Abstract

Fundo

Os microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA não-codificantes, de 20 a 22 nucleótidos que regulam a expressão do gene através da ligação a sua região 3 ‘não traduzida (3’UTR). Aumentar implicada dados alterados participação miRNA no progresso do câncer. Nós relatado anteriormente que CYP2J2 epoxigenase promove fenótipos cancerosas humanas. Mas se e como CYP2J2 é regulada por miRNA não é compreendido.

Métodos e Resultados

Usando a análise bioinformática, encontramos sítios alvo potencial para miRNA let-7b na 3’UTR de CYP2J2 humano. Luciferase e Western blot revelou que CYP2J2 foi regulamentada através de let-7b. Em adição, deixou-7b diminuição da actividade enzimática endógena de CYP2J2. Além disso, deixar-7b pode diminuir a proliferação celular e promovem a apoptose de células de células tumorais através da repressão pós-transcricional CYP2J2. xenoenxertos de tumores foram induzidos em ratinhos nus, por injecção subcutânea de células MDA-MB-435. O vector de expressão let-7b, pSilencer-let-7b, foi injectado através da veia da cauda a cada 3 semanas. Deixe-7b inibiu significativamente o fenótipo tumoral, visando CYP2J2. Além disso, quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase e western blotting foram utilizadas para determinar os níveis de expressão let-7b e

CYP2J2

proteína a partir de cancro de células escamosas do pulmão 18 combinados e tecidos pulmonares normais adjacentes; o nível de expressão foi CYP2J2 inversamente proporcional à da let-7b.

Conclusões

Os nossos resultados demonstraram que a diminuição da expressão de let-7b poderia levar à expressão elevada de proteína na CYP2J2 canceroso tecidos. Estes achados sugerem que miRNA let-7b reduz a expressão CYP2J2, o que pode contribuir para que inibem fenótipos tumorais

Citation:. Chen F, Chen C, Yang S, Gong W, Wang Y, Cianflone ​​K, et al. (2012) Deixe-7b Inibe Cancer Fenótipo Humana pela segmentação do citocromo P450 epoxigenase 2J2. PLoS ONE 7 (6): e39197. doi: 10.1371 /journal.pone.0039197

editor: Gangjian Qin, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de dezembro de 2011; Aceito: 16 de maio de 2012; Publicação: 25 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção do Programa Pesquisa Nacional de base = “973 =” (No. 2012CB517801) e NSFC (No. 30930039 e 81070236). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

citocromo P450 humano (CYP) epoxigenase, CYP2J2, catalisa a epoxidação de ácido araquidônico em quatro regioisómeros de cis-epoxyeicosatrienoic ácido (5,6-EET; 8,9-EET; 11,12-EET; e 14,15-IIT) [1]. Esta enzima parece ser expressa principalmente em células endoteliais cardíacas e dos vasos [2], e também tem sido encontrados numa variedade de tecidos incluindo o fígado, pulmão, rim, e nos tecidos gastrointestinais [3]. Como as diferenças na eficiência catalítica de isoformas de P450 individuais resulta em diferentes perfis para cada EET [4], 11,12- e 14,15-EETs são os metabolitos de ácido araquidónico, produzidos principalmente em várias células e tecidos [5], [6] .

Vários estudos têm relatado que EETs têm diversos efeitos biológicos dentro do sistema cardiovascular. Os EETs libertadas do endotélio activado canais de potássio sensíveis ao cálcio e resultou na hiperpolarização das células do músculo liso e relaxamento vascular [7]. Além disso, as concentrações fisiológicas de EETs ou sobre-expressão de

CYP2J2

reduzida expressão molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1) e impedida a adesão de leucócitos à parede vascular [8]. Os efeitos inibidores de EETs mostrar que têm efeitos anti-inflamatórios no sistema vascular independente dos seus efeitos hiperpolarizantes de membrana-[8]. Além disso, os EETs também promoveu a proliferação celular endotelial, migração, angiogénese e tanto através da activação da proteína quinase activada por mitogénio (MAPK) e fosfatidilinositol-3 (PI3) -kinase /Akt vias [9].

