Abstract

Fundo

Um dos maiores desafios no tratamento do ducto pancreático adenocarcinoma é o fracasso da quimioterapia, que é provavelmente devido à presença das células-tronco cancerosas (CSCs).

Objectivo

para identificar população lado células (SP) e caracterizar as propriedades s-like em linhas celulares de cancro pancreático humano (h-PCCLs) e explorar a eficácia da segmentação concomitante de vários fatores de transcrição chave que regem a stemness de CSCs pancreáticas na supressão fenótipos CSC-like.

Métodos

a citometria de fluxo e ensaio de efluxo de Hoechst 33342 de ligação ao ADN de corante foram usadas para classificar as células não-SP (PEN) a partir de SP e três h-PCCLs: PANC-1, SW1990, e BxPC-3. Foram avaliadas a capacidade de auto-renovação, invasão, migração e drogas resistência das células SP. foi analisada a expressão de genes marcadores CSC. Tumorigenicidade foi avaliada utilizando um modelo de xenoenxerto em ratinhos nus. Efeitos de um oligonucleotídeo chamariz complexo (cdODN-SCO) projetado para segmentação simultaneamente Sox2, Oct4 e c-Myc foram avaliados.

Resultados

CSCs foram enriquecidos na proporção lado (SP) células continham na h-PCCLs e que possuíam propriedades de crescimento, invasão, migração e de resistência a drogas agressivas, em comparação com células NSP. células SP overexpressed marcadores de células-tronco CD133 e ALDH1, pluripotência mantendo fatores Nanog, Sox2 e Oct4, oncogénico fator de transcrição c-Myc, molécula sinalizadora Notch1, e ABCG2 gene resistente aos medicamentos. Além disso, as células SP demonstraram consistentemente significativamente maior do que a tumorigenicidade em células NSP modelo de xenoenxerto de murganhos sem pêlo. CdODN-SOC suprimido eficazmente todas as propriedades CSC e fenótipos, e minimizou a capacidade tumorigénica das células SP e da resistência à quimioterapia. Em comparação, o controle negativo não conseguiu fazê-lo.

Conclusão

Os resultados indicam que a segmentação principais genes que conferem o stemness de CSCs pode eficientemente eliminar fenótipos CSC-like, e, portanto, pode ser considerado uma nova abordagem para a terapia do cancro. Especificamente, o presente estudo estabelece a combinação de Sox2 /Oct4 /c-Myc segmentação como um potencial agente anti-cancro pancreático merecedoras de estudos posteriores em configurações pré-clínicos

Citation:. Wang X, Liu Q, Hou B, Zhang W, Yan H, H Jia, et al. (2013) Segmentação concomitante de múltiplos fatores-chave de transcrição efetivamente interrompe células-tronco cancerosas enriquecido em Side população de células do cancro do pâncreas humano. PLoS ONE 8 (9): e73942. doi: 10.1371 /journal.pone.0073942

editor: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Reino Unido

Recebido: 19 Abril, 2013; Aceito: 24 de julho de 2013; Publicação: 11 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC), conhecido pela sua agressividade na natureza, é um tumor maligno altamente letal que é geralmente diagnosticado numa fase tardia para os quais as opções terapêuticas óptimas foram ignorados [1]. O mau prognóstico pode ser explicado pela detecção tardia do processo neoplásico, a falta de tratamento eficaz, e conhecimento limitado às suas características biológicas. Assim, melhor compreensão das propriedades celulares /moleculares associados a esta condição é urgentemente necessária para explorar novos locais de diagnóstico e tratamento desta doença sombrio.

