Abstract

Novas estratégias são necessárias para melhorar a resposta a quimioterapia no câncer de endométrio avançado e recorrente. Aqui, demonstramos que os terpenóides presentes no vapor destilada Extracto de gengibre (SDGE) são inibidores potentes da proliferação de células de cancro do endométrio. SDGE, isolado a partir de seis lotes diferentes de rizomas de gengibre, de forma consistente inibiu a proliferação das linhas celulares de cancro do endométrio e de Ishikawa ECC-1 do IC

50 de 1,25 ug /ml. SDGE também aumentou o efeito anti-proliferativo de radiação e cisplatina. A diminuição da proliferação de células de Ishikawa e ECC-1 foi um resultado directo da apoptose induzida por SDGE como demonstrado por FITC-anexina V a coloração e expressão da caspase 3. clivado análise por CG /MS identificou um total de 22 compostos terpenóides diferentes em SDGE, com a isômeros neral e constituindo geranial 30-40%. Citral, uma mistura de neral e geranial inibiu a proliferação de células de Ishikawa e ECC-1 a um IC

50 10? M (2,3 ug /ml). compostos fenólicos tais como gingerol e shogaol não foram detectados em SDGE e 6-gingerol foi um inibidor fraco da proliferação das células de cancro do endométrio. SDGE foi mais eficaz em induzir a morte de células de câncer de citral, sugerindo que outros terpenos presentes na SDGE também estavam contribuindo para a morte de células de câncer endometrial. SDGE tratamento resultou num aumento rápido e forte em cálcio intracelular e uma diminuição de 20-40% no potencial de membrana mitocondrial. Ser-15 de p53 foi fosforilada após 15 min de tratamento das células cancerosas com SDGE. Este aumento na p53 foi associada a uma diminuição de 90% em Bcl2 ao passo que não se observou qualquer efeito sobre a Bax. Inibidor de p53, pifithrin-α, atenuou os efeitos anti-cancro de SDGE e apoptose, também não foi observado no p53

neg células SKOV-3. Os nossos estudos demonstram que terpenóides de SDGE mediar a apoptose pela ativação de p53 e deve ser, portanto, ser investigados como agentes para o tratamento de cancro do endométrio

Citation:. Liu Y, Whelan RJ, Pattnaik BR, Ludwig K, Subudhi E, H Rowland, et ai. (2012) Terpenoids de

Zingiber officinale

(Ginger) induzir a apoptose em células de cancro endometrial através da activação de p53. PLoS ONE 7 (12): e53178. doi: 10.1371 /journal.pone.0053178

editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Research Center, Arábia Saudita

Recebido: 10 Agosto, 2012; Aceito: 26 de novembro de 2012; Publicado: 31 de dezembro 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento para esta pesquisa foi fornecido por doações do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia de AK e MSP, uma doação de caridade de Jean McKenzie e bolsas de investigação do cancro da Aliança Wisconsin ovário para MSP ea Rebecca Meyer Brown Professorship do Instituto de pesquisa UW-olho (retina Research Foundation) para BRP. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

no ano de 2011, aproximadamente 8.010 mulheres morreram devido ao câncer de endométrio e cerca de 47.130 pacientes foram diagnosticadas com este cancro [1]. Em cerca de 70% das mulheres com um diagnóstico de cancro do endométrio, a doença é encontrada localizada no corpo uterino e cinco anos de sobrevivência é tão elevada como 85% [2]. doentes com cancro do endométrio avançadas e recorrentes, matriculados em diversos ensaios grupo de oncologia ginecológica (GOG) para os agentes, incluindo platina, taxanos e antraciclinas, raramente têm respostas completas à terapia [3] – [9]. regimes combinados mostram maiores taxas de resposta, mas o período livre de progressão com estas terapias é relativamente baixa (5-7 meses), com maior morbidade e continuada falta de cura [10]. Estas estatísticas destacam a necessidade para o desenvolvimento de novos e quimiopreventivo eficaz e agentes quimioterápicos para câncer endometrial.

