Abstract

O câncer de próstata é o segundo câncer mais comumente diagnosticado em homens em todo o mundo. Sabe-se pouco sobre o papel dos cílios no cancro da próstata pré-invasiva e invasiva. No entanto, a expressão reduzida dos cílios foi observada em cancros humanos incluindo cancro do pâncreas, carcinoma de células renais, cancro da mama, colangiocarcinoma, e melanoma. O objetivo deste estudo foi caracterizar a expressão cílios no cancro da próstata humana pré-invasiva e invasiva, e a investigar a correlação entre cílios e a via de sinalização Wnt. tecidos da próstata representante humano de estágios de formação de câncer de próstata (próstata normal, neoplasia intraepitelial prostática (PIN), e câncer de próstata invasiva (incluindo invasão perineural)) foram coradas para proteínas ciliares. Foi determinada a frequência dos cílios. Uma diminuição da percentagem de células ciliadas no PIN, cancro invasivo e lesões perineural foi observada quando em comparação com o normal. comprimentos cílios também foram medidos para testar indirectamente funcionalidade. Cilia eram mais curtos no PIN, câncer e lesões invasão perineural, sugerindo disfunção. cílios foram mostrados para suprimir a via de Wnt. O aumento da sinalização de Wnt tem sido implicado no cancro da próstata. Portanto, nós investigamos uma correlação entre a perda de cílios e aumento da sinalização de Wnt na próstata normal e no câncer de próstata pré-invasiva e invasiva. Para investigar a sinalização de Wnt na nossa coorte, as secções de tecido em série foram coradas para β-catenina como uma medida da sinalização de Wnt. Nuclear β-catenina foi analisada e a sinalização de Wnt foi encontrada para ser mais elevada em células não-ciliadas na próstata normal, PIN, um subconjunto de cancros invasivos, e perineural. Os nossos resultados sugerem que os cílios normalmente funcionam para suprimir a via de sinalização Wnt em células epiteliais e que a perda dos cílios pode desempenhar um papel no aumento da sinalização de Wnt, em alguns cancros da próstata. Estes resultados sugerem que os cílios são disfuncionais no câncer de próstata humano, e aumentar a sinalização de Wnt ocorre em um subconjunto de cancros

Citation:. Hassounah NB, Nagle R, Saboda K, Roe DJ, Dalkin BL, McDermott KM (2013 ) primária Cilia se perdem na pré-invasiva e invasiva do cancro da próstata. PLoS ONE 8 (7): e68521. doi: 10.1371 /journal.pone.0068521

editor: Vladislav V. Glinskii, Universidade de Missouri-Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de março de 2013; Aceito: 30 de maio de 2013; Publicação: 02 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Hassounah et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciência de Arizona (https://www.sfaz.org), o Grant Biologia do Câncer Formação (NIH; T32CA009213), da Universidade do Arizona Cancer Center suporte Grant (NIH; P30CA023074), um R00 (NIH- NICHD; R00HD056965); eo melhor que nunca Foundation (https://azcc.arizona.edu/outreach/bte). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cílio primário é um organelo à base de microtúbulos que se projecta a partir da membrana plasmática e age como um “antena” para detectar sinais extracelulares. cílios são geralmente immotile mas pode sentir sinais físicos e químicos. As células com cílios ter apenas um único cílio estendendo-se desde a superfície da célula. Na base do cílio primário é o corpo basal (também conhecido como a mãe centriole), que é ancorado à membrana plasmática. O corpo basal nucleia os feixes de microtúbulos que se estendem até o cílio (Figura 1A). Centenas de proteínas foram identificadas que compõem o cílio primário [1]. Muitas destas proteínas para localizar o cílio para regular as funções sensoriais ou de sinalização do cílio primário. Cilia agir como antenas através de sensoriamento sinais extracelulares e ajudam a regular a sinalização celular; Por exemplo, os cílios são reguladores negativos da via Wnt [2,3]. Especificamente, cílios amortecer a resposta de sinalização Wnt por compartimentar proteínas de sinalização Wnt, como o regulador positivo Jouberin [3]. Cilia têm um papel demonstrado na biologia do desenvolvimento e das doenças humanas conhecidas como ciliopathies (por exemplo, síndrome de Joubert (JBTS), doença policística dos rins (PKD), síndrome de Bardet-Biedl (BBS), e nefronofitíase (NPHP)) [4].

