Abstract

proibitina 1 (PHB1) é uma proteína altamente conservada que juntamente com o seu homólogo proibitina 2 (PHB2) localiza-se principalmente à membrana mitocondrial interna. Apesar de ter sido originalmente identificada pela sua capacidade para inibir a progressão G1 /S em fibroblastos humanos, o seu papel como supressor de tumor é debatido. Para determinar a função de prohibitins na manutenção da homeostase celular, foram geradas linhas de células de cancro expressam shRNAs dirigida-proibitina. Mostramos que as proteínas proibitina são necessários para a proliferação de células cancerosas. A regulação negativa da expressão proibitina reduziu drasticamente a taxa de divisão celular. Além disso, a morfologia mitocondrial não foi afectada, mas a perda de prohibitins conduziram à degradação do OPA1 proteína de fusão e, em certas linhas de células de cancro, a uma reduzida capacidade de exibir um crescimento independente de ancoragem. Estas células cancerosas também exibiu redução da adesão à matriz extracelular. No seu conjunto, estas observações sugerem prohibitins desempenham um papel crucial nos processos de adesão na célula e sustentando assim a propagação de células de câncer e sobrevivência

Citação:. Sievers C, Billig G, Gottschalk K, Rudel T (2010) Prohibitins são Necessário para proliferação de células cancerígenas e aderência. PLoS ONE 5 (9): e12735. doi: 10.1371 /journal.pone.0012735

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 15 de julho de 2010; Aceito: 06 de agosto de 2010; Publicação: 14 de setembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Sievers et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo através do financiamento no âmbito do Sexto Programa-Quadro de Investigação da União Europeia, o Projeto RIGHT (LSHB-CT-2004-005276) para TR. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Prohibitins (PHB1 e PHB2) são proteínas altamente homólogas que são conservadas ao longo da evolução e ubiquamente expresso [1] – [3]. Prohibitins localizam principalmente para a mitocôndria, mas também são encontradas no núcleo e em jangadas lipídicas da membrana citoplasmática [1], [4] – [7]. Localização de jangadas lipídicas é também uma característica de outros membros da família stomatin /proibitina /flotilin /HflK /C-domain (SPFH) de proteínas [8].

PHB1

Estudos até à data têm associado com diversos papéis em a manutenção da homeostase celular. Os trabalhos iniciais sugeriram que funciona como um inibidor da síntese de ADN, um papel que depois foi atribuído à sua 3’UTR [9], [10]. Uma forma de expressão t-alélico de PHB1 foi associada a um risco aumentado de cancro da mama [11]; no entanto essa associação não foi confirmada em um ambiente clínico [12], [13]. PHB1 co-localiza com os factores de transcrição da família E2F no núcleo de células do carcinoma da mama [14], e interage com a proteína supressora de tumor Rb pRB no núcleo resultando na inibição do ciclo celular [15]. Correspondentemente, silenciamento de ARNsi-mediada de expressão PHB1 foi encontrado para aumentar a proliferação de células de cancro da mama [16]. Apesar destas indicações de uma actividade de supressor do tumor, estudos recentes demonstraram igualmente a proliferação celular reduzida quando da perda de expressão PHB1 em fibroblastos de rato embrionários e outras células primárias; . E o resgate da proliferação celular mediante a sobre-expressão de PHB2-alvo mitocondrial [17]

O nosso trabalho recente indica PHB1 também desempenha um papel na migração celular: silenciamento transiente de PHB1 por knockdown mediada por siARN levou a um fenótipo de aglutinação em células HeLa, comparável à de um defeito de Her2 /ErbB2 ou Rac, isto é, células aglutinados mostrou coloração da membrana marcada para pan-caderina e β-catenina. Os autores sugeriram contacto entre as células foram rebentadas em células tumorais devido à perda de PHB1 [6]. Estudos em leveduras demonstraram consistentemente que PHB1 e PHB2 ato como chaperonas mitocondriais na membrana mitocondrial interna [3], [18] – [20]. PHB1 e PHB2 são interdependentes o nível de proteína e a perda de um conduz simultaneamente à perda da outra [21]. Eles interagem com proteases mitocondriais, particularmente MAAA, que é necessário na montagem de complexos da cadeia respiratória [22], [23]. Um knock-out de prohibitins em levedura conduziu a uma vida útil reduzida replicativa e um defeito na membrana mitocondrial potencial [18], [24]. Vários estudos recentes têm também dirigida a função mitocondrial de prohibitins em linhas de células humanas: A sobre-expressão de PHB1 foi encontrado para proteger contra o stress oxidativo [25]; Além disso, o knockdown de siRNA-mediada de PHB2 levou à degradação da proteína de fusão OPA1 mitocondrial [17] e fragmentação da rede mitocondrial [21]. No entanto, ainda não é claro se a expressão proibitina estabiliza o potencial de membrana mitocondrial (MMP) [17], [26], [27].