ocorrem naturalmente componentes alimentares constituem uma importante fonte de compostos bioativos que podem servir tanto como quimiopreventivo, bem como agentes quimioterápicos contra endometrial e outros tipos de cânceres [11]. Nosso laboratório está actualmente a investigar as propriedades anti-câncer de compostos presentes nos rizomas de gengibre (

Zingiber officinale

). Estes estudos são suportados por estudos anteriores que demonstram que o gengibre pó seco ou extractos de solventes de raízes de gengibre induzir a paragem do ciclo celular e apoptose na pele, da mama, da próstata, do cólon, do ovário e células cancerosas [12] – [17]. A aplicação tópica do extracto etanólico de gengibre diminuiu a incidência, o tamanho e o número de DMBA /TPA tumores induzidos em ratinhos SENCAR [18].

A maioria dos estudos anteriores concluíram que os componentes bioactivos do pó seco e extracção com solventes de rizomas de gengibre responsável pelas atividades anti-câncer são os compostos fenólicos 4, 6, 8 e 10- gingerols, Paradol e shogaol, um produto formado depois da secagem ou aquecimento das raízes [19] , [20]. Estes compostos fenólicos, e especialmente os gingerols exibem anti-proliferativa e propriedades anti-angiogénicos como demonstrado pela

in vitro

e

in vivo

estudos em vários modelos de cancro [13], [14], [16], [21] – [25]. células de cancro colorrectal humano quando tratado com 6-gingerol, inibiu a proliferação celular através da indução de paragem do ciclo celular G1 e apoptose [26]. Gingerols exibem esses efeitos anti-cancro por meio de vários mecanismos, incluindo a degradação da proteína, bem como β-catenina, PKC delta, e as vias de GSK3 beta [26]. Os estudos no modelo de cancro do ovário demonstraram que o 6-shogaol inibe a secreção de VEGF pelas células cancerosas [16]. 6-gingerol induz apoptose na linha celular de cancro da próstata LnCaP através do aumento da expressão de p53 e Bax e, simultaneamente, diminuição da expressão de Bcl-2 [16], [17], [21].

Além o gengibre em pó e o solvente de extracção, compostos bioactivos podem também ser isolado por destilação a vapor deste rizomas [27], [28]. Para o melhor de nosso conhecimento, apenas estudos limitados foram realizados para demonstrar as propriedades anti-câncer do vapor extractos destilados de gengibre. A análise química do extracto destilado a vapor de gengibre indica que os compostos fenólicos bioactivos previamente identificados estão presentes em muito baixa concentração em que o vapor extractos destilados de gengibre [27]. No presente estudo demonstra-se que o vapor destilada extractos de gengibre são potentes mediadores da apoptose em células de cancro do endométrio. Nossos estudos sugerem que um dos principais componentes bioactivos do extracto destilado a vapor de gengibre é citral (uma mistura de dois isómeros terpenóides, neral e geranial). Nós demonstramos que o tratamento das células de cancro do endométrio com o extracto destilado a vapor de resultados do gengibre em aumento significativo do cálcio intracelular, diminuição do potencial de membrana mitocondrial, aumento na expressão de caspase 3, a fosforilação da proteína p53, e uma redução significativa na expressão de Bcl-2. As observações descritas em nossos estudos demonstram que o extrato de vapor destilado de gengibre e seus componentes bioativos têm o potencial de ser desenvolvido como agentes quimiopreventivos e quimioterapêuticos para o cancro endometrial.

Materiais e Métodos

Reagentes e Linhas celulares

Pifithrin-α foi adquirido de Sigma Life Science. DMEM (Modificação de Meio de Eagle de Dulbecco), meio RPMI-1640, Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS), e Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS) foram da Cellgro (Manassas, VA). DiOC6, Ionomicina e Indo-1 AM foram adquiridos a Life Technologies (Grand Island, NY). SuperSignal Oeste Dura Duração estendido tampão RIPA e Substrato Protease Inhibitor Cocktail eram de ThermoFisher Scientific (Waltham, MA). anticorpo de coelho caspase-3 primário, anticorpo de coelho Bcl-2, Bax, anticorpo de coelho, fosfo-P53 de murganho e anticorpo de ratinho β-actina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). AffiniPure anticorpo IgG de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase e anticorpo AffiniPure de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com peroxidase foram da Jackson ImmunoResearch Laboratories (West Grove, PA). kit de FITC-anexina V de detecção da apoptose foi adquirido da BD Pharmingen (San Diego, CA). ECC-1 [29], [30] e Ishikawa [31] células eram um presente de Drs. Elaine Alarid e David Olive (Madison, WI), respectivamente. As células SKOV-3 foram adquiridos a partir de ATCC (Manasas, VA).

