são confrontados com um aumento da incidência de câncer e câncer relacionado mortes por ano. As estatísticas indicam que o câncer de próstata é a segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer entre os homens nos Estados Unidos. De acordo com as estimativas recentes nos Estados Unidos, 217,730 homens serão recém-diagnosticados com câncer de próstata e 32.050 homens morrerão desta doença em 2010 [1]. O câncer de próstata começa inicialmente como sendo dependente de hormonas, mas como a doença progride ele passa a ser hormonal independente e resistente ao tratamento com hormônio relacionado. Actualmente opções de tratamento disponíveis, tais como a quimioterapia, radioterapia, cirurgia ou terapia hormonal são insatisfatórios [2]. produtos naturais, derivados de plantas ou microorganismos, tornaram-se uma importante fonte de terapias anti-câncer, com um número substancial de terapias atuais que estão sendo natural ou derivados de produtos naturais. Portanto, há um grande interesse na identificação de compostos naturais no tratamento de cancro da próstata. A evidência está acumulando que os compostos de origem vegetal (fitoquímico) exercem efeitos anti-câncer com menos toxicidade [3]. pimenta preta, o tempero dos milênios tem sido amplamente utilizada em várias preparações alimentícias em todo o globo. Nos Estados Unidos, por si só, a ingestão média diária de pimenta preta foi estimado em 359 mg. A piperina é responsável por 5% a 9% do teor de pimenta preta, o que implica a ingestão diária de cerca de 60-110 uM [4]. Piperina (isômero trans-trans de piperidina 1-piperoyl) é o princípio activo e o ingrediente principal de pimenta preta usada como uma medicina tradicional na Índia [5]. O potencial de piperina como agente anti-cancro tem sido demonstrada anteriormente. Piperina inibiu o desenvolvimento de tumores sólidos em ratos induzidos com células DLA (Dalton Lympoma ascite) e estendeu o tempo de vida de ratos portadores de tumor de Ehrlich ascite [6]. A piperina também tem mostrado ter actividade anti-invasão de células de melanoma B16F-10 [7]. O efeito citoprotector da piperina em B (α) -p (benzopireno) câncer de pulmão experimental induzida tem sido investigado com êxito em ratos e inferir que a piperina pode exercer o seu efeito quimiopreventivo modulando a peroxidação lipídica e aumentando o sistema de defesa antioxidante [8]. Curiosamente, estudos recentes têm demonstrado que a piperina pode inibir o câncer de mama, visando as propriedades de renovação de células-tronco do câncer [9].

Apesar de sua ampla utilização e sua capacidade de inibir vários tipos de câncer, pouco se sabe sobre os efeitos benéficos de piperina contra o câncer de próstata. Mákhov e colaboradores [4] previamente mostrou que a co-administração de docetaxel e piperina resultou numa eficácia anti-tumoral aumentada num modelo de xenoenxerto de cancro da próstata resistente à castração humano através de inibição da actividade do CYP3A4. Até à data, no entanto, há outros estudos têm caracterizado os efeitos anticancerígenos diretos de piperina em células de câncer de próstata, apesar de ser mostrado para aumentar o potencial quimioterápico do docetaxel contra tumores de próstata [4]. Portanto, o objetivo do estudo é determinar as actividades de câncer anti-próstata de piperina, bem como para determinar os mecanismos moleculares subjacentes à sua acção.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

as experiências com animais foi realizada neste estudo de acordo com as orientações definidas para o cuidado e uso de animais de laboratório e com as regras formuladas sob a Lei de Bem-Estar animal do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA). O protocolo foi aprovado pela Comissão IACUC da Universidade de Illinois, College of Medicine em Rockford e estudos com animais realizados em uma instalação credenciado pela AAALAC e USDA.

produtos químicos e reagentes

O SFB (FCS), meio RPMI-1640 e Meio Essencial mínimo (MEM) foram obtidas da American Type Culture celular (ATCC), Manassas, VA, EUA. A piperina foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kit de ensaio de viabilidade celular foi comprado de Dojindo Molecular Technologies Inc., Gaithersburg, MD. Anexina V-FITC Kit de detecção de apoptose foi obtido a partir de MBL internacional, Woburn, MA.

linhas de células e cultura de células

LNCaP, DU-145, 22RV1 e PC-3 linhas de células foram obtidas a partir Cultura americana tipo de células (ATCC), Manassas, VA, EUA e as células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com FCS a 10% e 50 ug /ml de gentamicina. Para todos os experimentos, 1 × 10

5 células /ml foram semeadas e cultivadas durante 24 h antes de tratamentos experimentais. As células foram mantidas a 37 ° C, 5% de CO

2 ambiente.

