Abstract

O tratamento de câncer de ovário avançado envolve quimioterapia à base de platina. No entanto, chemoresistance é um grande obstáculo. cancro de células estaminais (CSCs) são pensados ​​para ser uma das causas de quimiorresistência, mas o mecanismo subjacente permanece elusiva. Recentemente, a telomerase humana transcriptase reversa (hTERT) foi avaliado para promover traços CSC-like. Neste estudo, verificou-se que um inibidor mitótico, mesilato eribulin (eribulin), inibiram eficazmente o crescimento de linhas celulares de cancro dos ovários resistente à platina. As células sensíveis ao Eribulin mostrou uma eficiência mais elevada para a formação da esfera, o que sugere que estas células possuem uma CSC-como fenótipo melhorado. Além disso, estas células expressa um nível mais elevado de hTERT, e supressão da expressão de hTERT pelo siRNA resultou na diminuição da sensibilidade a eribulin, sugerindo que hTERT pode ser um alvo para eribulin. De fato, descobrimos que a atividade eribulin diretamente inibiu dependente de RNA RNA polimerase (RdRP), mas não a atividade da telomerase de hTERT

em

vitro

. Propomos que eribulin tem como alvo a actividade de RdRp de hTERT e pode ser uma opção terapêutica eficaz para CSCs. Além disso, hTERT pode ser um biomarcador útil para predizer respostas clínicas para eribulin

Citação:. Yamaguchi S, Maida Y, Yasukawa M, Kato T, Yoshida M, Masutomi K (2014) Metas Eribulin mesilato telomerase humana transcriptase reversa em células de câncer de ovário. PLoS ONE 9 (11): e112438. doi: 10.1371 /journal.pone.0112438

editor: Taro Yamashita, da Universidade Kanazawa, Japão

Recebido: 19 Agosto, 2014; Aceito: 06 de outubro de 2014; Publicação: 06 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yamaguchi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Grant em Aid para a Investigação Científica (26462544) (a SY) do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência (http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/), programa de financiamento para os pesquisadores líder a nível mundial Next Generation (programa seguinte) (para KM) do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência (http: //www .jsps.go.jp /Inglês /e-jisedai /), a Fundação Mitsubishi (KM) (https://www.mitsubishi-zaidan.jp/en/), a Fundação Memorial Uehara (KM) (http: //www.ueharazaidan.or.jp/) e cancro do Centro Nacional de Pesquisa e Fundos de Desenvolvimento (26-a-5) (KM) (https://www.ncc.go.jp/jp/about/rinri/kaihatsu /). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é o mais letal de todas as malignidades ginecológicas, alegando que cerca de 150.000 vidas por ano em todo o mundo. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado, e quimioterapia à base de platina é o padrão de tratamento de primeira linha para pacientes com câncer de ovário avançado. No entanto, chemoresistance é um grande obstáculo no tratamento de câncer de ovário.

adenocarcinoma seroso (SAC), o tipo mais comum de câncer de ovário, geralmente responde bem à quimioterapia inicial à base de platina, embora se repitam e, finalmente, desenvolver drogas resistência. carcinoma de células claras (CCC), o segundo tipo mais comum no Japão, é muitas vezes resistentes à quimioterapia inicial à base de platina [1]. Independentemente de saber se a resistência for adquirida ou estratégias terapêuticas primárias, mais promissoras são necessárias para superar chemoresistance e melhorar o prognóstico de pacientes com câncer de ovário.

Estudos recentes têm sugerido que as células-tronco cancerosas (CSCs) são, pelo menos em parte, responsável pela chemoresistance em muitos tipos de cancro, incluindo o cancro do ovário [revisto em [2]]. CSCs são uma subpopulação de células tumorais, que são caracterizadas por uma capacidade de auto-renovação e capacidade de se diferenciarem em tipos de células diferentes. O surgimento de CSCs ocorre, pelo menos em parte, como um resultado de epitelial-mesenquimal transição (EMT), um processo essencial para o desenvolvimento embrionário, que é induzida durante a progressão do cancro e crucial para a metástase do cancro. CSCs possuem o recurso de auto-renovação das células-tronco normais e vias de sinalização semelhantes regular a auto-renovação das CSCs e células-tronco normais [3]. Uma tal via envolve a telomerase transcritase inversa (terc), a subunidade catalítica limitante da velocidade da telomerase, que é expressa na maioria dos cancros. Evidências recentes indicam que TERT regula-tronco traços de células de uma forma independente do comprimento dos telômeros. Por exemplo, TERT ativa as células-tronco da epiderme quiescentes