Cultura celular

células Ishikawa foram cultivadas em DMEM e ACE-1 e SKOV-3 foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina /estreptomicina antibióticos em uma CO 5%

2 incubadora.

destilação a vapor de Ginger rhizomes

rizomas de gengibre foram obtidos de fornecedores locais , feita com água destilada e cortada em pedaços de 0,5 cm. Aproximadamente 250-300 g dos pedaços de gengibre cortadas foram transferidos para o frasco de 1000 mL de fundo redondo do aparelho de destilação de vapor Clevenger. As raízes foram gengibre submerso em 500 ml de água desionizada (18 MOhm-cm) e a destilação a vapor foi realizada durante 4-6 horas, aquecendo o balão. O óleo separa na Clevenger estava mais leve do que a água e foi separada por drenagem periodicamente o líquido que se acumula no tubo de separação da unidade. O óleo foi imediatamente dividido em alíquotas em tubos de microcentrífuga e congeladas até serem usadas em ensaios. A densidade do óleo foi calculada como sendo 0,87 g /mL e esta medida foi usada para calcular a concentração do extracto utilizado para conduzir os ensaios biológicos.

Ensaios de Proliferação de Células

Efeito do vapor extractos destilados gengibre, citral, e 6-gingerol sobre a proliferação de linhas celulares de cancro foi determinada pelo 3- (4,5-dimethythiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT) método de absorção de [32 ], [33]. Resumidamente, as células de cancro foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5000 células /poço no seu respectivo meio. As células foram então tratadas com várias concentrações de extracto de gengibre (0,025 ug, 0,25 ug, 2,5 ug, 6,25 ug e 12,50 ug /ml) e incubou-se a 37 ° C num CO 5%

2 ambiente durante 24 h, 48 h e 72 h. Após o período de tempo designado, 20 ul de ácido 3- (4,5-dimethythiazol-2-il) -2,5-difenil foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas a 37 ° C durante mais 3 h. Os cristais de formazano formados nas cavidades foram dissolvidos em 100 ul de DMSO. A absorvância foi medida a 570 nm utilizando um espectros MAX 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

O tratamento combinado de células cancerosas com SDGE e radioterapia ou quimioterapia

ensaios MTT foram conduzidos para determinar Se SDGE aumentou o efeito anti-proliferação de radiação ou quimioterapia, em que as células de cancro do endométrio. células de Ishikawa, ou ECC-1 foram plaqueadas em múltiplas placas de 96 poços (5 x 10

3 células /cavidade) no dia 1 da experiência. Depois de permitir que as células se estabilizar, meios de comunicação ou SDGE foram adicionados aos poços que contêm as células de cancro do endométrio no dia 2. As células em alguns dos poços foram também tratados com cisplatina (5 uM), enquanto outros foram irradiados com uma dose única de 4 Gy usando um radiador de Césio-137. Seguindo estes tratamentos, as células foram cultivadas durante 72 h a 37 ° C em 5% de CO

2 ambiente. Efeito do tratamento sobre a proliferação das células de cancro do endométrio foi determinada através da realização dos ensaios de MTT como descrito acima.

