Sumário

Proteína quinase D (PKD) tem sido implicada em muitos aspectos da tumorigénese e progressão, e é um alvo molecular emergente para o desenvolvimento de uma terapia anti-cancro. Apesar do recente avanço no desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas PKD potentes e selectivos, a disponibilidade de

em inibidores de PKD ativos vivo

permanece escassa. Neste estudo, descrevemos a descoberta de um novo inibidor de molécula pequena de PKD, SD-208, a partir de uma biblioteca de tela inibidor da quinase alvo, e a síntese de uma série de análogos para sondar a relação estrutura-actividade (SAR) vs PKD1. SD-208 exibido um perfil SAR estreita, era um inibidor pan-PKD ATP-competitivo com baixa potência nanomolar e foi célula ativa. Targeted inibição de PKD por SD-208 resultou em inibição potente da proliferação celular, um efeito que pode ser revertido por sobre-expressa PKD1 ou PKD3. SD-208 também bloqueou a sobrevivência celular do cancro da próstata e a invasão, e células paradas na fase G2 /M do ciclo celular. Mecanisticamente, G2 induzida por DP-208 /H prisão foi acompanhada por um aumento nos níveis de proteína p21 em células DU145 e PC3, bem como a fosforilação elevado de Cdc2 e Cdc25C em células DU145. Mais importante ainda, SD-208 administrado por via oral durante 24 dias revogada significativamente o crescimento de xenoenxertos de tumores PC3 subcutâneo em ratinhos nus, que foi acompanhada por uma proliferação reduzida e aumento da apoptose e a diminuição da expressão de biomarcadores incluindo PKD survivina e Bcl-xL. Nosso estudo identificou SD-208 como um romance eficaz PKD inibidor de molécula pequena, demonstrando o potencial terapêutico da inibição específica de PKD para o tratamento de câncer de próstata

Citation:. Tandon M, Salamoun JM, Carder EJ, Farber E, Xu S, F Deng, et al. (2015) SD-208, uma nova proteína cinase D Inhibitor, blocos cancro da próstata proliferação celular e crescimento tumoral

In Vivo

por induzir G2 M Detenção /Ciclo Celular. PLoS ONE 10 (3): e0119346. doi: 10.1371 /journal.pone.0119346

Editor do Academic: Lucia R. Languino, Universidade Thomas Jefferson, United States |

Recebido: 25 de julho de 2014; Aceito: 19 de janeiro de 2015; Publicação: 06 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tandon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelo National Institutes of Health conceder R01CA129127, R01CA142580, e ultramarino Hong Kong e Macau Scholars Fund Research Collaborative de NSFC na China ( Grant # 81.328.020). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Co-autor Qiming Jane Wang é um membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

O câncer de próstata é o tumor maligno do sexo masculino mais comum nos países ocidentais [1] e a segunda principal causa de câncer morte em os EUA, o que representa 29% de todas as mortes por câncer do sexo masculino [2]. Enquanto doença localizada pode ser tratada por algumas modalidades, a etapa metastático é paliativo em vez de terapêutica e há actualmente nenhum tratamento eficaz. Proteína quinase D (PKD) é uma família de cinase de proteína serina-treonina ubíquo que pertence ao Ca

2 + /dependente de calmodulina-proteína quinase superfamília [3]. As três isoformas de PKD (PKD1 /PKCμ [4], PKD2 [5] e PKD3 /PKCν [6]) são amplamente distribuída em vários tecidos, e são homólogas em estrutura e função. PKDs são activados por proteína quinase Cs (PKCs) através da fosforilação de dois resíduos de serina conservada na ansa de activação do domínio quinase. Para PKD1, activação envolve a fosforilação mediada por PKC em Sor

738 e Ser

742 na ansa de activação, seguida de auto-fosforilação de Ser

910 que transmite a activação completa [7,8].

PKD desempenha um papel importante na mediação de sinalização mitogénica e tem sido demonstrado para potenciar a proliferação de células induzida por GPCR através da via de MEK /ERK /RSK [9]. A evidência emergente demonstra o envolvimento de PKD em vias principais de sinalização que regulam a proliferação de células de tumor, tais como β-catenina, o receptor de androgénio, mTORC1-S6K1, e MAPK em vários modelos de células de tumor [10-15]. Colectivamente, este pegada mecanicista demonstra um papel importante no cancro de PKD, fornecendo a base de segmentação de PKD utilizando inibidores de moléculas pequenas para a terapia do cancro.