Aqui mostramos prohibitins desempenhar um papel na manutenção da homeostase e proliferação celular em células cancerosas e células primárias. Esgotamento de prohibitins não teve efeito importante sobre a função mitocondrial, mas afetou adesão das células à matriz extracelular.

Materiais e Métodos

cultura celular

células

HEK293 e HeLa foram obtidos da Colecção alemã de Microrganismos e culturas Celulares (DSMZ). células HT1080wt, Jurkat e Capani foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). células IF6 foram um presente da U. Rapp, Würzburg. As células HeLa foram testados e autenticados pelo DSMZ via STR-fingerprinting. células HEK293 e células HT1080wt foram cultivadas em DMEM com 10% de FCS, 1% de penicilina /estreptomicina, HEPES 10 mM, pH 7,4 e 4 mM de L-Glutamina. células HeLa, células IF6 e células Jurkat foram cultivadas em meio RPMI com 10% de FCS, 1% de Penicilina /Estreptomicina. células HT29 foram cultivadas em meio de McCoy suplementado com 10% FCS e 1% de Penicilina /Estreptomicina. células Capan I foram cultivadas em RPMI com 20% de FCS e 1% de Penicilina /Estreptomicina. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C com 5% de CO2.

A geração de linhas celulares de knockdown shRNA

shRNA-expressar os vectores foram construídos através da clonagem de diferentes shRNAs no pLL3.7 ou pLVTHM vector. Para gerar um sistema de vector indutel, os shRNAs a partir do sistema de expressão constitutiva pLVTHM foram subclonados no sistema de vector indutível pLVPT, através da transferência da cassete contendo o promotor do shRNA e H1 através dos locais de restrição Xhol /Xbal. Todas as construções foram verificadas através de sequenciação. As sequências de nucleótidos de alvos shRNA utilizados são como se segue: shLuci, 5′-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 ‘; PHB1-0, 5’-GCGGAGAGAGCCAGATTTG-3 ‘; PHB1-3, 5’-GACACATCTGACCTTCGGGAA-3 ‘; e PHB2-0, 5’-GACAGAGAGGGCCAAGGAC-3 ‘. Estavelmente transduzidas, as linhas celulares de knockdown constitutiva ou induzida foram construídos como descrito previamente [28]; ver também https://tronolab.epfl.ch/). Resumidamente, as células HeLa foram transduzidas com o respectivo vector lentiviral na presença de polibreno (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). Para a transdução de vectores lentivirais pLVPT, shRNA expressão foi induzida por tratamento com 1 ug /ml de doxiciclina (Sigma) durante 3 dias e as células foram classificadas para expressão eGFP com o Citómetro de Fluxo MoFlo® (Dako Denmark A /S, Glostrup, Dinamarca) . Para a validação dos níveis de knockdown, o ARN foi isolado utilizando o kit RNAeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha). Quantitative PCR em tempo real foi realizada com o Kit de tempo real QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Todos os vectores foram obtidos a partir de D. Trono, Escola Politécnica Federal de Lausanne, na França.

macio ensaio de agar

As células (2 x 10

3) foram inoculadas em baixa temperatura de fusão de 0,3% de agarose (Sigma) em DMEM suplementado com 10% de FCS, e as colónias foram contadas após 2-4 semanas de incubação a 37 ° C e 5% de CO

2.