Novas evidências sugerem que os tumores malignos são compostas de um pequeno subconjunto de distintas células de cancro, denominado “cancro de células estaminais” (CSCs), tipicamente menos do que 5% do total de células de cancro com base na expressão do marcador de superfície celular [2-6]. CSCs são encontradas numa sub-população de células que é distinta da população principal dentro de tumores ou cancros hematológicos, chamadas de células “side population” (células SP) que exibem características semelhantes a células estaminais. CSCs possuem a capacidade de auto-renovação e de gerar linhagens de células cancerosas heterogéneas que compreendem o tumor; eles são, portanto, tumorigénico, em contraste com outras células de cancro não tumorigénicas, e são factores essenciais para a progressão do tumor e metástases. Clinicamente ainda mais importante, no entanto, é o facto de os CSCs também confere virulência através de evasão do sistema imunitário e resistência a múltiplos fármacos para quimioterapia e radioterapia resultante no seu enriquecimento relativo durante o tratamento e rápida recaída da doença [2-6]. A eficácia dos tratamentos contra o cancro é frequentemente medido pela fração de ablação da massa tumoral, e quimioterapias convencionais matar células diferenciadas ou de diferenciação, que formam a maior parte do tumor, mas são incapazes de gerar novas células. Como CSCs formar uma proporção relativamente pequena do tumor, eles poderiam permanecer un-atacada, causando uma recaída da doença. Portanto, o desenvolvimento de terapias específicas dirigidas às CSCs detém uma grande esperança para a melhoria da sobrevida e qualidade de vida de pacientes com câncer, especialmente para quem sofre de doença metastática.

CSCs foram identificados em PDAC e linhas celulares de cancro do pâncreas por vários laboratórios [7-14]. CSCs pancreáticas humanas que expressam elevados níveis de CD133, CD24, CD44, ESA, e aldeído desidrogenase (ALDH1) também têm mais abundante Nanog, Oct4, Notch1, MDR1 e ABCG2 de tecidos pancreáticos normais e células de câncer pancreático primário [10-12,14, 15]. Parece que PDAC não só contêm uma população homogénea de CSCs em vez de diversas subpopulações que podem ter evoluído durante a progressão de tumores, baseados na utilização de combinações de marcadores de superfície que permitem que o seu isolamento, propagação, e posterior caracterização. Uma dessas populações é chamado de migração de CSCs e essas células são capazes de fugir do tumor primário e viajar para locais distantes como o fígado como o local preferido de propagação metastática.

Portanto, tratamentos bem sucedidos de cânceres não só confiar a identificação da fonte das células cancerosas e terapia anticancro para as células cancerosas diferenciadas, mas também em encontrar população potencial CSC e atingindo suficiente destruindo dos CSCs do tumor. Na verdade, as abordagens CSC-alvo têm demonstrado uma grande promessa em modelos pré-clínicos [2-6]. Estas abordagens incluem estratégias diretas, como a ablação, visando marcadores moleculares de CSCs ou caminhos específicos do CSC, reversão de mecanismos de resistência e terapia de diferenciação e estratégias indiretas, como a terapia antiangiogênica, abordagens de imunoterapia, e ruptura de interações protumorigenic entre CSCs e seu microambiente.

O presente estudo foi realizado para atingir os seguintes dois objetivos primários. Em primeiro lugar, para ter uma caracterização completa das populações CSC em linhas celulares de cancro pancreático humano, foram comparadas as células SP em BxPC-3, linhas PANC-1 e de células SW1990. Em segundo lugar, para explorar a possibilidade de atingir simultaneamente vários factores de transcrição que regulam a stemness de CSCs pancreáticas para interromper CSCs assim tumorigênese e metástase, foi elaborado um fragmento de oligonucleotídeos engodo pela “um agente, múltiplos alvos” conceito e testou a eficácia desta molécula para o silêncio stemness de CSCs pancreáticas.

Materiais e Métodos

Ética declaração

o utilizadas de todos os animais deste estudo foi aprovado pelo, e todos os procedimentos operatórios e cuidados com os animais estritamente conformado com directrizes estabelecidas pelo, o Comitê de Ética animal da Universidade de Medicina de Xinjiang ea Yat-sen University do Sol.

cultura celular

as linhas celulares de cancro pancreático humano BxPC-3, PANC-1 e SW1990 originalmente estabelecida a partir de adenocarcinoma pancreático primário humano, ATCC foram adquiridos a partir de Xangai Cell Bank (Xangai, China) e propagadas em nosso laboratório. Todas as linhas celulares foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). O meio foi suplementado com 1% de penicilina /estreptomicina, 3 mM de L-glutamina, e soro bovino fetal a 10% (FBS) (Gibco). As células foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C que contém 5% de CO

2.