Nos últimos anos, o desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas que o alvo da família PKD tem avançado significativamente [15-19]. Após a descoberta do primeiro CID pequena molécula inibidora potente, selectivo e célula-ativo 755.673 pelo nosso grupo [20,21] que dirigiu esforços significativos na melhoria da sua potência e selectividade através de modificações químicas. Enquanto desenvolvemos leads com muito melhor potência e selectividade, como kb-NB142-70 [20,22], o

in vivo

eficácia e aplicabilidade desta classe de inibidores permaneceu limitado [23]. Um estudo recente utilizando bibliotecas alvo de inibidores da quinase orgânicas pequenas também identificou um andaime romance ATP-competitiva 4-azaindole, e um conjunto de inibidores de pequenas moléculas pirazolopirimidina com baixa potência nanomolar para

in vitro

inibição da PKD que potencialmente bloqueou a proliferação de células cancerosas da próstata e crescimento [18,24,25]. Apesar dos esforços imensos para com o desenvolvimento de inibidores potentes e selectivos de pequenas moléculas PKD para a terapia do cancro, ainda existe grande demanda por eficazes

em inibidores de pequenas moléculas vivo

-active PKD capaz de progredir em desenvolvimento pré-clínico e ainda mais para a clínica aplicação.

no presente estudo, identificou-SD-208 como um romance ATP-competitiva PKD inibidor de molécula pequena

in vitro

e

in vivo

. Em células de cancro da próstata, que mostrou que a DP-208 suprimiu significativamente a proliferação das células do tumor através da inibição específica de PKD e bloqueou a invasão de células de tumor. Uma investigação mecanicista sugeriu que DP-208 revogada proliferação de células de cancro através da indução /M G2 paragem do ciclo celular aumentando inibidor de quinase dependente de ciclina (CDKI) -p21 níveis e modular a actividade do Cdc25C /via de Cdc2. Além disso, o DP-208 bloqueou a proliferação de células de cancro PC3 próstata e o crescimento de xenoenxertos de tumores em ratinhos nus, correlacionando-se à diminuição da Bcl-xL e survivina. Nós também gerou uma série de análogos de SD-208 por síntese química, e avaliou o seu perfil inibitório, demonstrando uma estreita SAR para este estrutura de liderança. Nossos resultados, portanto, caracterizar SD-208 como um estruturalmente nova PKD inibidor pequena molécula que revoga significativamente a proliferação das células do câncer de próstata

in vitro

e

in vivo

.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado de acordo com a Institutional animal Care e Use Committee (IACUC) nas orientações Universidade de Pittsburgh e do protocolo de animais e estudo foi aprovado pela Universidade de Pittsburgh Institutional animal Care e do Comité do usuário (número de protocolo: 11120102).

cultura de células e reagentes

próstata humano carcinoma PC3, células DU145 e LNCaP foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas de acordo com o recomendação do fabricante. Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C, 5% de CO

2 numa atmosfera humidificada. de Ham F-12 e foram MEM de Cellgro (Manassas, VA) e outros materiais eram de cultura a partir da Invitrogen (Life Technologies, Carlsbad, CA). Quinase activa proteína cinase humana marcada com GST recombinante D1 (PKD1) foi obtido a partir de Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY). O DMSO foi adquirido a Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Recombinante PKCα, PKCδ, e foram obtidos a partir CAMKIIα SignalChem (Richmond, BC, Canadá). ATP foi comprado a Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). péptido substrato HDAC5 foi sintetizado por Biobasic Canada Inc. (Markham, ON). Proteína básica de mielina 14/04 foi adquirido a AnaSpec Inc. (Fremont, CA). Uma biblioteca de inibidor de cinase farmacologicamente activo foi adquirido a Tocris Bioscience (Minneapolis, MN).