proliferação celular e análise do ciclo celular

para a coloração CFSE, as células foram colhidas e lavadas duas vezes em PBS, em seguida, coradas com CFSE 5 uM durante 5 min à temperatura ambiente (TA). CFSE residual foi removido por lavagem duas vezes com PBS e as células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivado em meio de cultura celular. A intensidade de fluorescência CFSE foi medida por análise FACS a cada 24 horas durante 5 dias. Os ensaios de BrdU foram realizadas utilizando o kit de

Proliferação celular ELISA, BrdU (quimioluminescência) (Roche) segundo as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas a 3,5 x 10

3 em um branco de aros placa de 96 poços. BrdU foi adicionado a uma concentração final de 10 ^ M durante 1 hora. anticorpo anti-BrdU conjugado com peroxidase foi adicionada a células, durante 30 a 60 min à TA e luminescência foi medida após uma incubação de 3 a 10 min, utilizando um luminómetro de microplacas Monolight 3096 (BD Bioscience).

coloração TMRE

para analisar o potencial de membrana mitocondrial, 100 nM TMRE foi adicionado ao meio de cultura e as células foram incubadas durante mais 30 min sob as condições de cultura normais. A incorporação foi medida por FACS. Para controlar a perda completa de potencial de membrana, 1 uM de CCCP foi adicionado durante 5 min.

os níveis de ATP

a síntese de ATP celular foi medida utilizando um ATP

bioluminescência Assay Kit HSII

(Roche), de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 10

5-10

7 células /25 ul por cavidade de uma placa de 96 poços foram lisadas no mesmo volume de reagente de lise celular por incubação durante 5 minutos à temperatura ambiente. Cinquenta microlitros de reagente de luciferase reconstituído foi adicionado ao poço, por injecção automática (BD Bioscience, Monolight luminómetro). Medidas (duração de 2 segundos) foram tomadas depois de um atraso de 1 segundo.

Western blot

As células foram lisadas em tampão de amostra 2 x contendo DTT 200 mM e as proteínas foram separadas usando 10% de SDS PÁGINA. Após a electroforese, as proteínas foram electrotransferidas para uma membrana microporosa de fluoreto de polivinilideno e imunodetectado usando anticorpos contra OPA1 (BD Biosciences), e PHB1 PHB2 (NeoMarkers) e actina (Sigma). fragmentação OPA1 foi quantificada utilizando software de AIDA.

Imunofluorescência coloração

Células cultivadas em lamelas foram fixadas com 4% paraformadehyde durante 30 min à temperatura ambiente, e, em seguida permeabilizadas em 0,5% de Triton X-100. Em seguida, as células foram marcadas usando os seguintes anticorpos: rato anti-Tom20 (BD Biosciences) (1:100 diluição, 2 h RT), rato anti-Paxillin-1 (BD Transdução) (1:100), phalloidin-Alexa 488 ( MoBiTec) (1:200) e burro anti-rato, Cy ™ 3 (1:100). Quantificação da rede mitocondrial foi feito usando software ImageJ.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

As células desprovidas de prohibitins através da indução de expressão shRNA por 10 dias foram fixadas com glutaraldeído 2,5%, pós-fixado com 0,5% de tetróxido de ósmio e contrastadas utilizando ácido tânico e acetato de uranilo. As amostras foram desidratadas numa série de etanol graduadas e embutida em Polybed. Secções ultrafinas foram analisados ​​num Leo 906E microscópio electrónico de transmissão (Leo GmbH).

Ensaio de aderência de

Para medir a adesão das células, as microplacas foram revestidas com 1 mg /mL de fibronectina, de 2 mg /mL colagénio ou 3 mg /ml de BSA, respectivamente. a expressão da GFP era abaixo da sensibilidade do fluorómetro (a 488 nm), que, por conseguinte, de células marcadas com CFSE antes da semeadura. As células foram incubadas em poços revestidos durante 30 min a 37 ° C.

Para analisar a migração celular e adesão, as células induzidas com doxiciclina durante 8 dias foram cultivadas sob condições subconfluentes, em placas de cultura de células ou de lamelas, durante 20 h seguido por 4 h privação de soro. As células foram tratadas com 50 | iM forscolina durante 20 min para induzir a activação de AMPc /PKA e assim lamelip�ios e formação de adesão focal. filamentos de actina e adesões focais foram visualizadas através de imunocitoquímica e adesões focais foram contadas manualmente.