Imagens de (A) cancro da próstata próstata normal e (B) invasiva. Serialmente lâminas adjacentes foram coradas com H E para visualizar a morfologia do tecido ou manchado fluorescente para núcleos (Hoechst; azul), cílios (Ac-Tub, vermelho) e centrossomas (γ-Tub, verde). Estruturas identificadas são lúmen (Lum), câncer (Ca) e estroma (Strm). Inserção mostra a ampliação de (A) um cílio primário em uma célula epitelial normal e (B) um centrossoma sem um cílio em uma célula de cancro. Asterisco denota coloração inespecífica (C, em cima). gráfico de caixa da percentagem de células epiteliais e de cancro ciliadas por paciente para cada tipo de tecido: normal, próstata neoplasia intra-epitelial (PIN), câncer (Ca) e invasão perinerual (Peri). linha laranja e flecha correspondem a Q4 (quartil 4; maior do que a 75

percentil para o tecido normal) e linha azul e flecha correspondem a Q1 (quartil 1; inferior ou igual a 25

percentil para o normal tecido). As estatísticas foram realizadas por meio de regressão linear (*** = p 0,001) (C, inferior). A percentagem de doentes com um por cento cílios anormalmente elevado (Q4; laranja) ou um cílios anormalmente baixa percentagem (Q1; azul). (D) por cento das células cancerosas invasivas Ki67 positivas e células cancerosas invasão perineurais por paciente (eixo x) versus percentagem de células cancerosas ciliadas para o mesmo paciente (eixo y). A análise estatística foi uma correlação de Spearman não paramétrica.

Cilia também desempenham um papel causal na tumorigênese [5,6]. modelos de rato demonstram que em alguns contextos cílios são necessários para promover o cancro, enquanto em outros ambientes perda dos cílios aumenta a incidência de tumores. cílios expressão reduzida foi observada em cancros humanos incluindo cancro do pâncreas, carcinoma de células renais, cancro da mama, colangiocarcinoma, e melanoma [7-11]. Estes estudos suportam a hipótese de que o cílios possa agir como um organelo supressor de tumor em alguns tecidos. Perda de cílios foi ainda demonstrada em neoplasia intraepitelial pré-malignas do pâncreas, sugerindo que a perda dos cílios ser necessário para ocorrer cedo para permitir a formação de cancro pancreático [10].

A frequência e a funcionalidade dos cílios no pré-invasivo humano e invasiva cancro da próstata não foi cuidadosamente caracterizado. O câncer de próstata é o segundo câncer mais comumente diagnosticado ea sexta maior causa de mortes relacionadas ao câncer em homens em todo o mundo. A via de sinalização Wnt canónica tem sido implicado no cancro da próstata humana, mas o papel desta via no cancro da próstata não está totalmente compreendido. O presente estudo tem como objetivo caracterizar frequência cílios e função no câncer de próstata humano e examinar a correlação entre a expressão cílios e sinalização Wnt. Nós demonstramos que a frequência de cílios é diminuído em todos os estágios do câncer de próstata, a partir de lesões pré-invasivas precoces para estágios invasivos. comprimentos de cílios são também diminuiu no cancro da próstata pré-invasiva e invasiva, sugerindo perda de função. Nós ainda demonstram que a ausência cílios se correlaciona com um aumento de localização nuclear β-catenina no tecido da próstata normal e β-catenina nuclear é regulada positivamente em PIN, um subconjunto de cancros da próstata, e áreas perineural.