em

vivo

de forma independente do componente RNA intrínseca da enzima telomerase TERC [4]. Além disso, juntamente com os TERT atos switch-Sacarose não fermentável (SWI-SNF) gene relacionado com brahma proteína complexa 1 (BRG1), como um modulador da transcrição da via de sinalização Wnt /β-catenina, contribuindo para a auto-renovação e proliferação durante desenvolvimento [5]. Mais recentemente, o acúmulo de evidências indica que TERT também opera em CSCs e promove EMT e traços CSC-like. Especificamente, a superexpressão de TERT humana (hTERT) resulta em uma capacidade de formação de esfera melhorada, aumento da expressão de marcadores de EMT /CSC, e aumento da

em

vivo

tumorigênese causada por hTERT interagindo com β- catenina e reforçar a sua actividade de transcrição [6]. Por outro lado, a supressão da expressão de hTERT resultados em uma capacidade de formação de esfera diminuída e diminuição da expressão do marcador CD44 CSC [7]. Esta função de hTERT na promoção de EMT e traços como CSC-parece ser independente da sua actividade de telomerase [6]. Na verdade, nós relataram que hTERT num complexo com BRG1 eo nucleostemin nucleolar de ligação GTP proteína (NS) (complexo TBN) participa na manutenção de CSCs. Além disso, verificou-se que a sobre-expressão do complexo TBN aumenta a tumorigenicidade e expressão de marcadores de EMT /CSC numa forma dependente da hTERT, mas de um modo independente do comprimento de telómeros-[8]. Os mecanismos independentes de telomerase exactos pelos quais o complexo TBN regula CSCs são ainda imperceptíveis. Um mecanismo possível é através da actividade dependente de ARN polimerase de ARN (RdRP) de hTERT [9]. RdRP induz a interferência de RNA através da produção de RNAs de fita dupla de RNA modelo de cadeia simples e regula a montagem de heterocromatina e progressão mitótica [10]. Semelhante a RdRPs em organismos modelo, descobrimos que as atividades RdRp do complexo TBN são ricos em células mitóticas, e supressão dos complexos resultados TBN em paragem da mitose [11].

Para abordar chemoresistance, estratégias terapêuticas visando EMT e CSCs são cada vez mais atraindo a atenção. Recentemente, por causa mesilato de eribulina (eribulin) foi relatado para inibir a metástase, invertendo EMT [12], nós especulamos que eribulin pode direcionar CSCs. Eribulin é um inibidor não-taxano de dinâmica dos microtúbulos [13], que induz bloqueio mitótico irreversível, conduzindo à inactivação persistente de Bcl-2 e subsequente apoptose [14]. Nos Estados Unidos, eribulin foi aprovado para o tratamento de cancro da mama metastático depois de pelo menos dois regimes de tratamento, incluindo uma antraciclina e um taxano. Além disso, eribulin está aprovado para o tratamento de câncer de mama inoperável ou recorrente no Japão.

Neste estudo, descobrimos que eribulin efetivamente inibiu o crescimento de células de câncer de ovário resistente à platina. células sensíveis à eribulina mostrou reforçada características CSC-like e alta expressão de hTERT. Supressão da expressão hTERT resultou em diminuição da sensibilidade à eribulina. Além disso, eribulin inibiram a actividade de RdRp de hTERT

em

vitro

, demonstrando que hTERT é um alvo direto de eribulina.