Resultados

perda seletiva de PHB1 empobrecido células

Até o momento não há consenso sobre a função da PHB1 foi alcançado; em células de cancro da mama, PHB1 foi reportado para actuar como um supressor de tumores [15], [16], enquanto que em células endoteliais primárias de depleção PHB1 resultou em proliferação celular reduzida [26]. Para definir o papel de PHB1 em células HeLa, uma linha celular de adenocarcinoma, foram geradas linhas de células estáveis ​​que expressam shRNAs dirigida-PHB1 utilizando o sistema de expressão lentiviral pLL3.7 shRNA constitutiva [29]. Expressão de três shRNAs diferentes, shPHB1-2, shPHB1-3 e shPHB1-0, visando a região de codificação de PHB1 induzida a depleção de PHB1 por interferência de RNA (RNAi) no ARNm (Fig. 1A) e de proteína (Fig. 1B) nível. A depleção de PHB1 correlacionada com a expressão simultânea da proteína marcador eGFP (Fig. 1C), indicando a transdução lentiviral bem sucedida destas células. Em seguida, aumentou as diferentes linhas de células e monitorizada a composição da população celular utilizando a análise de FACS e de microscopia. Observou-se uma redução selectiva das células que expressam shPHB a partir do conjunto de pilha, visível através de uma redução na população de células-eGFP positivas (Fig. 1D). Esta perda não foi devido ao aumento da apoptose das células que expressam shRNA-(dados não mostrados), mas crescimento mais rápido das células que expressam proteínas não transduzidas, PHB1, e, por conseguinte, as células eGFP-negativos, que mostrou a proliferação normal.

(a, B) PHB1 ARNm e os níveis de proteína foram eficientemente reduzida em células que expressam shPHB1-0, shPHB1-2 e shPHB1-3 pLL3.7 usando o sistema de expressão lentiviral constitutiva como foi mostrado por qRT-PCR e ocidentais Blots, respectivamente. (C) na integração estável de transdução lentiviral é indicado por expressão da GFP. (D) com a expressão de shRNAs validados positivamente segmentação PHB1 mRNA da fracção de células que expressam GFP foi reduzida até dez dias após a transdução de um conjunto de células transduzidas dentro, como mostrado por análise de FACS. células (E) transduzidas HeLa expressando vetor de controle ou PHB1 segmentação shRNAs foram semeadas em agar mole. As células de controlo só cresceu sob condições independente de ancoragem e colônias formadas.

Para testar se essa observação era específica para as células HeLa, um número de diferentes linhas celulares de cancro, incluindo células Capan1,, células T Jurkat HT1080wt , células HT29 e IF6, foram transduzidas com o mesmo construto shRNA lentiviral e o seu crescimento monitorizados como anteriormente. A análise de transferência de Western revelou a expressão de shPHB1-0 resultou em depleção de PHB1 em todas as linhas celulares testadas (Fig. S1A). Além disso, semelhante a células HeLa, o cultivo prolongado resultou numa perda de células eGFP positivas (Fig. S1B), o que exclui qualquer efeito específico da linha de células. Curiosamente, um fenómeno semelhante foi observado na proliferação de células primárias endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) após transdução shPHB1-0 (dados não mostrados), sugerindo que a perda de PHB1 interfere com a proliferação.

Uma vez que o crescimento independente de ancoragem é uma característica das células cancerosas [30], que também avaliou este fenótipo em nossas linhas de células que expressam constitutivamente shRNAs segmentação PHB1. As células foram semeadas em agar mole e o seu crescimento monitorizados como anteriormente. As células de controlo e não transduzidas exibiram características de crescimento normais, formando colónias e proliferar, enquanto que as células PHB1-knockdown permaneceu como células isoladas (Fig. 1E), indicando PHB1 desempenha um papel no crescimento independente de ancoragem.