Materiais e Métodos

amostras de tecidos humanos

Todas as amostras de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina foram obtidas a partir do tecido Acquisition and Cellular /Molecular Análise de Serviços compartilhados (TACMASS) da Universidade do Arizona Cancer Center. amostras de tecido de prostatectomia foram adquiridos a partir de pacientes submetidos à prostatectomia radical aberta a partir de 2006 a 2009. Tecido de apenas um paciente foi adquirido através de ressecção transuretral da próstata. Para o tecido da próstata, um total de 32 blocos de 25 casos foram escolhidos com base na presença das zonas de interesse, as quais foram identificadas por um patologista olhando para a hematoxilina arquivado e eosina (H E) corrediça tecido -stained para cada bloco de tecidos . Dos 25 casos, 23 casos tiveram um câncer localizado no bloco de tecido. Em sete casos, dois blocos de tecido foram utilizados a partir de um mesmo paciente para obter todas as áreas de tecido de interesse. Tissue microarray (TMA) escorregas também foram utilizados a partir de tecido adquirido a partir de pacientes submetidos à prostatectomia radical aberta, de 1992 a 2001. As lâminas Cinco TMA contendo ~ foram utilizados 54 núcleos (1 mm cada) por lâmina. Cada amostra foi representada quatro vezes entre o TMA desliza com três núcleos de tecido tumoral e um núcleo de tecido normal. A partir das corrediças de TMA, núcleos de tecido a partir de um total de 53 pacientes foram escolhidos com base na presença de tecido utilizáveis ​​com o cancro e /ou lesões perineural. Do tecido TMA dos 53 pacientes, um paciente teve apenas lesões invasão perineural. Para todas as amostras de tecido de próstata descrito, um único urologista realizadas as cirurgias. Os dados dos pacientes e clínicos também foi obtida para a maioria dos pacientes, incluindo a idade no momento da cirurgia, o estágio do tumor patológico, os níveis pré-operatórios de próstata livre antígeno específico (PSA), recorrência bioquímica, tempo de recorrência bioquímica, a penetração capsular e maior volume do tumor. consentimento por escrito foi dado pelos pacientes para a sua informação a ser usado para a pesquisa. A recorrência bioquímica foi definida como soro PSA livre 0,1 ng /ml para a duas medições consecutivas. A gama de o período de tempo entre a cirurgia e último follow-up é de 10 meses a 16 anos. Patologicamente normais, tecidos da próstata livres de câncer de 10 pacientes foram utilizados como controle e foram obtidas de pacientes com câncer de bexiga que se submeteram cystoprostatectomies.

secções de tecido de série foram cortadas para cada amostra. A primeira seção de série foi manchado para a H E e a secção de tecido inteiro foi digitalizado com um objetivo 20x utilizando o scanner de slides DMetrix automatizado (DMetrix, Inc.). As imagens digitais foram anotados utilizando o software ocular (DMetrix, Inc.) por um patologista certificado para cada uma das áreas de interesse por lâmina de tecido. Para toda a coorte, as áreas de interesse utilizados foram os seguintes: próstata patologicamente normal a partir de doentes com cancro da bexiga (n = 10), patologicamente próstata normal adjacente ao cancro (n = 16), hiperplasia benigna da próstata (BPH; n = 8), neoplasia prostática intra-epitelial (PIN; n = 24), PIN de baixo grau (LG PIN; n = 13) e PIN de alto grau (HG PIN; n = 18), de baixo grau (LG; soma Gleason = 6; n = cancros 35) e de alta qualidade (HG; lesões n = 40) e invasão perineural (n = 18); Gleason soma de pontuação de 6. Todos os tipos de tecido foram retiradas das prostatectomias radicais, excepto para o tecido da próstata normal de patologicamente de doentes de cancro da bexiga (estes eram de cystoprostatectomies). Sete pacientes tiveram tanto LG (aumento do tamanho nuclear nuclear-a-citoplasmática ratio, e aumentou) e HG (presença de nucléolo proeminente, aumento do tamanho nuclear nuclear-a-citoplasmática ratio, e aumentou) PIN. Gleason pontuação soma é um método de classificação utilizado para avaliar o grau de diferenciação [12]