Resultados

Eribulin inibe o crescimento de linhas de células de adenocarcinoma de ovário resistentes à cisplatina

Quatorze linhagens de células de adenocarcinoma de ovário foram investigados para a sensibilidade à cisplatina [cis-diaminodicloroplatina (II)], incluindo seis linhas celulares SAC (PEO1, PEO4, PEO14, PEO23, OVKATE, e OVSAHO), seis linhas celulares CCC (RMG-I, ES-2, OVISE, OVMANA, OVTOKO, e TOV21G), e duas linhas de células de adenocarcinoma indiferenciado /não classificadas (OVCAR-3 e A2780) (Tabela S1). Como mostrado na Figura 1A, OVKATE, RMG-I, PEO4, e células PEO23 eram particularmente resistentes à cisplatina, presumivelmente através de diferentes mecanismos. OVKATE células foram anteriormente descritos como agentes resistentes à platina com elevada expressão de glutationa-S-transferase, um marcador de resistência a drogas [15]. células RMG-I também são resistentes a cisplatina, a qual envolve a via extracelular quinase regulada por sinal (ERK) [16]. células PEO4 PEO23 e foram derivados a partir dos mesmos doentes quanto células PEO1 PEO14 e, respectivamente, após o desenvolvimento de quimioresistência clínica, e são, por conseguinte, resistentes à platina [17]. BRCA2 foi encontrada para contribuir para a resistência de platina em células PEO4 [18].

As células foram tratadas com cisplatina ou eribulin durante 72 h, e, em seguida, a viabilidade celular foi determinada por ensaios MTT. (A) Média de IC

50 valores para a cisplatina (uM). (B): IC

50 valores para eribulin (nM). linhas celulares sensíveis ao Eribulin (Eribulin S) são mostradas como barras abertas, e linhas celulares Eribulin-resistente (R) Eribulin são mostradas como barras a cheio. As barras de erro representam o desvio padrão de pelo menos três experiências independentes.

rastreada uma série de compostos anti-cancro conhecidos para a inibição do crescimento de linhas celulares de cancro dos ovários resistente à platina. Descobrimos que eribulin, um inibidor mitótico que suprime a dinâmica dos microtúbulos [13], inibiu o crescimento de células PEO4 (Figura 1B) RMG-I, PEO23, e. Surpreendentemente, eribulin não foi tão eficaz em algumas das linhas de células sensíveis a cisplatina, tais como OVTOKO, PEO14, e TOV21G (Figura 1A e 1B). Para melhor caracterização, foram definidos oito linhagens de células com um IC

50 100 nM para eribulin como “sensíveis à eribulina” (Eribulin S) e seis linhas de células com um IC

50 de 100 nM para eribulin como “eribulin-resistant” (eribulin R).

linhas de células sensíveis à eribulina mostram uma maior formação de esfera capacidade

CSCs são pensados ​​para ser responsável por chemoresistance e CSCs têm sido relatados para contribuir para a resistência à cisplatina em vários tipos de cancro [19]. Além disso, foi recentemente relatado que eribulin inverte EMT [12], um fenótipo que é altamente relacionada com CSCs. Portanto, nós investigamos se as células sensíveis à eribulina possuem um CSC-como fenótipo melhorado. Porque uma capacidade de formação de esfera é uma característica CSC-like, realizamos ensaios de formação de esferas sob condições isentas de soro, e verificou que as linhas celulares sensíveis ao Eribulin mostraram alta eficiência formação esfera (Figura 2A e 2B). A eficiência de formação de linhas de células de esfera Eribulin S foi significativamente maior do que a de linhas de células Eribulin R (Figura 2C, p = 0,0013), sugerindo que as linhas de células sensíveis ao Eribulin possuem melhores características de CSC-like.

(A ) Sphere eficiência formação (SFE) de cada linha celular foi indicada por 1.000 células. linhas celulares de S Eribulin são mostradas como barras a branco e as células Eribulin R são mostradas como barras a cheio. Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes, e os valores médios ± DP estão indicados. (B) Morfologia de tumorspheres sob condições isentas de soro. Imagens representativas de esferas formadas por A2780, RMG-I, ES-2, OVSAHO, TOV21G, e células OVTOKO são mostrados. Barra de escala = 50 mm. (C) O SFE significativo de linhas celulares Eribulin S linhas (n = 8) e R Eribulin de células (n = 6) mostrado em (A). As barras de erro indicam SD. (D) O nível de BRG1 e proteína NS expressão foi detectada por imunotransferência. expressão de GAPDH foi mostrado como controlo de carga. (E) Os sinais em (D) foram quantificados com o software ImageJ e normalizados ao sinal GAPDH. Os valores médios do nível de expressão relativa ± SD são indicados.