PHB1 /PHB2 são necessários para a proliferação de células cancerosas

Desde silenciamento condicional de expressão PHB1 levou à perda de proliferação e, consequentemente, um crescimento excessivo de células não transduzidas, estudos de longo prazo sobre os efeitos da expressão PHB1 reduzida a nível molecular não eram possível. Portanto, se expressa da mesma shRNAs validado para o knockdown funcional de PHB1 num vector lentiviral sob controlo de um promotor indutível por doxiciclina [28]. Para analisar o papel da PHB2 e sua interação com PHB1, nós projetamos um shRNA adicional visando especificamente mRNA PHB2 (para detalhes, ver Materiais e Métodos).

As reduções na PHB1 e proteína PHB2 expressão foram observados de 3 a 4 dias após a adição de doxiciclina, tornando-se marcadamente reduzida em 5-6 dias e, em seguida, permanecendo reduzidos de forma estável durante até 10 dias (Fig. 2A, B). Depleção de uma proteína proibitina levou à perda do outro (Fig. 2C). Este efeito foi devido provavelmente à desestabilização de proteína como os níveis de ARNm do gene silenciado não permaneceu constante (dados não mostrados). Como observado previamente em cima de silenciamento constitutiva PHB1 (Fig. 1D), o silenciamento de prohibitins induzível levou a proliferação reduzida de células. Os ensaios de incorporação de BrdU revelaram a síntese de DNA reduzida de 5 dias após a indução de PHB1 e depleção PHB2 (Fig. 2D). Para avaliar a taxa de proliferação celular a um nível de uma única célula, as células foram coradas com fluorescência succinidylester Carboxi (CFSE); essa mancha é distribuído uniformemente no citoplasma e estequiometricamente distribuídos para as células filhas durante a divisão celular. A proliferação celular foi claramente diminuída em PHB1- ou células empobrecido-PHB2 em comparação com células de controlo (Fig. 2E). Além disso, estas células mostraram uma redução independência de ancoragem e não conseguiu crescer em agar mole (Fig. 2F). Assim, os nossos dados demonstram que prohibitins desempenhar um papel na proliferação das células.

(A, B) com o sistema de transdução lentiviral pLVPT permite doxiciclina shRNA expressão indutível. Dentro do tempo indicado de PHB1 indução e expressão da proteína PHB2 foi eficientemente reduzida. (C) A expressão indutivel de qualquer PHB1 alvo ou mRNA alvo PHB2 levou a uma redução da expressão de ambas as proteínas, tal como mostrado por Western blot. (D) Análise de incorporação de BrdU mostra células HeLa que expressam shPHB1-0, shPHB1-3 ou shPHB2-0 durante 10 dias exibem uma taxa de proliferação reduzida em comparação com células que expressam shRNA controlo (shLuci). (E) intensidade CFSE como medido por FACS a 0 h (1), 24 h (2), 48 h (3), 72 h (4), e 96 h (5) é maior em células knockdown proibitina indicando reduzida diluição de CFSE jejuar replicando células filhas. (F) intensidade CFSE foi avaliada por FACS a cada 24 h durante 5 dias e a mediana de cada pico foi representada graficamente contra o outro. (L) a expressão induzível da shRNAs resultou no mesmo fenótipo de redução /perda de crescimento independente de ancoragem em PHB1 (shPHB1-0, shPHB1-3) e PHB2 (shPHB2-0) knockdown células tal como observado com o sistema de expressão constitutiva.

Perda de prohibitins leva à fragmentação das mitocôndrias

Desde prohibitins estão localizadas principalmente para mitocôndrias [1], decidimos testar se o esgotamento dos prohibitins afetou a integridade das mitocôndrias. Utilizando microscopia de imunofluorescência observou-se uma fragmentação clara da rede mitocondrial em células que expressam shPHB1-3, que aumentou ao longo do tempo (Fig 3A, B.); Expressão de shPHB2-0 não conseguiu induzir um aumento significativo na fragmentação da rede mitocondrial (Fig. 3A, B). Além disso, a expressão de shPHB1-3 resultou em um knockdown mais eficiente de ambos os prohibitins.