A citometria de fluxo e análise de separação de células

células SP é um pequeno grupo de células que coram fracamente ou não em todos, quando tratados com Hoechst 33342 dye. Estas células podem ser isoladas utilizando citometria de fluxo protocolos estabelecidos inicialmente por Goodell et ai. em um estudo de medula óssea murina [16,17]. H-PCCLs foram destacadas da placa de cultura com tripsina a 0,25%, lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS), e suspensas a 1 x 10

6 células /ml em meio de cultura contendo 2% de FBS. As células de tumor e as linhas celulares foram incubadas com Hoescht 33342 corante (Sigma-Aldrich) a uma concentração final de 5 ug /ml com ou sem o verapamil (100 uM, Sigma-Aldrich) a 37 ° C durante 90 min com intermitente agitação cada 15 min. O verapamil foi utilizado para verificar o fenótipo SP, uma vez que pode reduzir o ramo lateral ao bloquear os transportadores multidrogas. Depois lavou-se duas vezes com PBS, as células foram ressuspensas em PBS gelado contendo 2% de FBS, passados ​​através de um filtro de malha de 40 uM para se obter suspensões de célula única, e mantidas em gelo até a análise de citometria de fluxo. iodeto de propídio (PI; 2 ug /mL; Sigma-Aldrich) foi adicionada a etiquetar e excluir as células mortas. A análise celular e separação de células activada por fluorescência (FACS) foram realizados utilizando um FACS Vantage SE equipado com o software de versão 6.0 de FACS DIVA (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica). Hoechst 33342 dye foi animado por um laser ultravioleta de 350 nm e emissão de fluorescência foi duplo comprimento de onda analisado (azul Hoechst com filtro de 402-450 nm; Hoechst vermelho com 650-670 filtro nm).

A proliferação celular e ensaios do ciclo celular

mil SP classificados e não-SP células (NSP) foram semeadas em separado bem de uma placa de 96 poços em triplicado e cultivadas em meio L-15 com 1% de penicilina /estreptomicina e 10 de Leibovitz % de FBS durante 3 dias. O crescimento foi medido usando o método de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT). Resumidamente, 20 uL solução de MTT (5 mg /ml em PBS; Sigma) foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 4 h. Uma alíquota de 150 ul de DMSO-se, em seguida, adicionado, e a absorvância foi medida por um leitor de microplacas (Multiscan MK3, Thermo Labsystem, EUA) a um comprimento de onda de 490 nm.

Para o ensaio do ciclo celular, 5 × 10

5 células recentemente classificadas foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com 2 ml de etanol a 70% arrefecido em gelo a 4 ° C durante a noite. As células foram então transferidas para PBS, coradas com 20 ug /ml de PI e 1 mg /ml de RNase, e analisadas utilizando citometria de fluxo. Os resultados são expressos como a percentagem de células em cada fase do ciclo celular.

ensaios de formação de clones

Os passos seguintes foram aplicados para ensaios (1). Ágar (10 g /l; grau de DNA) foi fundida em forno de microondas e 2 × DMEM suplementado com 200 ml /l de FBS foi aquecida até 40

oC num banho de água. Volumes iguais destas duas soluções foram então misturados para produzir uma nova solução de 5 g /l de agar + 1 × DMEM + 100 ml /l de FBS (2). Em seguida, 1 ml de solução mista foi adicionada a cada poço de uma placa de 6 poços para formar a base de ágar (3). Em seguida, a 7 g /L de agar (grau de DNA) foi fundida em forno de microondas e arrefeceu-se a 40

oC num banho de água, e 2 × DMEM e 200 ml /l de FBS foram aquecidos à mesma temperatura (4). células SP recentemente classificados e não-SP foram passados ​​através de um filtro de 40 mícrons para proporcionar uma suspensão de células individuais e foram contadas. Três mL de DMEM, 1,5 mL de 2 × DMEM contendo 200 ml /l de FBS e 1,5 ml de agar incluindo 500 células separadas foram, então, misturados entre si, e uma suspensão de 1,5 ml de células desta solução foi colocado em cada poço de uma placa de 6 poços, como o ágar de topo (5). Finalmente, foram semeadas 100 células em cada cavidade, e foram incubadas a 37

° C em um incubador humidificado durante 2-3 semanas. As colónias eram ou não coradas esquerda, ou foram coradas com 5 g /l de MTT (Sigma-Aldrich) durante 1 h, e contadas sob um microscópio de dissecação (o processo foi repetido três vezes) (6). Após as células SP foram semeadas em ensaios de agar mole, as colónias contendo mais de 50 células de colónias (primário) foram removidos do agar mole com pipetas de Pasteur estéril, tratadas com tripsina e dissociadas mecanicamente em células individuais. Em seguida, a etapa (5) foi repetido para a colónia secundário.