Uma vez que temos demonstrado recentemente que NS juntamente com hTERT e BRG1 mantém CSCs [8] e nós e os outros também têm demonstrado que NS é um instrumento útil CSC marcador [20] – [22], foi investigada a expressão de BRG1 e NS em Eribulin S e linhas celulares Eribulin R. O nível de BRG1 expressão da proteína foi significativamente mais elevada em linhas Eribulin S celulares (Figura 2D e 2E, p = 0,0189), enquanto que só foi observada uma tendência modesta do nível mais elevado de NE em linhas celulares Eribulin S (Figura 2D e 2E, P = 0,1216). Nós não detectar uma diferença no nível de CD133 ou CD44 (Figura S1) expressão, os marcadores de superfície celular implícita em alguns CSCs [23].

células Eribulin S expressam níveis mais elevados de proteína hTERT

a superexpressão dos resultados hTERT em uma capacidade de formação de esfera reforçada em células cancerosas gástricas [6]. Por outro lado, a supressão da expressão de hTERT resulta numa capacidade de formação de esferas diminuiu em células [7] de cancro da mama. Portanto, verificou-se se as células de cancro do ovário com uma maior capacidade de formação de esfera expressar um nível mais elevado de hTERT. Observou-se uma tendência em linhas de células com elevada eficiência de formação de esferas, tais como RMG-I, PEO23, e A2780, para expressar níveis relativamente elevados de proteína hTERT, enquanto que as linhas de células com baixa eficiência de formação de esferas, tais como TOV21G, OVTOKO, e OVMANA, expressou níveis baixos de proteína hTERT, como demonstrado por enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Figura 3A). O elevado nível de expressão de TITEh nas células RMG-I pode ser explicada por uma mutação de ganho de função (-124 G A) na região do promotor de hTERT (Tabela S1 e S2 Figura). Esta mutação específica do cancro foi recentemente relatada em melanoma e vários outros tipos de câncer [24] – [27], que cria novos motivos de ligação para E-vinte seis fatores complexos /ternários (ETS /TCF) e, assim, contribui para a transcrição hTERT regulada [24], [25].

(A) O nível de expressão da proteína de hTERT foi determinada por ELISA (indicados em ng /ml). linhas celulares de S Eribulin são mostradas como barras a branco e as células Eribulin R são mostradas como barras a cheio. Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes, e os valores médios ± DP estão indicados. (B) O nível médio de hTERT linhas celulares Eribulin s (n = 8) e linhas de células Eribulin R (n = 6) mostrado em (A). As barras de erro indicam SD.

Verificou-se que as linhas celulares Eribulin S expressaram níveis mais elevados de proteína do que os de hTERT nas linhas celulares Eribulin R (Figura 3B; p = 0,008).

Suppression de hTERT expressão resulta na diminuição da sensibilidade a eribulin

a correlação entre a expressão de hTERT e sensibilidade eribulin levou-nos a postular que eribulin inibe o crescimento de células de cancro do ovário através da inibição da hTERT. Para testar esta hipótese, examinamos se a supressão da expressão hTERT nas células de cancro do ovário leva à diminuição da sensibilidade à eribulina. Dois ARNsi específico hTERT-independentes foram introduzidos em células A2780, e a sensibilidade para eribulin foi comparado com células que expressam ARNsi de controlo. Como esperado, as células que expressam os siRNAs hTERT mostrou diminuição da sensibilidade ao eribulin (Figura 4A). TERT siRNA1 mostrou uma tendência mais forte supressão da expressão de hTERT que TERT siRNA2 como demonstrado por ELISA (Figura 4B). Este resultado pode explicar por que as células que expressam TERT siRNA1 tendem a ser menos sensíveis a eribulin do que as que expressam TERT siRNA2 (Figura 4A). Resultados semelhantes foram obtidos em células ES-2 (Figura 4C e 4D). Estes resultados sugerem que hTERT pode ser um alvo direto de eribulina.