(A, B) As mitocôndrias de células proibitina knockdown foram coradas com anti-Tom 20 e fragmentação mitocondrial foi quantificada utilizando o software ImageJ. Uma indução prolongado com doxiciclina levou a um aumento da fragmentação em células que expressam shPHB1-3. (C) As transferências de Western que demonstram que a expressão prolongada shPHB1-3 induzida pela doxiciclina levou a um knockdown proibitina mais forte do que a expressão shPHB2-0, correlacionando-se com uma crescente fragmentação da fusão competentes fragmentos a e b de OPA1. (D) A quantificação revelou que as formas competentes de fusão foram degradadas nas menores fragmentos C e E. (E) Quantificação de OPA1 padronização em células de controlo (shLuci), células empobrecido-PHB1 (shPHB1-3) e células tratadas com CCCP 60 uM durante 80 min (CCCP) para induzir a perda de ΔΨm. O padrão OPA1 nas células tratadas com CCCP diferiam shPHB1-3 células que expressam, como os fragmentos a e b foram completamente perdido enquanto os menores fragmentos D e E foram aumentadas. (F) TEM imagens de células com um knockdown proibitina induzida por 10 dias mostrou uma aparência mais denso de mitocôndrias de células de controlo que expressam shLuci, mas a morfologia da estrutura cristas não foi alterada.

Entre muitas outras proteínas, OPA1 desempenha um papel importante no controle de fusão mitocondrial [31] e cristas integridade [32]. Uma vez que as publicações anteriores demonstraram que prohibitins são necessários para a expressão estável de OPA1 [17], [21], analisou-se o efeito de depleção de PHB2 PHB1 e sobre os níveis de proteína de fusão OPA1 mitocondrial. OPA1 proteínas são expressas como sete variantes de splicing, visível como cinco bandas (A-E) em um Western blot, atribuídas, em parte, à actividade de fusão de OPA1 [33]. Observou-se a degradação de OPA1 em células desprovidas de prohibitins, que se correlacionou com a eficácia da depleção de prohibitins. Em especial, a fusão de fragmentos competentes a e b foram perdidos e a pequenos fragmentos C-E aumentou após depleção PHB1 por períodos mais longos de tempo (Fig. 3C e D). Interessantemente, em células que expressam bandas shPHB2-0 a e b manteve-se intacta, e só aumenta em banda e foram observadas (Fig Fig. 3C). O efeito foi específico para OPA1 vez que a degradação de outra proteína mitocondrial, incluindo Hsp60, ATP sintase e não foi observada Tims e Toms (dados não mostrados). Estes resultados suportam uma atividade seletiva do shPHB1-3 na fragmentação mitocondrial e degradação OPA1.

A partir de estudos anteriores que foi conhecido que a dissipação da MMP induz OPA1 degradação e fragmentação mitocondrial [33]. Portanto, testou-se o padrão de fragmentação induzido por depleção OPA1 PHB1 e MMP foi semelhante. As células foram tratadas com o reagente de desacoplamento cianeto de carbonilo

m

-clorofenil-hidrazona (CCCP) e as bandas foram detectadas por OPA1 imunotransferência. padrões de proteínas OPA1 eram claramente diferente em células sem MMP em comparação com aqueles empobrecido de PHB1 (Fig. 3E). Os fragmentos competentes de fusão de OPA1 foram degradados e expressão de fragmentos de c, d e e foi aumentada na ausência de MMP. Em células com depleção de proibitina, expressão de banda d expressão foi fortemente diminuída, enquanto que b banda foi apenas ligeiramente diminuída, o que sugere que os diferentes mecanismos para explicar os efeitos observados. Numa experiência de tempo-curso, observou-se que CCCP provoca mitocôndrias fragmentação antes da degradação OPA1 (dados não mostrados), indicando que a degradação OPA1 pode ser uma consequência da fragmentação mitocondrial neste caso.

Para testar se o silenciamento de PHB1 induz perda de MMP, nós manchado shPHB1-3 células com tetramethylrhodamine perclorato de éster etílico (TMRE), um corante de células-permeável que é seqüestrado por mitocôndrias activas expressar. TMRE intensidade da coloração foi semelhante em controlo e células empobrecido-PHB1 (Fig. S2a), sugerindo que a membrana mitocondrial permanece intacta apesar fragmentação das mitocôndrias nestas células. Em conformidade, os níveis de ATP manteve-se inalterada em células desprovidas de prohibitins (Fig. S2B). Desde a degradação OPA1 também foi mostrado para levar a mudanças na morfologia de cristas [32], foi investigada a estrutura cristas das mitocôndrias nas células desprovidas de prohibitins utilizando Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET). Em células silenciou-PHB1 e controle, estrutura cristas permaneceu intacta (Fig. 3F), indicativo de uma fisiologia mitocondrial normal.