ensaios de formação de Sphere

células classificadas SP e NSP dos três h-PCCLs foram passados ​​através de um filtro de 40 | iM para se obter um suspensão de células individuais. Em seguida, 4 ml de meio contendo 100 células foram adicionadas a placas de 6 poços com cultura sem soro meio DMEM-F12 (Invitrogen-Life Technologies), suplementado com factor de crescimento epidérmico (10 ug /L), insulina (20 mg /L) e bFGF (10 ng /l). Alíquotas de factor de crescimento epidérmico, insulina e factor de crescimento de fibroblastos básico foram adicionados duas vezes por semana. Depois de 10 d, as placas foram ensaiadas visualmente para a formação de esferas flutuantes e as esferas foram contadas sob um microscópio de dissecação.

ensaio de invasão

invasividade das células SP classificados e PNS foi determinada utilizando 6 poços câmaras Matrigel invasão (BD Biosciences Descoberta alimentação laboratoriais). As células foram semeadas na câmara superior para a membrana de Matrigel revestido (24 cavidades de inserção; tamanho de poro, 8 mm; Corning Costar) com 2 × 10

5 por inserção em DMEM isento de soro a 37

oC, com cinco % de CO

2 durante 48 h. poços exteriores foram cheias com DMEM contendo FBS a 5% como quimio-atractor. As células não-invasoras foram removidas por raspagem da camada superior de Matrigel com Q-ponta. A membrana contendo células invasoras foi corado com hematoxilina durante 3 minutos, e, em seguida, lavadas e montadas em lâminas. As células invasoras sobre toda a membrana foram contados sob um microscópio de luz a 40 × objectivo.

células Transwell ensaio de migração

ordenada SP ou NSP em 1 × 10

5 foram plaqueadas no câmara superior para a membrana não revestida (24 cavidades de inserção; tamanho de poro, 8 mm; Corning Costar) e deixadas migrar para meio contendo soro na câmara inferior. As células foram fixadas após 24 h de incubação com metanol e coradas com violeta de cristal a 0,1% (2 mg /mL, Sigma-Aldrich). O número de células invasoras através da membrana foi contado sob um microscópio de luz (40 ×, três campos aleatórios por poço).

A resistência às drogas análise

As alíquotas de 2 × 10

3 recém- classificados SP e células NSP foram semeadas em placas de 96 cavidades em triplicado com 200 ul por poço de DMEM. Após um período de recuperação de 12 h, as células foram expostas a várias concentrações de gemcitabina durante 72 h. Os efeitos no crescimento celular foram examinadas pelo ensaio MTT como descrito acima. A taxa de sobrevivência celular (EL) foi calculada utilizando a fórmula: SR = (absorvância média do teste bem /absorvância da média de controlo) × 100%; a taxa de resistência de células (RR) foi calculada utilizando a fórmula:. RR = 100% -SR

As células apoptóticas foram determinados por métodos de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -Annexin-V. Em resumo, células recentemente classificadas foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 × 10

5 células /poço. Depois de 12 horas de recuperação, as células foram expostas a diferentes concentrações de gemcitabina durante 48 h. As células foram então coradas com Anexina-V e PI utilizando o Kit ™ ApoAlert apoptose Anexina V (Clontech, Cosete Tech, Jinan) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram colhidas por tripsinização e lavadas duas vezes com PBS frio. Os sedimentos foram ressuspensos em tampão de ligação 100 ul de 1 × anexina e 5 uL de FITC-anexina-V. Uma solução de trabalho de 1 ul de PI a 100 ug /ml foi adicionado a cada 100 ul de suspensão de células. As células foram incubadas em gelo durante 1 h, lavou-se novamente com PBS frio e ressuspensas em 300 ul de 1 × tampão de ligação de anexina. As células coradas foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo.

diferenciação in vitro estudo

SP recentemente classificados e células NSP foram cultivadas a uma densidade de 1 x 10

5 células /poço numa placa de cultura de 6 poços em meio de Leibovitz L-15 com 1% de penicilina /estreptomicina e 10% de FBS e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO

2. Após 7 dias, e não-SP- SP células derivadas foram re-analisados ​​para a presença de uma fracção de SP usando os métodos descritos acima.

ensaio de tumorigenicidade in vivo

atímicos com 4 a 5 -week ratinhos de idade (BALB /c ratinhos nus) foram fornecidos pelo animal Laboratory slac (Xangai). Os ratinhos foram alojados e mantidos em câmaras de fluxo laminar em condições sem agentes patogénicos. Grupos de camundongos foram inoculados s.c. ortotopicamente para o flanco dorsal esquerda de camundongos com células SP recém-ordenados em 1 × 10

3, 1 × 10

4, 1 × 10

5, e 1 × 10

6 ou NSP células a 1 × 10

3, 1 × 10

4, 1 × 10

5, e 1 × 10

6 (quatro ratinhos por grupo). O crescimento tumoral foi monitorizado a cada 2 dias após a segunda semana de inoculação. Os ratinhos foram sacrificados no dia 50 ou quando os tumores crescem até um máximo de 1000 mm

3. O volume do tumor foi calculado pela fórmula de 0,52 x comprimento x largura

2. Fold diferença de tumorigenicidade foi calculada pela seguinte fórmula: NSP

min /SP

min, onde PEN

min é o número mínimo de células NSP necessários para gerar um tumor e SP

min é o mínimo número de células SP necessários para gerar um tumor. Finalmente, os tumores foram também digerido para fazer a suspensão de uma única célula de SP re-análise pelo ensaio de efluxo de corante Hoechst33342 como descrito acima.

Quando os tumores induzidos por H-PCCL atingiram um volume de cerca de 200 mm

3, um grupo de ratinhos recebeu a gemcitabina (200 mg /kg ip de peso corporal, uma injecção a cada 3 dias, 6 injecções no total) e o outro grupo (tendo os tumores correspondentes) foram injectados com veículo (0,9% de NaCl; grupo de controlo ). diâmetro do tumor foi medido a cada 3 dias após a primeira injecção. Gemcitabina foi considerada eficaz quando o volume do tumor diminuiu, pelo menos, 50%. Três dias após a última injecção, os ratinhos foram eutanizados e os tumores analisados ​​para determinar a proporção de células SP, como descrito acima.

extracção de ARN e análise em tempo real de PCR

As células seleccionadas foram cultivadas e células tratadas com TRIzol reagente (Invitrogen China Limited, Xangai) e misturado com pipetagem. Os TRIzol-lisados ​​foram então misturadas com clorofórmio e centrifugou-se a 15000 × g durante 15 min. Após centrifugação, o ARN total foi obtido por precipitação com isopropanol de acordo com as instruções do fabricante.

ADNc de cadeia simples foi transcrito reversamente a partir de ARN total utilizando o iniciador aleatório sob condições padrão com o ADNc de alta capacidade kit de transcrição reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Quantitative real-time PCR com ADNc total foi feita com SYBR Green master mix Real-Time núcleo Reagentes num ABI 7500 (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. As amplificações foram levadas a cabo a 95 ° C durante 10 seg, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 30 s. Para quantificar a expressão relativa de cada gene, os valores (ciclo limite) Ct foram normalizados para referência endógena (

ΔCt = Ct-Alvo Ct β-actina) e comparados com um calibrador, utilizando o “

ΔΔCt método “(

ΔΔCt =

ΔCt

exemplo –

ΔCt

calibrador). Usando o valor

ΔΔCt, foi calculado expressão relativa (

2-ΔΔCt). Como o

método de ΔCt só é aplicável quando as eficiências de amplificação do alvo ea referência são essencialmente iguais, determinou-se as eficiências de 5 diluições, eo delta valores Ct (Ct

target-Ct

β- actina) foram plotados contra a diluição (log). Foi então determinado o declive da linha ajustada. Todas as amostras foram testadas em triplicado, e os valores médios foram usados ​​para quantificação.