células A2780 (A) que expressam o controle siRNA (barras abertas), TERT siRNA1 (barras fechadas) ou TERT siRNA2 (barras sombreadas) foram tratados com eribulina durante 72 h, e, em seguida, a viabilidade celular foi determinada por ensaios MTT. * P 0,05 vs. células que expressam ARNsi de controlo. (B) O nível de expressão da proteína de hTERT nas células A2780 que expressam ARNsi de controlo (barras abertas), terc siRNA1 (barras a cheio), ou terc siRNA2 (barras sombreadas) foi determinada por ELISA (indicados em ng /ml). (C e D) As experiências descritas em (A e B) foram realizados da mesma maneira utilizando as células ES-2 que expressam ARNsi de controlo (barras abertas), terc siRNA1 (barras a cheio), ou terc siRNA2 (barras sombreadas). * P . 0.05 células vs. expressam controle siRNA

Eribulin inibe a actividade de RdRp de hTERT

em

vitro

Acredita-se amplamente que qualquer efeito de supressão da hTERT é mediada por encurtamento dos telómeros. No entanto, porque foi observada uma diminuição da sensibilidade ao eribulin num período relativamente curto (Figura 4, 96 h após a transfecção de ARNsi contra hTERT), especulamos que este efeito é independente da função de manutenção dos telómeros de hTERT. Além disso, a função de hTERT na promoção de EMT e CSC-como características é independente da sua actividade de telomerase [6]. Juntamente com a nossa recente relatório mostrando que hTERT tem uma actividade de RdRp independente da manutenção dos telómeros [9], nós investigamos se eribulin visa diretamente a atividade hTERT-RdRP. Nós monitoramos o efeito inibitório do eribulin sobre a atividade hTERT-RdRP usando um

em

vitro

RdRP ensaio [11], e descobriu que eribulin inibiu a atividade hTERT-RdRP

em

vitro a uma concentração de 50 uM (Figura 5A). A mesma concentração de eribulin não inibiu a actividade de telomerase de hTERT como mostrado pelo protocolo de repetição telomérica de amplificação (TRAP) de ensaio (figura 5B). Estes resultados sugerem que os efeitos de eribulin sobre hTERT não são mediadas através de actividade da telomerase, mas por meio de actividade de RdRp. Curiosamente, um outro inibidor mitótico, o paclitaxel, um taxano representativa, não inibiu a actividade de RdRp (Figura 5C), sugerindo que eribulin tem um efeito inibidor sobre a actividade específica de hTERT-RdRP.

(A) actividade de RdRp de hTERT imune complexos preparados a partir de células HeLa presos na fase mitótica foi ensaiada com ou sem eribulin 10 e 50 uM. (B) a actividade da telomerase em extractos de células HeLa foi ensaiada com ou sem eribulin 10 e 50 uM. (C) actividade de RdRp de complexos imunes hTERT foi ensaiada com ou sem 10 e 100 paclitaxel? M (PTX).

Discussão

Entre os cânceres ginecológicos, o câncer de ovário é a principal causa de morte. Em particular, a resistência à quimioterapia convencional à base de platina tem sido uma barreira na melhoria de prognóstico para pacientes de cancro do ovário, e novas estratégias terapêuticas são urgentemente necessárias. Aqui, nós descobrimos que eribulin foi eficaz para inibir o crescimento de células de cancro do ovário resistente a platina. Efeitos de eribulin foram correlacionados com os níveis de expressão de hTERT (Figura 3), e a supressão da expressão de hTERT resultou na diminuição da sensibilidade a eribulin (Figura 4), sugerindo que hTERT poderia ser um alvo de eribulin nestas células. Na verdade, eribulin inibiram a actividade de RdRp mas não a atividade de transcriptase reversa de hTERT

em

in vitro

(Figura 5).