Cell- to- contato celular é inibida em células proibitina empobrecido

Durante os nossos estudos iniciais sobre as linhas de células de knockdown proibitina, observou-se que a perda de células esgotadas-proibitina era dependente da densidade à qual as células foram semeadas em placas de cultura celular. Em densidades celulares elevadas, a perda de células knockdown foi reduzida, mas não impediu (Fig. 4A). Além disso, a perda de expressão prohibitins causou uma mudança na morfologia celular em certas linhas celulares de cancro: células HeLa, especialmente quando semeadas a baixa densidade tenderam a permanecer como células individuais com uma morfologia alongada, reminiscente de fibroblastos (Fig. 4B). Um fenótipo semelhante foi observado quando as células HeLa foram mantidas sob condições de suspensão semeando-os em placas de cultura de células coberto-agarose: somente células colónias formadas controlar, enquanto que as células silenciados-proibitina não conseguiu formar cell- contactos célula-a e colónias (Fig 4C. ).

(a, B) Silenciamento expressão proibitina durante 10 dias resultou numa morfologia celular alongada com o núcleo ligeiramente levantada. (A) Quando semeadas a proibitina baixa densidade células knockdown permaneceu como células individuais com contato célula-célula mínima. (B) A maior densidade de sementes, as células knockdown-proibitina ainda mostrou uma morfologia alongada, mas ou clusters formados (shPHB1-3) ou permaneceu predominantemente como células individuais com contato célula-célula reduzida. A taxa de proliferação de células knockdown proibitina foi também aumentada em comparação com células cultivadas a partir de densidade normal. (C) Prevenção de ancoragem por células de semeadura em placas de cultura de tecidos revestidos de agar taxa de proliferação e formação de colónias em células proibitina knockdown fortemente reduzidos, enquanto as células de controlo (células que expressam shLuci) formado grandes aglomerados de células. (D) e as células de controlo foram tratadas com CFSE para aumentar a intensidade da fluorescência e semeadas em colagénio ou proteínas de matriz extracelular fibronectina, ou em BSA durante 30 min com depleção de proibitina. As células aderentes não foram lavadas e a intensidade da fluorescência foi medida. Proibitina knockdown reduziu significativamente a adesão. (E) células induzida pela doxiciclina foram semeadas em lamelas durante 20 h seguida por privação de soro, durante 4 h. Após o tratamento com 50 uM forscolina durante 20 min, as imagens de campo claro lamelip�ios mostrou a formação de células de controlo, mas não em células esgotadas prohibitin-. Além disso, as células empobrecido-proibitina mostrou diminuição da formação de adesões focais, como mostrado por coloração imunocitoquímica utilizando faloidina e anticorpos anti-paxilina. (F) Para a quantificação de adesões focais em controle e células proibitina knockdown, α-paxilina 1 spots manchadas foram contados em 30 células por condição.

Para estudar a formação de contacto de matriz celular, as células foram semeadas em placas revestidas com a matriz extracelular de proteínas fibronectina ou colagénio. A adesão das células e PHB1- empobrecido-PHB2 para estas proteínas de matriz foi inibida significativamente (Fig. 4D). Para quantificar mais fixação de células-matriz, a formação de adesão focal induzida pela forscolina foi após privação de soro. Microscopia de imunofluorescência revelou reduzida espalhando e formação de filamentos de actina (Fig. 4E), além de uma redução no número de adesões focais (Fig. 4E, F). Estes dados sugerem que prohibitins também desempenhar um papel na interacção célula-matriz.