A viabilidade celular ensaio

LNCaP, 22RV1, DU-145 e PC-3 foram semeadas em 96 cavidades placas de cultura de tecidos e incubadas até as células aderentes aos poços. Todas as células foram então tratadas e incubadas com diferentes concentrações de piperina (5-200? M) durante 24, 48 e 72 h. As viabilidades celulares foram determinadas utilizando um kit de contagem de células-8 (CCK-8) a partir de Dojindo Technologies molecular. 10 ul solução de CCK-8 foi adicionado ao cellsand piperina tratada incubadas durante 3 h. A densidade óptica foi medida a 450 nm, utilizando um modelo de microplacas Bio-Rad leitor 680.

activação de caspase ensaio

LNCaP e PC-3 foram semeadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos e foram cultivadas até que chegou a 50% de confluência. células de cancro da próstata foram então tratadas e incubadas com diferentes concentrações de piperina (50-200 uM), durante 24, 48 e 72 h, respectivamente. Cada placa foi então incubada com 2 mL de caspase sonda fluorescente marcada com (NIR-FLIVO 747 In Vivo A apoptose Tracer, Immunochemistry Technologies, LLC, Bloomington, MN) durante 15 minutos. As células foram lavadas com 100 ul de 1 x PBS para remover o substrato de caspase. Seguindo isto, 100 ul de 1 x PBS foi adicionado a 24 h placa e 100 uL do meio completo foi adicionado às 48 h e 72 h placas de modo que as células não secar antes de ser lido. As placas foram lidas usando um V3.0 máquina Odyssey LI-COR para detectar ativação da caspase global.

coloração anexina V-FITC para detecção de apoptose

células LNCaP foram cultivadas em uma cultura de tecidos 8-câmara corrediça em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e gentamicina até as células aderentes aos poços. As células foram então tratadas e incubadas com diferentes concentrações de piperina (60 pM e 75 uM) durante 24 horas. O meio foi então removido dos poços e utilizada mais tarde para o ensaio de PSA. A apoptose foi determinada utilizando um kit de detecção de apoptose Anexina V-FITC de MBL International. As células foram coradas pela adição de 500 uL de tampão de ligação, 5 uL anexina e 5 uL PI a cada poço e incubação na obscuridade à temperatura ambiente durante 5-10 minutos. tampão de ligação, e anexina PI foi então removido dos poços juntamente com a câmara. 2-3 gotas de 1 x PBS foi adicionado a cada secção da lâmina e coberto. Deslize foi então analisada utilizando um microscópio de fluorescência.

ensaio de PSA

ensaio de PSA foi realizada utilizando os sobrenadantes recolhidos a partir de células LNCaP tratados com piperina (5-150? M). Próstata secreção de antigénio específico (ng /mL) foi determinada utilizando um kit de ELISA de Antigénio Específico da Próstata Humano comprado de Abnova.

análise Western blot

LNCaP e células tratadas com 60? M PC-3 e 75 uM de piperina, respectivamente, e as células DU145 tratados com 160 ^ M durante 24 h. Além disso, as células LNCaP foram também tratados com 25 pM de piperina para determinar os efeitos de doses baixas. Após o tratamento, as células foram lisadas com tampão de amostra de solubilização e submetidas a SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose para análises de Western blot. Seguindo os anticorpos foram utilizados para imunoblotting. Anti-NF-kB (MBL International Inc.), anti-caspase-3 (eBioscience), anti-PARP-1 (SantaCruz Biotechnology), anti-STAT-3 e anti-fosfo STAT-3 (Cell signaling Technologies), anti -PSA (Thermo Fisher), anti-receptor andrógeno (Sigma Aldrich) e anti-actina β-peroxidase de anticorpos (Sigma Aldrich) foram utilizados com diluições recomendadas pelo fornecedor. As células tratadas com DMSO a 0,1% solvente serviram como controlos.