CSCs e hTERT

CSCs são pensados ​​para ser envolvido na quimiorresistência, e diversas vias, foram encontrados para contribuir para a promoção ou manutenção das CSCs. Nós e outros autores mostraram que hTERT desempenha um papel importante na promoção e manutenção de CSCs em telómeros modos independentes de manutenção [6] – [8]. Eribulin efetivamente inibiu o crescimento de células resistente à platina (Figura 1). As células sensíveis ao Eribulin exibiu maior expressão de hTERT (Figura 3) e uma maior capacidade de formação de esfera (Figura 2), o que sugere que estas células têm reforçado CSC-características semelhantes, possivelmente devido aos elevados níveis de proteína hTERT. Consistentemente, células sensíveis a Eribulin exibiu maior expressão BRG1 (Figura 2), um outro componente do complexo TBN que mantém CSCs. Nós não detectar uma diferença significativa na expressão de CD133 ou CD44 (Figura S1). Embora CD133 e CD44 são pensados ​​para ser um indicativo de CSCs em alguns tipos de câncer, ele continua a ser elucidado o que os marcadores são apropriados para CSCs em câncer de ovário [23].

Uma vez que a manutenção dos telômeros pela telomerase é indispensável para infinito proliferação de células malignas, têm sido feitos esforços para desenvolver agentes terapêuticos anticancerígenos segmentação da telomerase. Estudos recentes indicam que TERT desempenha papéis funcionais, além de manutenção dos telômeros. Na verdade, a função de TERT para activar células estaminais quiescentes normais ou traços CSC-como tem sido mostrado para ser independente da sua actividade de telomerase [4], [6], [28]. Também descobrimos que o complexo TBN mantém CSCs de um modo independente do comprimento de telómeros-[8]. É possível que este mecanismo independente de telomerase é mediada pela actividade de RdRp de butilo, porque o complexo TBN si é responsável pela actividade de RdRp e está envolvido na regulação mitótica progressão heterocromatina e [11]. Especula-se que a actividade de RdRp de hTERT está envolvido na expressão do gene através da regulação da heterocromatina em células cancerosas, e pode ser um novo alvo terapêutico anticancerígeno. Se a atividade RdRP é pré-requisito para a função hTERT na promoção de CSCs continua a ser determinado.

Eribulin e hTERT

Eribulin liga-se a microtúbulos mais extremidades e inibe a fase de crescimento da dinâmica dos microtúbulos [29] . Recentemente, foi mostrado eribulin para inverter EMT por downregulating factor de crescimento transformante-β (TGF-β) induzida por fosforilação Smad [12]. Smad proteínas ligam-se aos microtúbulos em ausência de TGF-β e TGF-β provoca a dissociação de microtúbulos e a fosforilação das proteínas Smad [30]. Yoshida

et al.

Especularam que eribulin inibe Smad fosforilação, possivelmente, suprimindo Smad dissociação microtúbulos [12]. Uma vez que nós demonstramos recentemente que se localiza hTERT fusos mitóticos e centrómeros durante a mitose [11], também é possível que eribulin inibe funções hTERT por interferência com a interacção entre hTERT e microtúbulos. Eribulin melhora a sobrevida global de pacientes com cancro da mama metastático, que teve a quimioterapia antraciclina e baseados em taxano antes [31]. Um medicamento de taxano, paclitaxel, não inibiu a actividade de RdRp de hTERT (Figura 5C), fornecendo um dos potenciais bases moleculares para os diferentes resultados clínicos dos taxanos e eribulin. O mecanismo exato pelo qual eribulin inibe a função hTERT ainda está para ser compreendido.

hTERT como um biomarcador

É importante identificar biomarcadores para prever respostas para anticancerígenos terapias. Por determinação dos níveis de hTERT em espécimes clínicos, os pacientes que estão propensos a responder bem a eribulin podem ser identificados antes de receberem quimioterapia. Em particular, um ELISA seria capaz de medir os níveis de hTERT na prática clínica.

Em resumo, descobrimos que eribulin inibe a actividade de RdRp de hTERT, o que pode contribuir para chemoresistance no cancro do ovário, mantendo CSCs. Eribulin inibiu o crescimento de células de cancro do ovário com expressão elevada de hTERT e forte resistência de platina, sugerindo que pode ser um agente terapêutico promissor para o cancro do ovário resistente à quimioterapia. Além disso, hTERT pode ser um biomarcador útil para prever a resposta clínica a eribulina.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