Síntese da DP-208 Análogos

Decidimos modificar quimicamente o 5-cloro-2-fluorofenilo (

zona 1

) e a

para

-aminopiridina (

zona 2

) porções de SD-208 para sondar as contribuições destas cadeias laterais à inibição PKD1 (Tabela 1 e S1 FIG.). Detalhes de síntese são descritos no

Informações de Apoio

.

Docking de SD-208

Este estudo foi realizado conforme relatado anteriormente [25]. O modelo de homologia estrutural do domínio de cinase de PKD1 (resíduos 587 a 835) foi gerado utilizando o servidor de I-TASSER. Sybyl-X 2.1 software Surflex-Dock realizado o corte da SD-208 no domínio quinase de PKD1. As configurações do programa foram configurados sob os parâmetros subsequentes. Todos os átomos de hidrogénio foram presente tanto no modelo de homologia, bem como SD-208. A área de acoplagem foi restrito dentro dos limites do sítio de ligação ATP, que incluem os seguintes resíduos: Ala

610, Lys

612, Met

659, Glu

660, Lys

661, Leu

662, Sua

663, Glu

710, Leu

713 e Cys

726. Vinte conformações partida adicionais foram avaliados para DP-208 e todos os meios de ligação foram avaliados. modelagem molecular foi apresentada usando PyMOL.

In Vitro

radiométrica PKD Inhibitor Screening Assay

O

in vitro

radiométrica ensaio PKD quinase foi utilizado para rastrear uma pequena biblioteca de 80 inibidores de cinase disponíveis comercialmente, Tocriscreen recolha inibidor de cinase (Tocris Biosciences, Minneapolis, MN), para a actividade inibidora de PKD1 em uma concentração uM [24].

In Vitro

protocolo radiométrica é descrito na informação

Apoio

.

células cancerosas da próstata Western Blot Analysis

LNCaP e DU145 foram mantidas em RPMI 1640, enquanto que as células PC3 foram mantidas em meio F-12 de Ham, suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1000 unidades /l de penicilina, e 1 mg /ml de estreptomicina, em 5% de CO

2 a 37 ° C. Uma análise por Western blot foi realizada tal como anteriormente relatado [10]. Os anticorpos primários alvo pS

916-PKD1 (humana pS

910-PKD1) (Millipore), pS

744/748-PKD1 (PS humana

738/742-PKD1), PKD1, PHSP 27 , Hsp 27, p21, ciclina A2, p-Cdc2, Cdc2, ciclina B1, p-Cdc25C, Cdc25C, Survivin, Bcl-XL, Akt e pS

473-Akt (Cell Signaling Technology), PKD2 (Abcam), ciclina D1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX), GAPDH (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) e tubulina (Sigma) foram utilizados para secar.

In Vitro radiométrica PKC e CAMKIIα Kinase Assay

O ensaio de quinase PKC foi realizada por co-incubação de 1 uCi de [γ-

32P] ATP, ATP 20 | iM, 50 ng de PKCα purificado ou PKCδ e 5 ug de proteína básica de mielina 14/04, 0,25 mg /mL de albumina de soro bovino, 0,1 mg /mL de fosfatidilcolina /fosfatidilserina (80/20%) (1 uM), 1 uM dibutirato de forbol em 50 ul de tampão de cinase contendo Tris-HCl a 50, pH 7,5, MgCl 4 mM de

2 e β-mercaptoetanol 10 mM. Para o ensaio de CaMK, 50 ng de CAMKIIα e 2 ug syntide-2 de substrato em 50 uL de tampão de cinase foram incubadas com 0,1 mM MgCl

2, 1 uCi de [γ-

32P] ATP, 70 uM de ATP. CaCl 0,5 mM

2 e de 30 ng /mL de calmodulina foram pré-incubados durante 15 min em gelo e em seguida adicionada na reacção de quinase. As reacções foram incubadas a 30 ° C durante 10 min e 25 ul da reacção foi manchado em papel de filtro Whatman P81. O papel de filtro foi lavado 3 vezes em ácido fosfórico a 0,5%, secos ao ar e contadas utilizando Beckman LS6500 contador de cintilação polivalente.