Boyden ensaio de câmara de

LNCaP e PC-3 foram semeadas em um (Corning) câmara TRANSWELL®, tratou-se e incubou-se com concentrações de piperina 60 uM e 75 uM, respectivamente, durante 24 h. As células foram, em seguida, removido a partir do topo da membrana utilizando uma pipeta e as células restantes foram removidos usando um Q-tip. A HEMA 3 coloração definir a partir de Fisher Scientific foi usado para fixar e corar as células. Após isso, cada membrana foi enxaguada com água e a mancha remanescente foi removido a partir do topo de cada membrana utilizando um Q-tip. As membranas foram analisadas para a migração de células utilizando um microscópio de luz (Nikon).

Animais

6 semanas ratos nus masculinos velhos pesando aproximadamente 20 gramas foram mantidos no Biotério da Universidade de Illinois em Rockford college of Medicine. Todos os procedimentos experimentais com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Illinois em Rockford College of Medicine. LNCaP (5 × 10

6) e DU145 (1 × 10

6) células suspensas em volume igual de Matrigel foram injectadas subcutaneamente para as regiões de flanco dos ratinhos nus machos e os tumores foram deixados crescer. Uma vez que o tumor atingiu 50 mm

3 em tamanho, os murganhos foram tratados diariamente com piperina (100 mg /kg) homogeneamente preparado de óleo vegetal através de injecções intraperitoneais, durante 1 mês. grupo de controlo foram injectados com óleo vegetal sozinho. Os efeitos da piperina no crescimento do tumor da próstata em ratinhos nus foram também testados por administração gavagem oral como descrito anteriormente [10]. Para o estudo gavage, as células LNCaP (7 × 10

6) suspendend em matrigel foi implantada subcutaneamente em ratinhos nus. Após 24 horas após a implantação de células LNCaP, os ratinhos foram tratados diariamente com piperina (10 mg /kg de peso corporal) preparada em PBS por sonda oral. Os animais de controlo receberam PBS tratamento gavage sozinho. Após um mês de tratamento, os ratinhos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono, seguido por sangria e os tumores foram excisados ​​e mediu a massa e o volume. Os volumes dos tumores foram calculados pela fórmula: [volume = 0,5 x (largura)

2 × comprimento. O acima

in vivo

experimento foi em concordância com CHEGAR orientações [11].

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada com Graph Pad Prism 5 software. Os dados foram comparados pelo teste t de Student. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

piperina inibe a proliferação e induz a morte em ambos os andrógenos dependentes (AD) LNCaP e de andrógenos (AI) DU145, 22RV1, PC 3 células independentes. vitro

em primeiro lugar, determinou os efeitos anti-proliferativa de piperina em células de carcinoma de próstata humanas, incluindo andrógeno sensível (LNCaP) (Figura 1A) e andrógeno insensíveis (PC-3, 22Rv1, DU-145 células: Figura 1B- 1D). As células foram tratadas com (5-200 uM) piperina durante 24, 48, 72 horas. O tratamento de células LNCaP (AD) e células PC-3 (IA) com piperina resultou na redução significativa de proliferação ou viabilidade de uma maneira dependente da dose com um valor de IC-50 valores de 60 uM e 75 uM, respectivamente, tal como avaliado por MTT. No caso de 22Rv1 e DU-145 células de cancro da próstata, o tratamento com piperina exibiram elevados valores de IC-50 de 110 uM e 160 uM, respectivamente. Assim, a piperina parece ser capaz de exercer um nível diferencial de efeitos citotóxicos, dependendo do tipo de células de cancro da próstata com células de cancro da próstata dependentes de androgénio (LNCaP) sendo o mais sensível. Os valores de IC50 obtidos a partir deste ensaio de viabilidade celular resultados foram utilizados para avaliar os efeitos da piperina em células de cancro da próstata em experiências subsequentes.

piperina inibe a proliferação de células de LNCaP, PC-3, DU-22RV1 e 145 com um IC50 de cerca de 60 uM, 75 uM, 110 uM e 160 uM nas respectivas células de cancro da próstata. Os resultados mostraram que a piperina proliferação de ambas as células de câncer de próstata independentes derivado de andrógenos (PC-3, 22Rv1 e DU145) dependentes de andrógeno (LNCaP) e em um tempo e forma dependente da dose inibida. Os dados apresentados são representativos de um dos três experimentos semelhantes.

tratamento piperina reduz próstata níveis Antigénio Específico (PSA) em células LNCaP

PSA é o marcador padrão-ouro utilizado no diagnóstico e monitoramento a eficácia do tratamento do cancro da próstata. Nossos estudos iniciais mostraram que as células LNCaP AR-positivos foram sensíveis ao tratamento piperina. A piperina no tratamento de concentração 75 ^ M inibiu significativamente a secreção de PSA para próximo nível normal (4,244 ng /ml) em comparação com células não tratadas LNCaP (41,24 ng /ml) (Figura 2). Curiosamente, a piperina numa gama de dose baixa de 25? M a 60 ^ M também teve um impacto significativo sobre a secreção de PSA a partir de células LNCaP.