análise Western blot

membrana e amostras de proteínas citosólicas foram extraídas a partir de células SP e PEN a partir de todos os três h-PCCLs. A concentração de proteína foi determinada pelo teor de proteína foi determinado pelo kit de ensaio de proteína BCA utilizando albumina de soro de bovino como o padrão (Pierce, EUA). Quantidades iguais de amostras de proteína (~ 50 ug) foram fraccionadas por SDS-PAGE (12% de gel de poliacrilamida) e transferidas electroforeticamente para uma membrana de PVDF (Millipore, Bedford, MA) utilizando um Mini Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories, Xangai). As amostras de proteína (amostra de membrana para ABCG2 e CD133; amostra citosólica para ALDH1, Oct4, Sox2 e Nanog) foram incubadas com os anticorpos primários em 1: 200 a 4 ° C durante a noite. Affinity policlonal de coelho purificada anti-ABCG2 (Shanghai Ruiqi Biological Technology Co. LTD), policlonal de coelho anti-CD133 (Shanghai XiangSheng Biotech Co. LTD), policlonal de coelho anti-Oct4 (Cell Signaling Shanghai), policlonal de coelho anti-Sox2 (empresas Shanghai Excell bio Co. Ltd), anticorpo policlonal de coelho anti-ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA) e soro policlonal de coelho anti-Nanog (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA) foram utilizados como os anticorpos primários. No dia seguinte, a membrana foi incubada com os anticorpos secundários (Molecular Probes) diluída em PBS durante 2 h à temperatura ambiente. Finalmente, a membrana foi lavada com PBS antes da digitalização, utilizando o sistema de imagem por infravermelhos (LI-COR Biosciences). GAPDH foi utilizado como um controlo interno para a igualdade de entrada de amostras de proteínas, utilizando anticorpo anti-GAPDH. bandas de Western blot foram quantificados utilizando software QuantityOne através da medição da intensidade da banda (Área × OD) para cada grupo e normalizando a GAPDH. Os resultados finais são expressos como alterações de dobra por normalizar os dados para os valores de controlo.

Preparação do complexo oligodesoxinucle�ido chamariz (cdODN)

Nós projetamos um cdODN contendo sequências de consenso para quatro fatores de transcrição Sox2, Oct4 e c-Myc, seguindo o princípio estabelecido por Gao et al. [18]. oligodesoxinucleótidos de fosforotioato de cadeia simples foram sintetizados por IDT incorporação (Coralville, IA). Os ODNs foram lavadas em 70% de etanol, seco e dissolvido em tampão Tris-EDTA esterilizado (Tris 10 mM + EDTA 1 mM). O sobrenadante foi purificado usando colunas de Bio Micro-spin30 (BioRad, Xangai) e quantificado por espectrofotometria. Os dODNs de cadeia dupla foi então preparado por emparelhamento de cadeia simples oligodesoxinucleótidos complementares por aquecimento a 95

oC durante 10 minutos, seguido de arrefecimento até à temperatura ambiente (TA) lentamente ao longo de 2 h. Por conveniência, nós designado este cdODN-SOC. Um fragmento de controle negativo (NC-cdODN) transportando substituição de pares de bases também foi sintetizado.

eletroforética ensaio de desvio de mobilidade (EMSA)

EMSA foi realizado de acordo com os procedimentos descritos no Gao et al. [18]. Resumidamente, cdODN-SOC ou NC-ODN foi marcado com [γ-

32 P] ATP. A amostra foi em seguida carregado na coluna G-25 e centrifugado a 7000

g

durante 2 min. As proteínas humanas recombinantes Sox2, Oct4 e c-myc estavam (Santa Cruz Biotechnology) foram incubadas separadamente cdODN-SOC ou NC-ODN à TA durante 15 min, em 10 ul de H

2O e 8 ul de mistura principal (12 × ) contendo Tris-HCl 1 M, pH 7,5, EDTA 0,5 M, 5 M de NaCl, 1 M de ditiotreitol, 50% glicerol, 100 mg /mL de albumina de soro de bovino, e 1? g de poli /ul (dldC). Para as experiências de supershift, anticorpos (1 ug) foram incluídos na reacção. Para experiências de competição, não marcado cdODN-SOC em excesso de 100 vezes das dODNs marcado foi adicionado nas reacções de ligação. complexos DNA-proteína foram separadas por não desnaturante em gel de poliacrilamida (7,5% em 0,4 × Tris-borato /EDTA) electroforese. Os géis foram secos e filmado.