Ensaio MTT

células PC3 foram semeadas em placas de 96 poços (3000 células /poço) e deixadas a ligar durante a noite. As células foram depois incubadas em meio contendo inibidores de 0.7-100 ^ M durante 72 h. 50 mL de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio metil tiazolil tetrazólio solução (MTT) a 2 mg /ml de concentração foi adicionado a cada poço e incubou-se durante 4 h a 37 ° C . Em seguida, o meio foi removido e 200 mL de DMSO foi adicionado a cada poço. A placa foi misturada por agitação durante 5 min e a densidade óptica foi determinada a 570 nm.

subcutânea tumor da próstata Estudo de Xenoenxerto

ratinhos atímicos nu NCr-nu /(4-6 semanas de idade) (NCI, Frederick, MD) foram injectados subcutaneamente com 1,4 x 10

6 células PC3 em 100 uL meios. Três dias após a inoculação, quando se tornou palpável de tumores, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos (5 ratinhos por grupo); (A) veículo (controlo) 1% (w /v) de metilcelulose administrado por sonda oral duas vezes por dia; (B) DP-208 de 60 mg /kg suspensos em metilcelulose a 1% administrada por sonda oral duas vezes por dia, durante 21 dias. Os pesos corporais foram medidos duas vezes por semana. Os tumores foram medidos em duas dimensões a cada 2 a 3 dias por pinças e volume do tumor foi calculado como

V

(mm

3) = (

L X W

2) /2. Os volumes tumorais foram comparados em cada momento entre os grupos utilizando o teste t não pareado e uma

p valor

de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Vinte e quatro dias após a inoculação, os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO

2 inalação e os tumores foram excisados. Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com uma Comissão de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Pittsburgh.

imuno-histoquímica (IHQ) Coloração de tecidos tumorais

formalina-fixo e embebido em parafina secções foram coradas como descrito anteriormente [10]. Resumidamente, as secções foram deparraffinized por xileno e re-hidratadas em reduzir os gradientes de etanol. A recuperação de antígenos foi realizada por fervendo as lâminas à temperatura próximo da ebulição durante 30 minutos em 10 nmol /L de tampão citrato de sódio (pH 6,0), seguindo-se arrefecimento até à temperatura ambiente. As secções de tecido foram então coradas com Ki-67 (Genetex, Irvine, CA) e caspase-3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), anticorpos, a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incubadas com anticorpo anti-coelho de cabra biotinilado (Vector Laboratories, Logan, UT). As lâminas foram então desenvolvido usando kit Vectastain ABC Standard and AEC Reagente (Scytek Labs, Logan, UT). Os tecidos foram finalmente contrastadas com hematoxilina. Um total de 10 campos foram examinadas e contadas em cada grupo de tratamento de um modo cego.

A imunoprecipitação e p-quinase PKD2 Ensaio

PKD2 foi imunoprecipitado por incubação de 500 ng de lisados ​​celulares totais de tumores explantes com proteína a /G Sefarose grânulos (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) com preconjugated PKD2 anti-anticorpo (GeneTex, Irvine, CA) durante a noite a 4 ° C com rotação constante. Os imunocomplexos foram então sedimentadas e lavadas com tampão de lavagem (Tris-HCl a 50, pH 7,4, cloreto de sódio 150 mM e 1% de Triton X-100). Quantidades iguais de imunocomplexos foram então submetidos a ensaio de PKD quinase, tal como descrito no protocolo de suplemento. Em resumo, o ensaio foi realizado por coincubating 20 ul de PKD2 imunoprecipitados com 25 uM de ATP, 0,2 ul de [γ-

32P] ATP (PerkinElmer vida e Analytical Sciences, Boston, MA) e 1,2 uM de 25 a.a. HDAC-5 péptido como substrato [26], em um volume final de 50 ul. A reacção foi deixada prosseguir a 30 ° C durante 10 min. Uma alíquota da mistura de reacção foi, em seguida, manchado em papel P81, lavada em ácido fosfórico a 5% e contadas.

Ensaio de Proliferação Celular e Análise do Ciclo Celular

A proliferação de células PC3 foi medida por contagem do número de células viáveis ​​após a coloração com azul de tripano como descrito anteriormente [10]. análise do ciclo celular foi realizada como descrito [22]. Resumidamente, as células PC3 foram tratadas com os compostos apropriados de 30 uM durante 72 h, e em seguida fixadas em etanol a 70% arrefecido com gelo durante a noite, seguido de marcação com iodeto de propídio. As células marcadas foram analisadas utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA).