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas de SDGE

Separação e identificação de compostos em amostras usadas SDGE um cromatógrafo de gás Shimadzu GC-17A equipado com um QP-5000 analisador de massa quadrupolar (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD). Antes da análise, 20 ul de SDGE recentemente descongelado foi dissolvido em 1000 mL de pentano. 1 ul do extracto obtido dissolvido foi injectada manualmente para o cromatógrafo de fase gasosa utilizando uma razão de divisão 01:50 entrada e hélio como gás transportador, a um caudal de 1,4 ml /min. O cromatógrafo de gás continha uma coluna não polar RTX-5MS (30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro, 0,25 mm de espessura de filme;. Restek, Bellefonte, PA) A temperatura da coluna foi inicialmente de 70 ° C, seguido de uma rampa, a 4 ° C /min até 180 ° C. detecção de ionização de electrões foi em-verificação completa, modo ião positivo acima de uma razão de massa-para-carga (m /z) da faixa de 41 a 300. Os compostos foram tentativamente identificadas através de pesquisa de uma biblioteca NIST e por comparação dos índices de retenção para aritméticas valores relatados por Adams [34].

Medição da apoptose por citometria de fluxo

a apoptose foi medida utilizando o kit de FITC-anexina V de detecção da apoptose (BD Pharmingen, San Diego, CA). Resumidamente, 2 × 10

6 as células foram tratadas com 0,25? G /ml de extracto de gengibre, com ou sem 100 uM Pifithrin-α. Após incubação a 37 ° C durante 0-16 h, as células foram lavadas duas vezes com PBS frio e ressuspensas em tampão de ligação 1 ×, (10 mM HEPES /NaOH, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM

2) a uma concentração de 1 × 10

6 células /ml. Em seguida, 1 × 10

5 células em 100 ul de tampão de ligação, foram transferidos para tubos de 5 ml e coradas com 5 uL de FITC-anexina V e iodeto de propídio 5 ul (PI). As células foram suavemente agitadas e incubadas à temperatura ambiente durante 15 min. Após lavagem das células com 1 × tampão de ligação para remover o excesso de FITC-anexina V e PI, as células foram analisadas num citómetro de fluxo FACSCalibur. Os dados foram analisados ​​utilizando o software FlowJo

ensaio do ciclo celular.

As células de cancro do endométrio foram tratados com SDGE (250 ng /ml ou 2,5 ug /ml) durante 24, 48, e 72. h. Após o tratamento, as células foram colhidas, lavadas com PBS e fixadas em etanol a 75%, lavadas com PBS, e coradas com iodeto de propídio. A citometria de fluxo foi então realizada para analisar as amostras tanto de estatuto de apoptose e o ciclo celular, tal como descrito anteriormente [35].

Análise Western Blot

Após tratamento das células com o vapor destilada extractos de gengibre , as células cancerosas foram lavadas com fosfato de gelo frio tamponado salino (PBS) e lisadas com tampão RIPA (Pierce, Rockford, IL) contendo um cocktail inibidor de protease (Thermo Scientific, Rockford, IL). A quantidade total de proteínas no lisado foi determinada usando o ensaio BCA (Pierce). Os lisados ​​celulares foram carregadas a 25 ug /poço num gel de poliacrilamida a resolução de 7,5 ou 12% e separados por electroforese, após o que, as proteínas foram transferidas para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas com leite a 5% em solução salina tamponada com Tris e sondados com os anticorpos primários apropriados. Peroxidase de rábano conjugada e anticorpos secundários SuperSignal Oeste Dura prolongado Substrato Duração (Thermo Scientific, Rockford, IL) foram usadas para a detecção das proteínas sobre as manchas. Os filmes foram digitalizados utilizando FLUORCHEM 890 e programa Image J foi utilizada para quantificar as intensidades das bandas.

Membrana Mitocondrial Potencial Ensaio

As células de cancro do endométrio foram cultivadas em frascos de cultura de tecidos T25. Exponencialmente as células em crescimento foram tratados com 0,025 ug /mL ou 0,25 ug /ml de extracto de gengibre, durante 24 horas. As células foram então lavadas e colhidas. 1 × 10

6 células foram adicionadas a cada tubo de fluxo não tratado, 0,025 ug /ml e /ml de extracto de gengibre células tratadas 0,25 ug. As células foram tratadas com 40 nM de DiOC6 a 37 ° C durante 30 min. As células foram então lavadas, ressuspensas em 400 ul de PBS contendo FBS a 2% e analisadas por citómetro de fluxo FACSCalibur para avaliar a membrana mitocondrial potential.The dados foram analisados ​​utilizando o software FlowJo.