A transfecção de cdODN-SOC em linhas celulares

O células NSP SP classificadas ou foram transfectadas com cdODN-SOC usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen China Limited, Xangai). As células foram semeadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos. A 50% de confluência, as células foram lavadas com meio isento de soro uma vez e então incubadas com soro fetal de bovino (FBS) livre de meio de 50 mL frescos. ODNs chamariz de concentrações variáveis ​​e lipofectamina (0,25 mL) foram misturados separadamente com 25 ul de Opti-MEM® I no soro reduzida Médio (Invitrogen China Limited, Xangai) durante 5 min. Em seguida, as duas misturas foram combinadas e incubadas durante 20 min à TA. A lipofectamina: cdODN mistura foi adicionada gota a gota às células e incubou-se a 37 ° C durante 5 h. Subsequentemente, 25 uL de meio fresco contendo 30% de FBS foi adicionado ao poço e as células foram mantidas em cultura até à sua utilização.

A administração de cdODN-SOC para BALB /c ratos nus

Quando tamanho do tumor atingiu 200 mm ~

3 (aproximadamente 7 dias após a inoculação), cdODN-SOC foi administrado diariamente por uma única injecção intratumoral (20 ul de 100 nM cdODN-SOC misturados com Lipofectamine 2000). O crescimento do tumor foi monitorado regularmente, e o volume (V) de tumores no dia 5 após o tratamento cdODN-SOC foi calculada usando a fórmula V = 1/2 × comprimento x (largura)

2.

Dados análise

os dados são apresentados como média ± SEM para todos os dados experimentais. comparações entre os grupos foram realizadas utilizando-se ANOVA. Análises post-hoc de efeitos principais significativos foram ainda examinadas por meio de testes PLSD de Fisher. A bicaudal

P Art 0,05 foi levado para indicar uma diferença estatisticamente significativa entre dois grupos. As análises estatísticas foram realizadas com SPSS 11.5 e ajuste de curvas foi realizada em software Graphpad Prism.

Resultados

Características de linhas celulares de cancro pancreático humano em cultura

Na cultura de oxigênio normal forma, as linhas de células de cancro pancreático humano (h-PCCLs) PANC-1, SW1990, e BxPC-3 todos demonstraram limites de células claras, citoplasma rico, núcleo distinto, e nucléolos visível, muitas células em divisão em curso com a morfologia celular, mesmo principalmente no forma poligonal-epitelial como raramente e em forma de fuso com um microscópio invertido (Figura 1A). Sob condições de cultura de hipóxia, no entanto, limites da célula tornou-se nebuloso e tamanho das células tornaram-se maiores, mas com citoplasma encolhido, núcleo aumentado, e nucléolo difusa com menos células em divisão e mais células fusiformes.

(A) fotomicrografias representativas de PANC-1 e BxPC-3 células 72 horas após a semeadura. (B) (C) As curvas de crescimento de células PANC-1 e BxPC-3. Os símbolos são dados experimentais e as curvas representam os melhores se adaptam à equação exponencial de crescimento: Y = Y0 × exp (k × X), em que Y0 é o valor de Y quando X (tempo) é zero e K é a constante de velocidade. τ é a constante de tempo (dias) e DT (duplicando-tempo) é em unidades de tempo em relação ao eixo X, calculada como ln

2 /K.

de crescimento de PANC-1 e células BxPC-3 foi avaliada. Com igual densidade de sementeira inicial, estas células apresentaram taxas semelhantes de crescimento sob condições de normóxia. Três dias após a sementeira, as células entraram na fase de crescimento logarítmica e formaram uma zona de crescimento que foi gradualmente expandindo radialmente. As células tinham morfologia uniforme e alinhadas ordenada (Figura 1B). A título de comparação, sob condições de cultura de hipóxia, o crescimento de células foi retardado consideravelmente sem a fase de crescimento logarítmica aparente (Figura 1C). As células foram desarrumada e células dentro da zona de crescimento apresentaram morfologia heterogénea.

Identificação de células SP a partir de linhas celulares de cancro pancreático humano e os efeitos da cdODN-SOC

De acordo com a nossa análise Hoechst33342-FACS, o h-PCCLs PANC-1, SW1990, e BxPC-3 todos continha uma pequena subpopulação de células SP com proporções de 8,7 ± 0,8, 4,6 ± 0,6 e 2,2 ± 0,4%, respectivamente (Figura 2A, B). A fracção de SP em linhas celulares foi substancialmente diminuída na presença de verapamil.