Matrigel Invasão Ensaios

ensaio de invasão de Matrigel foi realizado como previamente descrito [21,22] (ver

Informações de Apoio

para mais detalhes).

a análise estatística

a análise estatística foi concluída usando o software GraphPad Prism 5.0. A

p valor de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Identificação do SD-208 como um romance PKD pequena molécula inibidor

Foi realizado um ecrã de pequenas moléculas inibidoras de PKD na inibidor quinase Tocriscreen coleção de 80 quimicamente diversos inibidores da quinase em uma concentração mM usando um

in vitro

ensaio PKD quinase radiométrica. Com um ponto de corte definido pelo ≥ 50% de inibição da actividade total de PKD1 quinase, 16 compostos foram identificados como acessos primários. Entre eles, SD-208 suprimiram 82% da actividade de PKD1 em uma concentração uM (dados não apresentados) e foi ainda avaliada por inibição de PKD1, 2 e 3 em uma curva de concentração de 10 pontos usando o ensaio de quinase de PKD radiométrica [21]. Como mostrado na Fig. 1A, SD-208 inibiu PKD1, 2, e 3 com uma IC

50 de 106,87 ± 6,6 nM (n = 9), 93,54 ± 2,7 nM (n = 9), e 105,3 ± 2,6 nM (n = 9) , respectivamente. Usando células de cancro de próstata LNCaP como o sistema modelo, o efeito do SD-208 com 12-miristato 13-acetato (PMA) induzida por activação endógena de PKD1, foi analisada como anteriormente descrito [10,22]. Como mostrado na Fig. 1B-C, o tratamento de células LNCaP com 10 nM de PMA durante 20 minutos induziu a ativação PKD1 robusta, detectado pelo aumento da fosforilação alça de ativação PKD1 no Ser

738/742 conferida por PKC e autofosforilação C-terminal no Ser

910 . Pré-tratamento com concentrações crescentes de SD-208 autofosforilação concentração-dependente inibida a Ser

910 de PKD1 com um IC

50 de 17,0 ± 1,5 mM (Fig. 1C). Em contraste, dependente da PKC trans-fosforilação de Ser

738/742 não foi afetada pela SD-208, indicando que SD-208 revogada diretamente a atividade catalítica PKD1 sem bloquear a montante mediada por PKC PKD1 trans-fosforilação. Assim, SD-208 é estruturalmente distinta inibidor pan-PKD que provoca a inibição específica de atividade da quinase PKD1 nas células cancerosas da próstata.

A. Determinação da actividade quinase PKD

in vitro

. Inibição de PKD1 humano recombinante, 2 e 3 foi ensaiado na presença de 10 concentrações diferentes de DP-208 por um

In vitro

ensaio radiométrico de PKD quinase. Os sub

50 valores IC foram calculados como a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes com determinações em triplicado em cada concentração de composto em cada experiência. Os dados foram representados como uma função da concentração de inibidor e um gráfico representativo é mostrado. B. SD-208 inibiu a ativação PKD1 induzida por PMA em células de câncer de próstata. As células LNCaP foram pré-tratados com diferentes doses de inibidores durante 45 min, seguido de estimulação com PMA a 10 nM durante 20 min. lisados ​​celulares foram submetidas a immunoblotting para p-S

910-PKD1 e p-S

738/742-PKD1. Tubulina foi transferido como controlo de carga. A experiência foi repetida três vezes e os blots representativos são mostrados. C. Determinação do celular IC

50. Western blot de “B” foram quantificados utilizando análise de densitometria. Os dados foram representados graficamente e IC