Discussão

Desde a descoberta da sua actividade anti-proliferativa, prohibitins têm sido implicados em várias funções celulares [10] [18], [34]. No entanto, diversas linhas de evidência indirecta, tal como a sua sobre-expressão em numerosas células de cancro [35], indicou que não foram prohibitins funcionando como um supressor de tumor clássica. Aqui, mostramos prohibitins são um pré-requisito crucial para a proliferação de células cancerígenas e sobrevivência. Nós usamos a expressão shRNA lentivírus mediada para reduzir especificamente níveis PHB1 e mRNA PHB2 e proteína, respectivamente. Usando o sistema de expressão constitutiva pLL3.7, demonstrou-se que, em todas as linhas celulares tumorais testadas, números de células, que expressam um ARNm PHB1 segmentação shRNA foram reduzidos a partir de um pool de células transduzidas e não transduzidas. Além disso, as células empobrecido-PHB1 foram incapazes de crescer sob condições independente de ancoragem. Nossos resultados estão de acordo com dois estudos recentes que demonstram que silenciamento de PHB1 ou PHB2 RNAi mediada por, respectivamente, leva à proliferação reduzida nas células endoteliais primárias e fibroblastos de rato embrionárias [17], [26]. Estes dados estão em forte contraste com um estudo anterior que mostra o aumento da proliferação da linha de células de melanoma cancro da mama MCF-7 no silenciamento mediado por siRNA de PHB1 [16]. É possível prohibitins desempenhar um papel diferente em células de cancro da mama em comparação com outros tipos de células de cancro.

De acordo com a descoberta inicial de que o ARN de 3’UTR de PHB1 exerce efeitos citotóxicos em células cancerosas [9] , [10], a expressão de um t-alélica PHB1 3’UTR tem sido associada com um aumento da susceptibilidade para o cancro da mama [11]: no entanto, vários estudos clínicos têm contradigam estas conclusões [12], [13]. Além disso, a sequenciação do PHB1 3’UTR de diferentes linhas celulares de cancro, incluindo MCF-7, revela uma maior frequência de variação de sequência total, em comparação com células não-cancerosas primárias, em vez de uma expressão predominante de um alelo T específico (CS e TR, não publicado). Estes achados sugerem que prohibitins fazer desempenhar um papel na carcinogénese, mas o nível em que o efeito é exercida, isto é, 3 ‘UTR de ARN ou proteína, permanece pouco clara: silenciamento de qualquer PHB1 ou ARNm PHB2 por RNAi resultou na redução do respectivo 3’ UTR, mas também em um knockdown de ambas as proteínas proibitina. Uma vez que a expressão de todos testados shRNAs conduziu a uma taxa de proliferação celular retardada, este fenótipo é provavelmente uma consequência da perda de proteínas proibitina.

Para determinar o efeito a longo prazo da depleção proibitina, foram geradas linhas de células HeLa com shRNA expressão indutível. Nestas células PHB1 e PHB2 mRNAs foram eficientemente e selectivamente regulada por indução dos shRNA proteínas e proibitina gene-específicos foram suprimidos de forma reversível. Semelhante ao silenciamento constitutiva de PHB1 ou PHB2, indução da expressão de shRNA reduziu a proliferação de células e formação de colónias em placas de agar impedido moles, indicativo de um defeito de crescimento independente de ancoragem. Estas linhas de células nos permitiu afinar PHB1 e silenciamento PHB2 sob condições padronizadas e investigar o mecanismo subjacente o fenótipo forte associada à depleção proibitina. O primeiro analisado o efeito da depleção proibitina sobre os níveis de proteína de fusão OPA1 mitocondrial como publicações anteriores demonstraram que prohibitins são necessários para a expressão estável de OPA1 [17], [21]. Poderíamos mostram que a expressão OPA1 é dependente dos níveis de prohibitins. A ligeira redução da prohibitins, visto logo após a indução da produção de shRNA, levou a uma fragmentação parcial do OPA1 competente fusão fragmenta a e b. Em momentos posteriores da indução e, consequentemente, mais forte esgotamento dos prohibitins, OPA1 fragmentação aumentada e mitocôndrias apareceu fragmentado. Uma redução incompleta de proteínas proibitina, como visto com expressão de shRNAs shPHB1-0 e shPHB2-0, só resultou em fragmentação OPA1 leve e sem fragmentação da rede mitocondrial. Outras análises revelaram que mesmo forte e de longa duração, por exemplo, a depleção de PHB1 em células produtoras de shPHB1-3, não causaram a dissipação de MMP

Até à data, os efeitos da perda de proibitina em células de mamífero ainda não são claras:. Schleicher et ai. [26] e Ross et ai.