Imunofluorescência

A série de slides de tecidos à H . Slides E-manchado foi utilizado para co-coloração cílios, centrossomas e citoqueratina 5 (CK5). lâminas de tecido embebidas em parafina foram desparafinizadas numa incubadora seco a 65 ° C durante 15 minutos e hidratado por lavagem com xileno (2 x 10 min), isopropanol a 100% (2 x 10 min), isopropanol a 70% (2 x 10 min) , 50% de isopropanol (2 x 10 min), e água ultrapura (2 x 10 min). Todas as lavagens foram à temperatura ambiente. recuperação de antigénio com uma solução de EDTA a 1 mM desmascaramento foi realizada utilizando um 2100 retriever (Electron Microscopy Sciences) de acordo com as instruções do fabricante. lâminas de tecido foram colocados em Shandon Coverplates (Thermo Scientific, Cat # 72-110-017) e depois para Sequenza Deslize Racks (Thermo Scientific, Cat # NC0263065). lâminas de tecido foram bloqueadas com tampão de Diluição de Anticorpo ChemMate (Ventana Medical Systems, Inc., Cat # ADB250) com soro de cabra (5%) (Invitrogen Corporation, Cat # 16210-064) durante 45 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos primários e secundários foram diluídas no tampão de diluição ChemMate anticorpo a 1: 1000. Os anticorpos primários foram usadas contra tubulina acetilada (monocloncal rato IgG

2B, Sigma, Cat # T7451, clone 6-11B-1), γ-tubulina (IgG1 monoclonal de rato, Sigma, Cat # T5326, clonar GTU-88), e (policlonal de coelho, Abcam, Cat # ab24647) CK5, e incubou-se sobre o tecido durante a noite a 4 ° C. Cinco lâminas foram coradas com outro anticorpo primário contra CK5 (pronto a utilizar monoclonal de ratinho IgG1, Leica Microsystems, Cat # CK5-R-7-CE) para verificar a especificidade do anticorpo CK5 utilizado. Uma próstata slides do tecido com áreas normais e cancerosos também foram coradas com um anticorpo primário contra Arl13b (monoclonal IgG

2 bis, UC, Davis /NIH NeuroMab Facility, clone N295B /66) para verificar a marcação de cílios com o anticorpo contra tubulina acetilada. As lâminas foram então lavadas com PBS durante 10 minutos (3 x 10 min). Os anticorpos secundários utilizados foram isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) marcado com cabra anti-IgG de ratinho

2B (Southern Biotech, Cat # 1090-1003), de cabra Alexa 633-anticorpos marcados anti-rato-IgG 1 (Invitrogen, Cat # A21126) , cabra Alexa 546 marcado com anti-IgG de ratinho

2-A (Invitrogen, Cat # A21133) e isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com cabra anti-coelho-IgG (Southern Biotech, Cat # 4052-02). Os anticorpos secundários foram incubados com o tecido durante 45 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas com PBS durante 10 minutos (3 x 10 min). Hoechst 33342 (Cat # H3570, Invitrogen) foi utilizado como um corante de contraste em 1: 1000 e incubou-se em lâminas durante 10 minutos, seguido por lavagem com PBS durante 5 minutos (2 x 10 min). As lâminas foram montadas com 1,5 lamelas (0,16-0,19 mm de espessura) (Fisher Scientific, Cat # 12-544B), utilizando Prolong Antifade Ouro de montagem de mídia (# P36934 Cat, Invitrogen).

imagem confocal

o slide tecido que estava em série ao lado do escaneados digitalmente H e lâmina foi fluorescente coradas para cílios, centrossomas, CK5 e Hoechst. A Leica TCS SP5 II varredura a laser microscópio confocal (Leica Microsystems) foi utilizado para a imagem dos slides fluorescente-manchada. Áreas de interesse foram encontrados usando uma objectiva de baixa potência de ampliação (10x, 0,4 PI Apo) para visualizar Hoechst counterstain no slide manchado de fluorescência e referenciando a H E que foi feito a varredura digital. Isto permitiu-nos para encontrar exatamente a mesma área de interesse que tinha sido anotada pelo patologista na H E. Uma vez que a área de interesse foi encontrado, pilhas Z foram então adquirida com o diodo de laser violeta a 405 nm para a detecção de coloração Hoechst com uma espessura total de 2 ± 0,5 fim, com uma Z-passo dado a cada 1 uM. Cilia foram então fotografadas dentro destas áreas de interesse usando um objetivo 63x (1,4 NA PL Apo) com os lasers de hélio néon (543 nm e 633 nm), CK5 foi fotografada com o laser de argônio (488 nm), eo diodo violeta laser (405 nm) foi utilizada para detectar coloração Hoechst. Z-pilhas foram adquiridas com uma espessura total de 5,0 ± 0,5 um, com uma Z-passo tomado cada 0,34 uM (resolução de imagem 2048×2048 pixels). Nós adquiriu uma gama de 1-6 imagens por local, utilizando o objectivo 63x por tipo de tecido por paciente e este variada dependendo do tamanho do local. imagens Z foram processados ​​pós-aquisição com as projeções máximas usando o software Leica LAS AF para análise de imagem.