50 valores foram derivados a partir das curvas concentração-resposta utilizando GraphPad. Uma das três curvas de concentração-resposta é mostrada. D. DP-208 é um inibidor de cinase ATP-competitivo. PKD1 actividade cinase foi medida como uma função de concentrações crescentes de ATP na presença de concentrações variáveis ​​de DP-208. lotes de Lineweaver-Burke dos dados são mostrados. Os dados apresentados foram a média ± E.P. de três experimentos independentes com determinações em triplicado em cada ponto de dados em cada experimento. E-F. Seletividade de SD-208 contra quinases relacionadas. A inibição da PKCα (B) ou PKCδ (C) foi determinado a 10 nM, 100 nM, 1 uM e 10 uM. Como controlos, o inibidor de PKC GF109203X potentemente inibida actividade PKCα e PKCδ. Os dados são a média ± SEM de duas experiências independentes. G. Inibição de CAMKIIα foi medida pelo ensaio de quinase CaMK radiométrica. Os dados são a média ± S.E. de dois experimentos independentes com determinações em triplicado em cada ponto de dados em cada experimento. A significância estatística foi determinada usando o teste-t não emparelhado. NS, não significativo significativamente; *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P . 0.001

SD-208 era um inibidor da ATP-do competidor com alta seletividade para PKD mais estreitamente relacionadas quinases

Para obter uma melhor visão sobre o modo de de acção para a SD-208, que examinou os efeitos de concentrações crescentes de ATP na inibição PKD1. lotes de Lineweaver-Burk foram gerados através da representação gráfica do recíproco das velocidades de reacção (1 /v) contra o recíproco da concentração de ATP (1 /[ATP]), em concentrações de compostos diferentes. Os pontos foram ajustados por regressão linear. Como se mostra a Fig. 1D, todas as linhas convergentes no eixo Y, o que indica que DP-208 era um inibidor de ATP-competitivo. Em seguida, determinou-se a especificidade do SD-208 para PKD, examinando a sua actividade para as isoformas de PKC clássicas e novas usando PKCα e PKCδ. Sem actividades inibidoras significativas para as isoformas de PKC foram detectados a 0,1 e 1 uM e para PKCα a 10 uM (Fig. 1E-F). O potente inibidor de PKC GF109203X foi testado como um controlo positivo e de forma potente e dependente da concentração-inibição e PKCα PKCδ. Alta homologia de sequência de PKD com a família CaMK nos levou a investigar a inibição da CAMKIIα pelo SD-208. Como ilustrado na Fig. 1G, SD-208 não apresentou actividade em CAMKIIα até 10 uM. Tomados em conjunto, estes dados indicam que SD-208 é um inibidor altamente específico para PKD em relação a outras quinases intimamente relacionadas entre eles o PKCS e CAMKs.

Síntese, análise de SAR, e modelagem de SD-208 e seus análogos

a nossa abordagem para os estudos sintéticos, como detalhado em S1 Fig., baseou-se em duas zonas de substituição em SD-208, em que o 2-fluoro-5-clorobenzeno representa a zona 1 e 4-aminopiridina representa zona 2 ( Fig. 2). Usando o núcleo pteridina como uma plataforma sintética, estávamos interessados ​​em explorar as substituições ligados ao anel de pirimidina fundido, especificamente para identificar as contribuições de SAR dos substituintes flúor e cloro na zona 1 e o anel piridina na zona 2. A amina secundária em zona 2 foi preservado porque aminoácidos substituições alfa a átomos de nitrogênio em heterociclos são frequentemente implicado na dobradiça da proteína quinase vinculativo [27,28]. Como consequência, a amina secundária pode revelar-se essencial para a atividade.

modelo 2-Zone para síntese analógica SD-208.

Investigação

Nossa SAR inicialmente focada na importância dos substituintes sobre o anel aromático na zona 1 (Tabela 1). A densidade de electrões do anel aromático em SD-208 é diminuída pela electronegatividade do átomo de flúor [29,30]. Além disso, o cloro pode contribuir para interacções dipolo-dipolo na fenda de ligação proteína [31]. A remoção dos átomos de halogénio do anel de benzeno (5a-d) levou a uma actividade significativamente reduzida. Em contraste, a instalação de grupos de remoção de electrões tais como flúor (5e-g) e actividade restaurada trifluorometil (5H), mas apenas quando a zona 2, constituído por 4-aminopiridina (5e, h). Interessantemente, apenas a 4-aminopiridina foi tolerada na zona 2. Assim, as nossas tentativas para melhorar a solubilidade com piperazina (5j) e 2-morfolinoetilo (5g) substituintes falhou para conservar efeitos inibidores de PKD1. Surpreendentemente, mesmo um regioisómero, 3-aminopiridina (5-D, F), não era tolerada. Esta observação sugere que o átomo de azoto no anel de piridina pode estar envolvida em interacções essenciais de ligação de hidrogénio, mas apenas em um arranjo espacial específica. diversificação adicional de zona 1 com substituintes 3,5-dicloro (5i) não restaurar a atividade. Isto apoia ainda mais a importância do grupo de remoção de electrões desde cloro é menos electronegativo que o flúor. Mudando as posições dos substituintes no anel benzeno na 2,5-difluoro- (5-E) e 3-trifluorometil- (5H) análogos de actividade conservada. Este resultado indica que a posição dos substituintes nesta areno pode não ser crítica, desde que o grupo funcional é suficientemente electrões retirada.