H3>

as células de Ishikawa na fase logarítmica de crescimento foram recolhidas utilizando tripsina. As células (1,2 x 10

7) foram lavadas três vezes e suspensas em 1 ml de albumina de soro bovino 0,5% (BSA) contendo solução salina tamponada com Hanks que não contêm quaisquer catiões divalentes. As células foram carregadas com Indo-1 AM (2 | iM) na presença de 4 mM de probenecid durante 30 minutos a 37 ° C em 5% de CO

2 ambiente. As células foram então lavadas e ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco contendo 0,5% de BSA e 1 mM de CaCl

2 a uma concentração final de 2 × 10

6 células /ml. As células foram filtrados através de um filtro de membrana de 35 micron antes da citometria de fluxo em LSR-II citómetro. As células foram inicialmente analisados ​​durante 3 min para determinar a concentração de cálcio intracelular da linha de base. SDGE (0,025, 0,25, ou 2,5 ug /ml) ou ionomicina (1 | iM utilizado como um controlo positivo) foram subsequentemente adicionados às células e a alteração no Indo-1 a fluorescência foi determinada através de fluxo contínuo continuamente as células por meio de citometria de fluxo para aproximadamente 7 minutos. Os dados obtidos foram analisados ​​usando o software FlowJo.

Análise Estatística

A análise estatística foi feita usando o software GraphPad Prizm. O limite de significância estatística é uma probabilidade de 0,05. Os dados foram analisados ​​por meio de teste t não emparelhado.

Resultados

Isolamento de vapor destilada Extractos de gengibre raízes

Os óleos essenciais podem ser convenientemente isolado a partir de raízes de gengibre por destilação a vapor em um aparelho de Clevenger modificado. Temos sido capazes de isolar a cerca de 300 mg de óleos essenciais a partir de 250 g de raiz de gengibre obtidos a partir de fornecedores comerciais locais. Um total de cinco lotes de rizomas de gengibre, sendo cada uma obtida a partir de uma fonte comercial, foram utilizadas para isolar os óleos essenciais por destilação a vapor. Dois destes cinco lotes de gengibre foram obtidos de fornecedores locais em Bhubaneshwar, Índia e destilação a vapor também foi realizado no local. Os restantes três lotes de gengibre foram obtidos a partir de vendedores no Wisconsin e destilação de vapor de gengibre foi levada a cabo na laboratorial da Universidade de Wisconsin. O rendimento do óleo essencial foi comparável entre todos os lotes de raízes de gengibre usados ​​neste estudo e a densidade de SDGE foi determinada como sendo de aproximadamente 0,87 g /L.

destilado a vapor extrato de gengibre é um potente inibidor de cancro do endométrio proliferação de células

os óleos essenciais de gengibre foram testados quanto ao seu efeito sobre a proliferação de duas cancro do endométrio (ECC-1 e Ishikawa) linhas celulares. Ambas as linhas celulares de cancro do endométrio eram sensíveis a SDGE a uma concentração tão baixa quanto 250 ng /ml (Figura 1A e B.), A proliferação de células foi inibida significativamente (P 0,05) a 2,5 ug /ml de concentração. Os dados de proliferação celular para ambas as linhas celulares mostradas na FIG. 1A e B representam os dados cumulativos obtidos a partir de experimentos realizados com SDGE isolado a partir de três diferentes lotes de rizomas de gengibre. Dezesseis repetições foram feitas para cada condição testada para cada lote de SDGE. Portanto, cada ponto de dados na Fig. 1 é uma média de 48 leituras separadas e mostra apenas pequenas variações nas medições, demonstrando claramente os efeitos altamente reprodutível dos lotes SDGE sobre a proliferação de células ECC-1 e de Ishikawa. A análise dos dados do ensaio de proliferação demonstrado que, no ponto de tempo de 72 h, o IC

50 de SDGE para ambas as linhas celulares foi de aproximadamente 1,25 ug /ml.