análise de imagem confocal

comprimentos de frequência Cilia e cílios foram obtidos para cada tipo de célula usando o Leica LAS software de AF. Cilia foram só marcou quando ambos axonema ciliar e centrossoma eram visíveis juntos. Para cada tipo de célula [CK5 positivo (CK5 +) epitelial /células cancerosas, as células epiteliais /câncer (CK5-) CK5 negativos, e as células CK5-estromais], os núcleos foram contadas utilizando a ferramenta de contagem, e comprimentos de cílios foram medidos usando a barra de escala ferramenta. O número de cílios por tipo de célula foi dividido pelo total de núcleos por tipo de células para obter uma percentagem de células ciliadas. Pelo menos 171 núcleos foram contadas por tipo de tecido por paciente (max = 2770, mediana = 782). comprimentos de cílios medianos por paciente foram determinados e utilizados em dados e análises estatísticas. Boxplots ilustram os dados, em que a 75

e 25

percentis são marcados pelos limites superior e inferior da caixa, respectivamente. A linha preta dentro da caixa denota a mediana. Outliers são definidas como 25

percentil -1.5X intervalo interquartil, ou 75

percentil + 1.5x intervalo interquartil (círculos abertos). valores atípicos extremos foram definidas como 25

percentil -3X intervalo interquartil, ou 75

percentil + 3X interquartile alcance (círculos vendidos). Utilizamos dados obtidos sobre cento cílios e cílios comprimento encontrado em próstata normal, para estabelecer um ponto de corte para fornecer um ponto de comparação relativa aos cílios encontrados em amostras de PIN e câncer. Os 25

percentil superior e inferior foram escolhidos como nossos cortes normais relativos e este foi mantido consistente ao longo de nossa análise. A partir dos boxplots, a percentagem de pacientes com uma percentagem anormal de células ciliadas ou comprimento cílios mediana anormal foram calculados. Estas medições anormais foram definidos pelo th 75

e 25

th percentis de normal. Os valores foram considerados anormalmente elevada se eles caíram acima do 75

percentil do normal e anormalmente baixa se eles caíram em ou abaixo de 25

percentil do normal. Nada se sabe sobre comprimentos precisos de cílios necessários para a função normal. Portanto, o nosso superior e inferior 25

th corte percentil só fornecem um quadro de referência para a comparação ao normal.

Imunohistoquímica

lâminas de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina foram coradas com um semelhante Protocolo utilizado para imunofluorescência lâminas coradas descritos acima. A recuperação de antígenos foi realizada como descrito, mas com o vector de antigénio desmascaramento Solução (1: 106) (Vector Laboratories, Cat # H-3300), seguido de paragem da actividade da peroxidase endógena à temperatura ambiente durante 20 minutos, utilizando peróxido de hidrogénio em metanol (0,3% ). As lâminas foram então lavadas com PBS (4 x 10 minutos), colocado em Shandon Coverplates (Thermo Scientific, Cat # 72-110-017) e, em seguida, em Sequenza Deslize cremalheiras (Thermo Scientific, Cat # NC0263065). As lâminas foram então bloqueadas com 2,5% de soro normal de cavalo a um tampão de bloqueio (Vector Laboratories, Cat # S-2012) por 20 minutos, e em seguida com Tampão de Diluição de Anticorpo ChemMate (Ventana Medical Systems, Inc., Cat # ADB250) com soro de cabra (5 %) (Invitrogen Corporation, Cat # 16210-064) durante 45 minutos. Todas as lavagens e os passos de bloqueio foram à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram diluídos no tampão de diluição ChemMate anticorpo. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: p-catenina anticorpo primário (1: 400, monoclonal de ratinho IgG1, BD Transduction Laboratories, Cat # 610154) e Ki67 (1: 100, monoclonal de ratinho IgG1, Dako, Cat # M7240, clone MIB-1 ). Colon lâminas de tecido de adenocarcinoma foram usadas como controlo positivo para β-catenina e coloração de Ki67. lâminas de tecido com anticorpo secundário foram utilizados apenas como controlo negativo. Os anticorpos primários foram incubados sobre os tecidos durante a noite a 4 ° C. As lâminas foram então lavadas em PBS (3 x 10 min). Um anti-coelho universal, o anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com peroxidase (ImmPress Universal Reagente, Vector Laboratories, Cat # MP-7500) foi incubado sobre o tecido durante 30 minutos, seguido por uma lavagem em PBS durante 5 minutos. 3-amino-9-etilcarbazole (AEC) com elevada sensibilidade cromogénio substrato (Dako, Cat # K3461) foi utilizado como o substrato de peroxidase para β-catenina e coloração de Ki67. AEC foi incubada em lâminas durante 3 minutos para coloração β-catenina e 7 minutos, para a coloração de Ki67. lâminas de tecido foram enxaguadas com água destilada durante 5 minutos. Hematoxilina 1 (Thermo Scientific, Cat # 7221) foi usado para contracoloração das lâminas de tecido. Hematoxilina 1 foi diluído a 1: 3 e incubaram-se em lâminas de tecido durante 15 segundos e, em seguida, lavado em água da torneira até que a água ran claro. Faramount meios aquosos de montagem (Dako, Cat # S3025) foi utilizado para slides de montagem utilizando 1,5 lamelas (,16-,19 mm de espessura) (Fisher Scientific, Cat # 12-544B).