Em conjunto com esta análise SAR, empregamos o nosso modelo de homologia de PKD1 [25] para explorar racionalmente um modo de ligao putativo de DP-208 no interior do sítio activo de PKD1. Comum entre os inibidores de ATP-competitivo, SD-208 foi mostrado na Fig. 3A para interagir com a região de charneira, através da formação de ligações de hidrogénio entre o esqueleto de aminoácidos de Leu

662 e o seu núcleo de pteridina. Além disso, uma ligação de hidrogénio potencialmente crítico foi observado com o azoto a partir da 4-aminopiridina e a cadeia lateral carregada de Lis

612. A interacção semelhante também foi relatado em outros inibidores de PKD1 conhecidos [18]. Nossa análise SAR suporta ainda a noção de que o azoto dos atos 4-aminopiridina como uma valiosa receptor de ligação de hidrogênio. Ablação desta ligação revelou uma acentuada diminuição na inibição PKD1. Além disso, apresentada na Fig. 3B, o nosso modelo posiciona o anel fenil dissubstituído em um bolso hidrofóbico que consiste em Leu

589 e Leu

713, o que pode ditar a tolerância de substituições aromáticas. Embora outros modos de ligação de SD-208 foram exploradas, o modelo atual melhor recapitulou resultados representados na nossa análise SAR.

Esta descrição demonstrou um modo de ligação potencial do SD208 no sítio ativo de PKD1. linhas pontilhadas vermelhas representam interacções-chave entre SD-208 e PKD1.

SD-208 proliferação e células de câncer de próstata inibiu a invasão

A seguir, investigou os efeitos da inibição específica de PKD por SD -208 sobre a proliferação de células do cancro da próstata, a sobrevivência e a progressão do ciclo celular. Como mostrado na Fig. 4A-B, SD-208 a 30 ^ M causou uma redução significativa na proliferação de células de cancro da próstata PC3 começando no dia 2 e persistiu até ao final da experiência. DP-208, também dependente da concentração, com a morte celular induzida por um IC

50 de 17,0 ± 5,7 uM (n = 3) (Fig. 4C). O efeito do SD-208 na invasão de células de tumor foi avaliada utilizando o ensaio de invasão de Matrigel (a invasão de células). Como ilustrado na Fig. 4D, o tratamento de células com 30 uM SD-208 durante 20 h resultou em mais de 60% de inibição da invasão de células comparado com o controlo, indicando que a DP-208 bloqueou significativamente a invasão de células tumorais. Tomados em conjunto, os nossos dados demonstram que DP-208 é um inibidor potente da proliferação de células de cancro da próstata e invasão.

A-B. SD-208 inibiu PC3 (A) e a proliferação de células de cancro da próstata LNCaP (B). células PC3 e LNCaP foram plaqueadas em triplicado em placas de 24 poços. As células foram deixadas a ligar durante a noite. Uma contagem de células no dia 1 foi feito e, depois, foi adicionado um veículo (DMSO) ou DP-208 a 30 pM. As células foram contadas diariamente durante um total de 6 dias. Os dados são a média ± S.E. de dois experimentos independentes com determinações em triplicado em cada ponto de dados em cada experimento. C. SD-208 a sobrevivência de células de cancro de próstata PC3 inibida. células PC3 foram semeadas em placas de 96 poços (3000 células /poço) e foram depois incubadas em meio contendo inibidores de 0.3-100 ^ M durante 72 h. solução adicionou-se MTT a cada poço e incubou-se durante 4 h. A densidade óptica foi lida a 570 nm para determinar a viabilidade celular. A IC