RMG-I [32], OVMANA [33], OVTOKO [34], OVISE [34], OVSAHO [33], e OVKATE [33] as células foram obtidas a partir da Colecção de japonesa Bioresources Cell Research Banco. OVCAR-3 células [35] foram obtidos a partir do Centro de RIKEN Bioresource. PEO1, PEO4, PEO14, PEO23 [17], e A2780 [36] células foram comprados na Colecção Europeia de Culturas de Células e TOV21G [37] e ES-2 [38] células foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection. células RMG-I foram cultivadas em meio F12 de Ham suplementado com soro bovino fetal a 10%, ES-2 células em meio de McCoy 5A suplementado com 10% de soro fetal de bovino, células TOV21G em MCDB105 /meio 199 (01:01) suplementado com 10% As células fetais de soro de bovino, e HeLa em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro bovino fetal a 10%. Todas as outras linhas de células (A2780, OVCAR-3, OVMANA, OVTOKO, OVISE, OVSAHO, OVKATE, PEO1, PEO4, PEO14, e PEO23) foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro de bovino fetal a 10% e piruvato de sódio 1 mM ( Gibco, Grand Island, NY, EUA).

compostos

A cisplatina foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), o paclitaxel foi adquirido a partir de Wako (Osaka, Japão), e eribulin (Halaven) foi adquirido a partir de Eisai Co., Ltd. (Tsukuba, Japão).

ensaio MTT

(5.000-10.000 células por poço) foram semeadas em placas de 96 poços e em seguida tratados com cisplatina ou eribulin após 24 h. Às 72 h de tratamento, num ensaio de proliferação MTT (brometo de Proliferação Celular MTT Kit I, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 10 uL de reagente de rotulagem Adicionou-se MTT a cada poço, seguido de 4 horas de incubação. Em seguida, 100 ul de solução de solubilização foram adicionados a cada poço, seguido de incubação durante a noite. O produto da reacção foi quantificada pela medição da absorvância a 570 e 690 nm utilizando um leitor de microplacas (808 Vento, BioTek, Winooski, VT, EUA). A viabilidade celular foi determinada por comparação com células não tratadas.

Esfera formação ensaio

células individuais foram semeadas em placas de 96 poços de ultra baixas de fixação (Corning Inc, Corning, NY, EUA) a 100- 1.000 células /100 ul de meio em cada poço. As células foram cultivadas em meio DMEM /F12 isento de soro (Gibco) suplementado com 20 ng /de factor de crescimento de fibroblastos básico mL (Wako), 20 ng /ml de factor de crescimento epidérmico (Wako), e suplemento de B27 (Gibco). As culturas foram suplementadas com 25 ul de meio fresco a cada 3-4 dias, e o número de esferas foi contada nos dias 7 e 14. As imagens microscópicas foram obtidas com um microscópio invertido e CKX41 câmara digital DP21 (Olympus, Tóquio, Japão).

imunotransferência

As células foram lisadas em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) contendo 1% de NP-40, EDTA 1 mM, Tris-HCl a 50 (pH 7,4) e NaCl 150 mM. Depois de sonicação e centrifugação dos lisados, proteínas (20 ug) foram submetidas a SDS-PAGE em géis de 7,5% de poli-acrilamida, seguido por análise de imunotransferência. Foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-BRG1 (um presente do Dr. Tsutomu Ohta, Centro Nacional de Câncer, Japão), anti-NS (A300-600A; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, EUA), anti-GAPDH (3H12; Medical Biological Laboratories (MBL), Nagoya, Japão), anti-CD133 (W6B3C1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e anti-CD44 (2C5; R D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Os sinais foram detectados por LAS-3000 (Fujifilm, Tóquio, Japão), quantificados com o software ImageJ (National Institutes of Health, EUA) e normalizados utilizando o controle GAPDH carregamento.

hTERT ELISA

O hTERT ELISA empregou um anticorpo policlonal anti-hTERT coelho como o anticorpo de captura (MBL), e um anticorpo de ratinho anti-hTERT monoclonal (mAb) (clone 2E4-5) como o anticorpo de detecção (código de MBL não. 5340, Ab-Combinar Montagem Humana Kit de TERT). O anticorpo foi gerado contra 2E4-5 hTERT recombinante como um imunogénio, tal como descrito anteriormente [11]. As células foram lisadas em tampão RIPA. Depois de sonicação e centrifugação dos lisados, ^ g de proteína total de 100 (100 ul de volume) foi adicionada a cada poço de uma placa de 96 poços (código de MBL não. 5310, Ab-Combinar Universal Kit). O ELISA foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Absorvâncias a 450 e 630 nm foram medidos por um leitor de microplacas. Cada experiência foi realizada pelo menos três vezes, e os valores médios foram calculados.