Imunohistoquímica análise

lâminas inteiras coradas para β-catenina foram digitalizados usando um scanner automatizado Dmetrix com ampliação de 20x (DMetrix Inc.). Lâminas coradas para Ki67 foram escaneados usando uma objetiva de 20x com o scanner BioImagene (Ventana Medical Systems). Os mesmos locais utilizados para a análise cílios foram encontrados por referência a H E slide. Estas áreas de interesse foram exportados como arquivos TIFF a partir dos ficheiros de digitalização Dmetrix, e como arquivos JPEG a partir dos ficheiros de digitalização BioImagene, e enviados para Definiens Tissue Studio 3.0 Software (https://www.tissuestudio.com). Tissue Studio 3.0 Software foi testado quanto à concordância absoluta com contagens manuais manuais realizadas por dois investigadores independentes. Imagens de seis de próstata normal e seis locais de câncer de próstata foram cegamente marcou para a coloração nuclear de Gli1, onde cada núcleo foi classificada como positiva ou negativa. Para cada imagem, Tissue Studio 3.0 foi usado em conjunto para quantificar o número de células /núcleos positivos e negativos. Um teste estatístico que é usado para medir a consistência acordo absoluto e das medições feitas por diferentes observadores (A correlação) foi aplicada aos dados obtidos para os seis tecidos normais e cancerosas da próstata. O coeficiente de correlação intraclasse foi determinada como 0,7, usando SPSS 19 (Statistical Package for the Social Sciences; IBM Corporation)., Que é considerado forte acordo

Para a análise Ki67, algum tecido do paciente não pode ser usado para a análise devido para muitos cortes seriados em falta entre o slide Ki67-coradas e da H e de slides, tornando impossível para localizar a área exata usada para análise cílios. O número de pacientes utilizados para o câncer foi de 72, eo número de pacientes usados ​​para a invasão perineural foi 15. Para a análise Ki67 com Definiens Tissue Studio, um Núcleos modificado (positivo /negativo) solução foi utilizada. Os epiteliais /câncer e estromais compartimentos de áreas cancerosas e invasão perineural foram analisados ​​separadamente usando a seleção ROI Manual (selecionar segmentos) ferramenta de segmentação, com uma segmentação de 8. O hematoxilina e imuno limiar (IHC) foi fixado em 0,12 unidades arbitrárias (UA ) e 0,03 au, respectivamente. O limiar de IHC foi determinada por meio da identificação o mais leve núcleo positivamente coradas no conjunto da amostra e usando esse valor como ponto de corte para a positividade. Um passo Núcleo Morfologia e filtro foi usado para excluir objetos erroneamente identificados como núcleos. A partir dos resultados exportados, os índices positivos foram computadas por tipo de tecido por paciente.