50 foi determinado como a média de três experiências independentes para cada composto. D. DP-208 inibiu a invasão de células de cancro da próstata. células DU145 foram incubados com 30 uM SD 208 em inserções de Matrigel. Após 20 h, as células não-invasivos foram removidos e as células invasoras foram fixadas em 100% de metanol, coradas em hematoxilina solução de 0,4%, e fotografados. O número de células que invadiram a matriz Matrigel foi determinada por contagem das células em campos 6 em relação ao número de células que migraram através do mecanismo de comando. invasão de percentagem foi calculada como a percentagem das células invadidas por meio de Matrigel insere contra as células totais migraram através dos insertos de controlo. Os dados são a média ± S.E. de três experimentos independentes com determinações em triplicado em cada ponto de dados em cada experimento. A significância estatística foi determinada usando o teste-t não emparelhado. ***, P 0,001. E-F. A sobre-expressão de PKD1 e PKD3 em células de cancro da próstata resgatado os efeitos anti-proliferativos de DP-208. PC3 (0,5 milhões), as células foram semeadas numa placa de 60 mm e infectados no dia seguinte com 50 e 100 MOI de PKD1 e adenovírus (Adv PKD3-PKD1 e Adv-PKD3). adenovírus vazio (Adv-null) foi utilizado como controle. Após 24 h, 3000 células /poço foram semeadas em placas de 96 poços e tratadas com e sem 10 e 30 uM SD-208 durante 72 h. solução adicionou-se MTT a cada poço e incubou-se durante 4 h. A densidade óptica foi lida a 570 nm para determinar a viabilidade celular. A sobre-expressão de PKD1 e PKD3 foi confirmada por análise de transferência de Western. Esta experiência foi repetida três vezes e os dados são a média ± E.P. de todas as três experiências independentes. A significância estatística entre DMSO e tratamento inibidor foi determinada usando o teste-t não emparelhado *, p . 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. G. PKD atividade Hsp27 mediada em células de câncer de próstata foi inibida pela SD-208. células DU145 foram pré-tratados com diferentes doses de inibidores durante 45 min, seguido de estimulação com PMA a 10 nM durante 20 min. lisados ​​celulares foram submetidas a immunoblotting para p-S

910-PKD1 e p-S

738/742-PKD1. GAPDH foi transferido como controlo de carga. O experimento foi repetido duas vezes e as manchas representativos são mostrados.

paragem do crescimento induzida SD-208 foi mediada através da inibição específica de PKD

Para determinar a especificidade alvo de DP- 208, ao nível celular, procurou-se investigar se SD-208 induzida por efeitos anti-proliferativos foram mediados embora segmentado inibição de PKD. Foi feita uma tentativa para reverter o efeito do inibidor de PKD através de superexpressão de isoformas diferentes PKD. Como mostrado na Fig. 4E-F, as células PC3 foram infectadas com adenovírus nula (Adv-null) e adenovírus transportando PKD1 e genes PKD3 (Adv-PKD1 e Adv-PKD3) a 50 e 100 MOI. Western blotting revelaram a sobre-expressão de PKD1 e PKD3 em células PC3 infectadas com adenovírus que transportam os respectivos genes. As células infectadas foram sujeitas a um tratamento SD-208 a 10 e 30 uM. A expressão de níveis crescentes de PKD1 e PKD3 reverteu os efeitos anti-proliferativos de DP-208. Os níveis mais elevados de expressão de PKD1 ou PKD3, maiores serão os efeitos de salvamento, e a 100 MOI uma inversão quase completa de inibição da proliferação celular foi observado para Adv-PKD3 em 10 e 30 uM DP-208 (Fig. 4). Estes dados indicam que os efeitos anti-proliferativos de DP-208 são mediadas através da inibição de PKD. A fim de determinar se a propriedade anti-proliferativa do SD-208 é devido à inibição específica de PKD, procuramos determinar se ele também inibiu PKD mediada PMA-induzida Hsp27 fosforilação de Ser-82 em células de câncer de próstata (Yuan e Rozengurt de 2008 ). Hsp27 é um substrato directo bem estabelecido de PKD [32,33]. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig. Como mostrado na Fig.