Efeito do SDGE na proliferação de células foi determinada pela realização de ensaios MTT. As células Ishikawa (A), e ACE-1 (B) foram incubadas com as concentrações de SDGE representadas por 24, 48, e 72 h. A densidade óptica a 570 nm foi determinada para quantificar o número de células vivas nas culturas. Controlo (Con) de poços em todas as experiências foram tratadas com DMSO, o controlo do veículo. dados cumulativos para SDGE isolado a partir de três diferentes lotes de rizomas de gengibre é mostrado. Cada ponto de dados em todas as figuras é média de 48 leituras individuais. O efeito anti-proliferativo produzido por SDGE (2,5 ug /ml) em Ishikawa (C e E) e ACE-1 (D e F) de células foi comparável ao tratamento destas duas linhas de células com radiação (C e D) ou cisplatina (E e F). As células foram tratadas simultaneamente com SDGE e radiação (4 Gy) ou cisplatina (5 uM). ensaios MTT foram conduzidos para determinar o efeito destes tratamentos sobre a proliferação do Ishikawa e linhas celulares ECC-1. Cada barra em C-F representa uma média de oito repetições. * P 0,001,

# p 0,05 e

† p . 0.05 (não significativa)

tratamento combinado com SDGE e Radiação ou Cisplatina Produz avançado efeito anti-proliferativo

cancro do endométrio avançado é tratado usando radiação e quimioterapia. Por conseguinte, investigado se o tratamento combinado das células de cancro do endométrio com SDGE radiação e ou cisplatina produziram um efeito anti-proliferativo em células reforçada ECC-1 e de Ishikawa. Os resultados do ensaio de MTT mostraram que o tratamento SDGE diminuiu a proliferação das duas linhas de células por 40% e esta diminuição na proliferação, em células ECC-1, foi comparável à observada em células que foram tratadas com radiação sozinha (Fig. 1C e D). No caso de células de Ishikawa, a inibição da proliferação produzido por SDGE foi aproximadamente 10% mais elevada do que a observada com a radiação por si só (Fig. 1C). Finalmente, no caso de ambas as células ECC-1 e Ishikawa, o tratamento combinado com radiação e SDGE reforçada efeito inibitório sobre a proliferação por 23-25%, em comparação com as células que foram tratados apenas com radiação (Fig. 1C e D) .

em seguida, também testou o efeito combinado de SDGE e cisplatina em Ishikawa e as células dos ECC-1. ensaios MTT conduzido após 72 h de tratamento demonstraram que o tratamento combinado com SDGE e cisplatina diminuiu a proliferação das células de Ishikawa por um adicional de 26%, em comparação com a cisplatina apenas o tratamento (Fig. 1E). Em contraste, não foi observada melhoria adicional na inibição da proliferação de células, quando os ECC-1 foram tratados com uma combinação de cisplatina e SDGE (Fig. 1F).

Estas experiências também permitiu-nos a realizar um parente comparação dos efeitos citotóxicos de SDGE com os da cisplatina. Quando utilizada como um agente único, a cisplatina (5 | iM; 1,5 ug /ml) reduziu a proliferação de células de Ishikawa e ECC-1 em 59% e 61%, respectivamente, em comparação com o controlo (Fig 1E e F.). Quando SDGE (2,5 ug /ml) foi utilizado como um agente único, a inibição da proliferação de células de Ishikawa e ECC-1 foi de 37% e 42%, respectivamente, em comparação com os controlos (Fig. 1E e F). Estes resultados sugerem que semelhante à cisplatina, SDGE também foi muito potente na inibição da proliferação de células de câncer endometrial, proporcionando uma forte justificação para um estudo mais aprofundado do mecanismo pelo qual este extrato botânico estava produzindo seus efeitos anti-câncer.