PSA resultados do ensaio mostraram que a piperina possui efeitos dependentes da dose na secreção de PSA (alvo a jusante de AR) em células LNCaP. . * P 0,05 comparado com o controlo de células LNCaP

A piperina induz a apoptose em células de PCA: análise de coloração de anexina V-FITC e ensaio de activação da caspase

Para determinar se a redução na proliferação e a viabilidade celular das células de cancro da próstata por piperina foi associada com a indução de apoptose, as células LNCaP foram tratadas com diferentes concentrações de piperina e o número de células apoptóticas foi avaliada utilizando a anexina V- apoptotis kit de detecção, como descrito anteriormente [12]. As células LNCaP foram tratadas com 60 pM ou 75 pM de piperina durante 24 h e coradas com iodeto de anexina V-FITC e de propídio para visualizar as células em microscópio fluorescente. análise microscópica fluorescente demonstraram que as células LNCaP tratadas com piperina resultou num aumento do número de células apoptóticas em comparação com células de controlo de LNCaP (Figura 3) de uma forma dependente da dose (60 uM e 75 uM, respectivamente). Com base nos resultados acima, no qual foi determinada a concentração da piperina na inibição da proliferação das células e indução de apoptose, foram selecionados piperina uma concentração de 60 uM para mais estudos mecanicistas com as células LNCaP.

anexina-V- FITC coloração das células LNCaP que mostra células tratadas com piperina foram positivos para a ligação de anexina V evidente a partir do sinal de fluorescência. A seta indica a coloração de células positivas para a Anexina-V. As células apoptóticas foram quantificados com base no número de células positivas para a coloração de anexina-V em comparação com células totais presentes em cada campo. Os resultados mostram que aumentando as concentrações de piperina levou a um aumento da apoptose, como mostrado na Tabela 1 na Figura 3. Os resultados representativos de um de três avaliações independentes.

Além de Anexina-V-coloração, nós analisados ​​apoptose em células LNCaP e células PC-3 por ensaio de activação global da caspase. Caspase é um marcador útil e fiável para a apoptose. Por conseguinte, analisada a sua activação em LNCaP e PC-3 linhas celulares de CaP após o tratamento com piperina por ensaio de activação da caspase global, utilizando a sonda de poli-caspase-fluorescentemente marcado (Figura 4). As células foram incubadas com 50-200 uM de piperina em diferentes pontos de tempo (24, 48, 72 horas). Ambos LNCaP e PC-3 de células tratados com piperina resultou no aumento da activação de caspase. O aumento na activação da caspase em células LNCaP foi de uma maneira dependente da dose e do tempo enquanto que PC-3 exibiram consistentemente elevados níveis de activação de caspases, tanto a concentração e em todos os pontos temporais com excepção às 48 horas, em que a activação da caspase pareceram diminuir e aumentar mais uma vez. Isto pode ser devido a sensibilidades diferentes das células durante vários pontos de tempo. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a apoptose induzida por piperina em ambos LNCaP e células através da activação de caspase-3 PC.

Um NIR-FLIVO sonda de poli-caspase-747 conjugado, o qual é um detector fluorescente de células-permeável de caspases ativos, foi empregada para determinar se a piperina ativa a caspase em células de câncer de próstata. As linhas celulares LNCaP e PC-3 foram tratados com piperina e, em seguida, testados para a activação de caspase. Os resultados mostraram que a piperina induziu activação de caspase global em ambos LNCaP (A) e células PC-3 (B) tão cedo quanto 24 horas. Experimentos foram repetidos quatro vezes e obteve resultados semelhantes, como mostrado nesta figura representativa

análise de Western blot:. Tratamento piperina ativa a expressão de caspase-3 e se unirá PARP-1