análise de mutação promotor TERT

DNA genômico foi extraído de linhas celulares de cancro do ovário usando uma Sangue e Cultura Celular DNA Kit (Qiagen , Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. O

TERT e região promotora (-146 a -124 pb a montante do codão de iniciação) foi amplificado por PCR utilizando KOD FX (Toyobo, Osaka, Japão) e os seguintes iniciadores: 5′-GTCCTGCCCCTTCACCTT-3 ‘ e 5’-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3 ‘[25]. A PCR foi realizada sob as seguintes condições: 40 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 55 ° C durante 30 s, e 68 ° C durante 60 s. Os produtos de PCR purificados foram sequenciados por Sanger de sequenciação.

A transfecção de siRNA

As células foram transfectadas com ARNsi por Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen) e em seguida semeadas a 5.000-10.000 células por poço em placas de 96 poços . Ao fim de 24 h após a transfecção, as células foram tratadas com eribulin, e um ensaio de MTT foi realizado depois de 72 h de tratamento. Para o ELISA, 2-5,0 x 10

6 células transfectadas com ARNsi foram plaqueadas numa placa de Petri de 10 cm, e, em seguida, recolhidos após 48 h de incubação. hTERT siRNA1 e hTERT siRNA2 foram descritos anteriormente [8]. O siRNA controle negativo (Negative Control MISSÃO siRNA Universal; Sigma-Aldrich) também foi usado

IP-RdRP ensaio

A fim de detectar a atividade RdRP

em

vitro, o complexo imune hTERT foi isolado pelo mAb contra hTERT. Um ensaio IP-RdRP foi estabelecida em células HeLa mitoticamente envolvidas [11]. Portanto, as células HeLa foram usadas para este ensaio. Para sincronizar as células HeLa sofrer mitose, as células foram cultivadas em meio contendo timidina 2,5 mM (Nacalai Tesque, Quioto, Japão) durante 24 h. Às 6 horas após a libertação, as células foram incubadas em meio contendo 0,1 ug /ml de nocodazolo (Sigma-Aldrich) durante 14 h. Após agitação suave, as células mitóticas foram recuperados. O ensaio de IP-RdRP foi realizada como descrito anteriormente [11].

ensaio TRAP

Um ensaio TRAP foi utilizado para detectar a actividade da transcriptase reversa específica dos telómeros, como descrito anteriormente [39].

a análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EUA). Foi utilizado o teste t de Student ou teste de Mann Whitney. p-valores de dois lados de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Informações de Apoio

Figura S1..

CD133 e expressão de CD44 em Eribulin S e Eribulin R células de ovário. (A) O nível de expressão da proteína CD133 e CD44 foi detectada por imunotransferência. Uma vez que os dados foram obtidos na mesma experiência que a Figura 2 Painel D, gel de GAPDH foi idêntico com o painel Figura 2 D. (B) Os sinais em (A) foram quantificados com o software ImageJ e normalizados ao sinal GAPDH. Os valores médios do nível de expressão relativa ± SD são indicados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0112438.s001

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Figura S2. células

ES-2 e RMG-I possuem mutações do promotor hTERT. O promotor de hTERT foi sequenciado em cada linha celular. As células ES portadoras de uma 2-GG AA mutação, tal como descrito anteriormente [27], e as células RMG-I abrigar uma -124 G A mutação. As sequências de tipo selvagem das regiões correspondentes de células OVKATE e OVSAHO são mostrados como controles

doi:. 10.1371 /journal.pone.0112438.s002

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Tabela S1.

linhas celulares de cancro do ovário utilizados neste estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0112438.s003

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Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Tsutomu Ohta para o dom do anticorpo anti-BRG1, Dr. Koichi Ichimura de assistência técnica com a análise de mutação do promotor e do MBL por sua assistência na criação do kit de ELISA para detecção de hTERT.