A inibição da endometrial proliferação de células cancerosas por apoptose

os ensaios MTT indicaram que o SDGE era um inibidor potente da proliferação das linhas celulares de cancro do endométrio. A proliferação diminuída das linhas celulares de cancro do endométrio foi um resultado directo da apoptose induzida nas células após o tratamento SDGE. SDGE em concentrações tão baixas quanto 250 ng /mL causaram um aumento na superfície de ligação de FITC-anexina V e iodeto de propídio coloração tal como determinado por citometria de fluxo (Fig. 2A). Aumento de células positivas para FITC-anexina V foi observado tão cedo como 30 min após SDGE foi adicionado às culturas de células (Fig. 2a). A análise Western blot confirmou a expressão aumentada de caspase 3 em ECC-1 (dados não mostrados) e as células de Ishikawa que foram tratados durante 24, 48, e 72 h, com 250 ml de concentração /ng de SDGE (Fig. 2B). Em seguida nós testamos se SDGE foi também induzir parada do ciclo celular em células de câncer de endométrio. As células Ishikawa foram, por conseguinte, tratadas com 250 ng /ml ou 2,5 ug /ml de SDGE para 24, 48, e 72 h. As células foram marcadas com iodeto de propídio e o estado do ciclo celular foi monitorizada por citometria de fluxo (Fig. 2C). Esta análise indicou que SDGE não induziu qualquer efeito significativo sobre o estado do ciclo celular das células. Apenas diminuição marginal foi observada na percentagem de células na fase S do ciclo celular. No entanto, observou-se esta diminuição apenas quando as células de Ishikawa foram tratados com 2.5 ug /ml. O tratamento das células com 250 ng /ml não induziu qualquer alteração no estado do ciclo celular, embora esta concentração de SDGE induziu apoptose nas células cancerosas.

Células

Ishikawa foram tratados com 250 ng /ml de SDGE para 30 min, 2 h, 4 h, e 16 h. Após incubação com SDGE, a sobrevivência celular foi determinada por marcação das células com FITC-conjugado de FITC-anexina V e iodeto de propídio (A). As células foram analisadas por citometria de fluxo e a morte celular e apoptose foram identificados como os eventos que foram único positivo para FITC-anexina V (quadrante inferior direito) ou duplo positivo tanto para FITC-anexina V e iodeto de proidium (quadrante superior direito). morte celular por apoptose induzida por SDGE nas células de cancro do endométrio foi confirmada através da detecção de caspase 3 em análise Western blot (B). Um aumento da caspase 3 clivada níveis foi observada quando as células Ishikawa foram tratados com SDGE (250 ng /mL) durante 0, 24, 48, e 72 h. Dados em A e B é representativa dos resultados obtidos em três experiências separadas,

Composição Química de SDGE

Os efeitos anti-câncer potentes de SDGE nos levou a investigar os potenciais componentes bioativos de gengibre provável que induzem apoptose em linhas celulares de cancro do endométrio. SDGE isolado a partir de três lotes separados de gengibre raízes foram analisados ​​por GC-MS. O extracto de gengibre foi diluída em pentano e os componentes voláteis foram separados por meio de um não-polar coluna RTX-5MS (Fig. 3). Os picos individuais de eluição a partir da coluna foram analisadas por espectrometria de massa de ionização de electrões. Uma análise dos índices de retenção e espectros de massa permitiram identificar um total de 22 compostos da SDGE (Tabela 1). A percentagem relativa de cada um dos componentes identificados também foi determinada nesta análise. Os dados indicaram que SDGE isolado a partir de diferentes lotes de rizomas de gengibre era comparável nos seus constituintes químicos.

três preparações separadas de SDGE, dois de os EUA (denominado Wisconsin 1 e 2) e um da índia foram separados numa não polar coluna de cromatografia em fase gasosa. Os compostos separam nesta coluna foram identificados por espectrometria de massa. Os compostos identificados por meio desta análise, juntamente com as suas abundâncias relativas são apresentados na Tabela 1.

A análise por GC-MS também levou-nos a concluir que SDGE não contém quantidades significativas de os compostos fenólicos, gingerol, shogaol, e Paradol que foram anteriormente identificados como os agentes anti-cancerosas presentes no pó de gengibre e os extractos de solventes de rizomas de gengibre [20], [24], [25], [36]. Esta informação é suportada pela nossa observação de que a 6-gingerol não inibe a proliferação de células de Ishikawa e ECC-1, mesmo quando testado a concentrações tão elevadas como 150 uM (Fig. 4A e B).

ensaios MTT foram conduzido para determinar o efeito de 6-gingerol (a e B) e de citral (C e D) sobre a proliferação de células de Ishikawa e ECC-1. Cada ponto de dados representa uma média de 16 medidas individuais. Com base nestes dados o IC

50 do citral foi calculada como sendo de 15-25 uM.