Alguns tecido do paciente não poderia ser usado para a análise de β-catenina, devido à insuficiência de cortes seriados, ou demasiados cortes seriados em falta entre o β- catenin manchado de slides ea H e slide, o que torna impossível para encontrar o local exato. Para o normal, o número de locais utilizados foi de 26, a partir de 10 pacientes. Para PIN, o número de locais tinha 19 anos, a partir de 13 pacientes. Para o câncer, foram utilizados 154 localidades, de 64 pacientes. Para lesões perineural, o número de entradas usadas foi de 23, a partir de 11 pacientes. Para a análise β-catenina com Definiens Tissue Studio, a porcentagem e intensidade da coloração nuclear no tecido epitelial e canceroso foi adquirida. O estroma foi excluído da análise, uma vez β-catenina é principalmente expresso em células epiteliais. Para a análise, foi usada uma solução Núcleos, membrana e células modificadas. A ampliação e resolução foi ajustado para 20x e 0,5 um /pixel, respectivamente. Uma seleção ROI Manual (Desenho de polígonos) foi utilizado para normal, PIN, câncer e áreas de invasão perineural para analisar separadamente o compartimento epitelial. Em células normais, basais, que foram identificados por posição, morfologia e de acordo com a secção de tecido em série ao lado manchado de CK5, foram selecionadas separadamente das células luminais para análise. Em PIN, câncer e lesões invasão perineural, o compartimento epitelial /câncer toda foi selecionado para análise. Depois foram selecionados regiões de interesse, núcleos e células separadas foram identificados manualmente usando parâmetros e limites definidos, seguido de classificação de núcleos com base em limites definidos manualmente. Para identificar os núcleos e as células, “membrana” foi escolhido para o marcador de IHC. Para a detecção de núcleo, limiares hematoxilina e IHC foram fixados em 0,055 unidade arbitrária (u.a.) e 1,02 u.a., respectivamente. Para a detecção de células e membranas, o limiar de IHC foi definido como 0 A.U., e a espessura da membrana a um pixel. limiares de classificação núcleos foram criados para classificar um núcleo como tendo quer não, baixa, média ou alta coloração imuno-histoquímica. Esses limites foram escolhidos individualmente, com base em slides de uma amostra de tecido da próstata de controle usado em cada coloração, identificando a coloração nuclear mais escura e mais leve. A coloração mais leve foi utilizado para definir o limiar não /baixa coloração, a maior coloração foi utilizado para a média /alta limiar, e o valor entre esses dois valores limiares foram utilizadas para o limiar baixo /médio. Os limiares nucleares para não baixa coloração /variou 0,3-0,4 au, baixa coloração /médio variou 0,45-0,55 au e média /alta coloração variou de 0.6-0.7 au

A pontuação histológica foi calculada a partir da seguinte fórmula: 3X (% núcleo corado alta) + 2X (% núcleos médio manchado) + 1X (% núcleo corado baixo). A pontuação histológica foi determinada para cada local separado que tinha sido utilizado para a análise dos cílios, e esta foi representada graficamente versus a percentagem de cílios. Deve-se notar que existem vários locais por paciente, e isso foi levado em consideração durante a análise estatística.

A análise estatística

Percent células e comprimentos de cílios ciliados foram medidos para células individuais por participante e tipo de célula: CK5 +, CK5- e células estromais. gráficos de dispersão de cento ciliadas células e comprimentos de cílios revelou distribuições altamente distorcidas. Como resultado, as medianas são relatados nas tabelas de estatísticas de resumo. A significância estatística foi avaliada utilizando um modelo de regressão linear que agrupado em casos, a fim de controlar as várias observações por participante. As variáveis ​​dependentes foram log transformados para torná-los mais normal. As diferenças entre categorias diagnósticas foram obtidas por variáveis ​​indicadoras de montagem para cada diagnóstico. tendências lineares em gravidade do diagnóstico foi testado pelo ajuste diagnóstico como variável contínua. A correlação entre a percentagem cílios e Ki67 pontuação de cancro foi realizada utilizando uma correlação de Spearman não-paramétrico. As associações entre cento cílios e os dados do paciente foram quantificadas por meio de regressão linear. Análise para diferenças em β-catenina nuclear foi realizada por meio da correlação, regressão linear, e tabelas de dois-por-dois. Todas as análises foram realizadas no STATA (StataCorp). Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As análises estatísticas não controlam para comparações múltiplas.