(A) Exemplos de floe de análise de citometria de células SP na presença ou na ausência de 30 uM de verapamil, cdODN-SOC (um oligodesoxinucleótido chamariz complexo transportando

cis

-elements para Sox2, Oct4 e c-Myc) ou NC-ODN (controle negativo cdODN). (B) As proporções SP como percentagem da população total. ***

p Art 0,001

vs

Controle; n = 4.

Para explorar se as células SP pode ser convertido para NSP alvejando as moléculas-chave que determinam a stemness de CSCs, testou os efeitos de um fragmento oligodesoxinucle�idos chamariz complexo (cdODN) em SP células. O oligodesoxinucle�ido chamariz complexo (cdODN-SOC) para este estudo continha o típico

cis

actuando elementos para Sox2, Oct4 e c-Myc. Surpreendentemente, após a pré-tratados com cdODN-SOC durante 48 h, as células SP foram quase desapareceu em todos os três h-PCCLs, com 0,05 ± 0,03, 0,03 ± 0,1 e 0,03 ± 0,2% para PANC-1, SW1990, e BxPC-3, respectivamente (Figura 2A, B). Como um controlo negativo, NC-cdODN não alterou significativamente as fracções SP nestas linhas celulares.

A sequência deste cdODN-SOC é mostrado na Figura 3A e a capacidade do CD-ODN-SOC para se ligar proteínas sox2, Oct4 e c-myc foi verificada por meio de nosso EMSA em conjunto com supershift utilizando anticorpos dirigidos contra estes factores de transcrição. Como representado na Figura 3B, as bandas de ligação deslocados indicam cdODN-proteína e as bandas supersfift indicou a ligação específica cdODN-proteína.

(A) As sequências do cdODN-SOC transportando

cis

-elements para Sox2, Oct4 e c-myc e o controlo negativo com ODN substituições de nucleótidos (NC-ODN). (B) EMSA Exemplos de imagens que mostram a capacidade de cdODN-SOC para ligar Sox2 recombinante humana, Oct4 ou proteína c-Myc. As bandas de deslocamento indicam as posições dos complexos DNA-proteína e as bandas supershift indicam o ADN-proteína de ligação específica captado pelo respectivo anticorpo. etiquetas Lane: 1, controle sem proteínas; 2: na presença de frio ou não marcado cdODN-SOC; 3: na presença de cdODN-SOC; 4: na presença de NF-ODN; e 5:. com anticorpo

Expressão gênica diferencial entre SP e células NSP

A seguir, comparou a expressão de marcadores de células tronco CD133 e ALDH1 (aldeído desidrogenase-1) [19, 20], factores de pluripotência mantendo Nanog, Sox2 e Oct4, factor de transcrição oncogénico c-myc, molécula de sinalização Notch1, ABCG2 e resistentes a fármacos de genes [21,22] em SP ordenada e não-SP (NSP) células por qRT-PCR para o nível de transcrição e transferência de Western ao nível da proteína. Tal como ilustrado na Figura 4, as células de SP de PANC-1 expressos transcritos substancialmente mais abundantes destes genes em comparação com células de PNS, indicando claramente as características de células-tronco de células SP. Os resultados da análise de transferência de Western foram consistentes com as alterações dos níveis de ARNm (Figura 4B). células de SP de outros dois H-PCCLs quantitativamente mostraram os mesmos resultados (Figura S1 e S2 Figura on-line).

(A) Expressão de CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-Myc, e Notch1 ao nível do ARNm, determinado pelo tempo real de RT-PCR. Os valores foram obtidos por primeiro normalizadas para GAPDH para o controlo interno e, em seguida, apresenta-se como uma razão de SP ao longo do PNS. **

p Art 0,01 SP

vs

NSP; ***

p Art 0,001 SP

vs

NSP; n = 4. (B) A expressão de CD133, ALDH1, ABCG2, Sox2, Oct4, Nanog, c-Myc, e Notch1 ao nível da proteína, determinada por análise de Western blot. Os valores foram obtidos por primeiro normalizadas para GAPDH para o controlo interno e, em seguida, apresenta-se como uma razão de SP ao longo do PNS. CD133: 120 kDa; ALDH1: 55 kDa; ABCG2: 72 kDa; Sox2: 40 kDa; Oct4: 45 kDa; Nanog: 35 kDa; c-Myc: 62 kDa; Notch1: 300 kDa. ** P 0,01 SP

vs

NSP;