Terpenóides foram os principais componentes de SDGE identificados na análise por GC-MS. Neral e geranial são isômeros que são referidos coletivamente como citral. Estes dois compostos constituídos, aproximadamente 35-45% dos componentes químicos totais identificados na nossa análise (Tabela 1). Nos

in vitro

ensaios observou-se que o tratamento com citral resultou em uma diminuição significativa na proliferação de Ishikawa e células ECC-1. A IC

50 para citral para ambas as linhas celulares foi entre 15-25 uM (Fig. 4C e D). Este IC

50 concentração de citral corresponde a 2,28-3,8 ug /ml. Em comparação, o SDGE foi eficaz a um IC

50 de 1,25 ug /ml. Uma vez que apenas 35-45% da SDGE é composta por mais neral geranial, o IC

50 concentração de SDGE corresponde apenas a uma concentração de 2,8-3,7 uM de citral. Este nível de citral é significativamente menor do que o IC

50 concentração calculada para o agente nos ensaios de proliferação in vitro (Fig. 4C, D). Portanto, concluiu-se que, além de citral, existem outros componentes bioactivos que contribuem de forma significativa para os efeitos anti-cancro de SDGE. Por isso, realizamos os estudos sobre os mecanismos listados abaixo usando SDGE vez de citral como o agente bioativo.

SDGE Induz Fluxo de Cálcio e prejudica Membrana Mitocondrial Potencial

O tratamento de células Ishkawa com SDGE resultou em uma significativa influxo do cálcio intracelular (Fig. 5A). O aumento no cálcio intracelular foi observado a cerca de 3 minutos após a adição de SDGE. A cinética de tempo e o perfil global do fluxo de cálcio foram semelhantes às observadas em células tratadas com ionomicina. A amplitude da resposta de fluxo de cálcio era dependente da concentração de SDGE. Na maior concentração de SDGE testados, o fluxo máximo observado de cálcio foi aproximadamente de 60-70% da resposta observada com ionomicina (1? M). Ionomicina induzida por um aumento repentino dos níveis de cálcio intracelular, que depois diminuiu dentro de um minuto, mas para todas as concentrações testadas de SDGE o aumento e diminuição subsequente do cálcio intracelular foi relativamente lenta (Fig. 5A). o fluxo de cálcio diminuiu de 5-6 minutos após a adição de SDGE mas não atingiram níveis de pré-tratamento (Fig. 5A).

Efeito do SDGE no fluxo de cálcio intracelular foi determinado por tratamento de Indo-1 carregado células de Ishikawa (A) . Imediatamente após a adição de SDGE para as suspensões de células, as células de Ishikawa foram fluiu através do citómetro e aumento da fluorescência foi medida para detectar o fluxo de cálcio. Diminuição do potencial de membrana mitocondrial foi detectada através do carregamento de células de Ishikawa com DiOC6 (B). SDGE ou veículo de controlo foi adicionado às células. Após 24 h de tratamento, as células foram colhidas e incubadas com DiOC6 durante 15 min. A fluorescência foi medida para determinar mudanças no potencial da membrana mitocondrial.

O aumento do cálcio e indução de apoptose na SDGE tratada ECC-1 e células Ishikawa sugeriu um déficit na função mitocondrial. A medição do potencial de membrana mitocondrial indicaram uma diminuição de 2 vezes em células de Ishikawa que foram tratados durante 24 h com 25 ng /mL ou 250 ng /ml de SDGE (Fig. 5B).

Resultados SDGE tratamento em um aumento da Bax /Bcl-2 Rácio

Bcl-2 é uma proteína anti-apoptótica que se associa com a membrana mitocondrial. Diminui no potencial de membrana mitocondrial levou-nos a determinar o efeito de SDGE (250 ng /ml) em Bcl-2 de expressão. Em ambos os ECC-1 (dados não mostrados) e as células de Ishikawa (Fig. 6), diminuição da expressão de Bcl-2 foi observada após 24, 48, e 72 h de tratamento com SDGE.