Resultados

expressão cílios é diminuída no cancro da próstata pré-invasiva e invasiva

Para caracterizar a frequência dos cílios em diferentes gravidades de câncer de próstata humana, a presença cílios foi determinada para os diferentes tipos de tecidos: tecido livre do câncer normal, neoplasia intraepitelial prostática (PIN), câncer e lesões invasão perineural (ver Tabela 1 para detalhes). A primeira seção de série foi corada com H E para identificar áreas de normal, PIN, câncer e lesões invasão perineural. A H E lâmina foi usado como uma referência para localizar os tipos de tecido de interesse na secção de série adjacente, a qual foi corada para tubulina acetilada (Ac-banheira) para visualizar cílios e γ-tubulina (γ-banheira) para identificar Associated centrossomas (Figura 1A e 1B). frequência cílios e duração foram quantificados. Um total de 90,427 núcleos foram contadas com uma média de 20.782 núcleos contados por tipo de tecido e uma gama média de 248-1603 núcleos por paciente (Tabela S1A na Tabela S1).

N (%)

Idade no momento do diagnóstico (anos) n = 76 6020 (26,3) 60-6411 (14,5) 65-6926 (34,2) 70-7416 (21,1) 743 (3,9) Média = 65 média = 64 ± 7 Intervalo = 46-77Gleason soma scoren = 75635 (46,7) 7-1040 (53,3) PIN grau 24Low grade13 * n = (54,2) alta grade18 (75) Patológica stagen = 77pT1-pT225 (32,5) pT352 (67,5) Volume de maior tumor (cc) n = 25 3,08 (32) 3.0-6.09 (36) 6.1-9.04 (16) 9.1-122 (8) 122 (8) Média = 4 Média = 6,3 ± 8,3 Intervalo = 0.13-42Pre-operatório PSA livre (ng /ml)n=58 3.03 (5,2) 3.0-6.024 (41,4) 6.1-9.015 (25,9) 9.1-124 (6,9) 1212 (20,7) Média = 6,4 Média = 11,2 ± 20,4 Intervalo = recorrência 1.8-154Biochemical * * n = 78Yes44 (56,4) No34 (43,6) Tabela 1. Resumo do paciente e dados clínicos.

* Sete amostras de pacientes têm ambos PIN de alto grau (neoplasia intraepitelial prostática). baixo grau e ** a recorrência bioquímica definido soro tão livre PSA 0,1 ng /ml para a duas medições consecutivas. Tempo de uma cirurgia para durar medições PSA registrados para pacientes sem intervalos recorrência bioquímica de 12,5 meses para 15,2 anos e para os doentes com recidiva o tempo de cirurgia para faixas de recorrência bioquímica de 1,3 meses a 13 um ano. CSV Baixar CSV

Perda de cílios foi observada em amostras de pré-invasivas da próstata (PIN; baixo grau (LG) e de alta qualidade (HG), combinada). A percentagem média de células epiteliais ciliadas no PIN (mediana = 5,7%) diminuiu 36% em comparação com células epiteliais normais (mediana = 8,9%; p = 0,24; Figura 1C, superior e Tabela S1A na Tabela S1). Enquanto isso não é uma diferença estatisticamente significativa, 70,8% das amostras de PIN teve um anormalmente baixo (queda igual ou inferior a 25

percentil de Q1 normal,) porcentagem de células epiteliais ciliadas (Figura 1C, inferior e Tabela S1B em tabela S1). Também houve uma tendência linear significativa geral para a diminuição da percentagem dos cílios com o aumento da gravidade do cancro da próstata (p 0,0001; Tabela S1A na Tabela S1). Embora este modelo pressupõe o aumento da gravidade do normal, PIN, câncer invasivo, e em seguida à invasão perineural, reconhecemos que nem todos os cancros se desenvolvem nessa sequência. Note-se que a separação das amostras de PIN em grupos LG e HG não revelou uma diferença estatisticamente significativa na percentagem de células ciliadas ao longo do estudo, de modo LG e HG PIN não foram separados para posterior cento cílios analisa.