Por outro lado, outras evidências indicam que epoxigenase superexpressão ou tratamento EETs ter efeitos potencialmente nocivos. Em publicações recentes, EETs CYP2J2 derivados foram encontrados para desempenhar papéis importantes numa série de processos relacionados com o comportamento de células de cancro e patogénese do tumor. Encontrámos alta expressão de CYP2J2 em tumores humanos, bem como em oito linhas celulares de carcinoma derivadas de humanos, mas não em tecidos normais adjacentes e as linhas de células humanas nontumoral [10]. A sobre-expressão de CYP2J2 ou adição de EETs exógenos marcadamente acelerada proliferação e a metástase de células de cancro in vitro e in vivo [10], [11]. CYP2J2 sobreexpressão ou adição de EETs exógeno protegido células de carcinoma humano da apoptose por proteínas anti-apoptóticas upregulating os, Bcl-2 e Bcl-xL, e pela regulação negativa da proteína pró-apoptótica, Bax [10]. Em contraste, os inibidores selectivos de CYP2J2 tinha efeitos antitumorais significativos in vitro e in vivo e foram associadas com a biossíntese reduzida EET [12]. Coletivamente, todos os resultados demonstraram os papéis importantes e previamente não reconhecidos de CYP2J2 e seus produtos EET na carcinogénese.

evidências crescentes indicam que miRNAs desempenham papéis importantes em diversos processos biológicos, como a proliferação, diferenciação e apoptose durante o desenvolvimento [13], [14], [15]. Vários estudos têm, de facto descrita a expressão aberrante em tumores humanos e de miARNs sua função de controlar a expressão de certos oncogenes e genes supressores de tumor [16], [17], [18]. Por exemplo, miR-15a e miR-16 são frequentemente excluídas ou reprimidos em carcinomas de células escamosas e adenocarcinomas do pulmão [19]. MicroRNA-101 é regulada negativamente na bexiga carcinoma de células transicionais (TCC) tecidos e inibe a proliferação celular e a formação de colónias em linhas celulares de CTP reprimindo directamente oncogene EZH2 [20]. Um estudo recente indicou que miARN-let-7a inibe a expressão de myc e reverte o crescimento induzido-MYC em células de linfoma de Burkitt [21]. Relatórios anteriores indicam que deixe-7 é pobremente expressa em uma variedade de tumores humanos e reduzida deixou-7 resultados de nível em sobre-expressão (cyclinD, RAS, MYC) de genes let-7-responsivas em tumores [22], [23] [24], [25]. No entanto, o papel exato de let-7 no câncer ainda não é totalmente compreendido. Nosso show dados preliminares que deixá-7b é regulada em tumores escamosos pulmonares humanas, enquanto os níveis de proteína CYP2J2 é regulado para cima, sugerindo que CYP2J2 humana pode ser pós-transcricionalmente regulada por deixá-7b. Assim, o objetivo do presente estudo foi investigar esta hipótese que let-7b pode agir como um supressor de tumor por meio de segmentação CYP2J2.

Resultados

Deixe-7b Alvos 3’UTR de

CYP2J2

Para investigar se CYP2J2 é regulado diretamente pelo deixá-7b, construímos um plasmídeo repórter luciferase contendo o 3’UTR de CYP2J2 clonado a jusante do gene repórter luciferase (Figura 1A). Nós transfectadas a luciferase construir em células HepG2 juntamente com let-7b ou aleatória let-7b. Verificou-se que a transfecção de PMIR /CYP2J2-3’UTR juntamente com let-7b resultou numa redução significativa na actividade repórter do que aqueles de controlo e transfecções aleatórios. Por outro lado, nenhuma regulação negativa significativa da actividade repórter PMIR poderia ser determinado que quando transfectada o repórter PMIR (vector vazio), juntamente com let-7b ou aleatória let-7b em células HepG2 (Figura 1B). Para confirmar ainda que CYP2J2 é um alvo de deixar-7b, construímos sete mutantes (PMIR /CYP2J2-3? UTR mutante, mutante-1, 2-mutante … e mutante-6, respectivamente), com base em PMIR /CYP2J2-3? UTR. Em seguida, estas construções transfectadas para as células (MDA-MB-435 e SK-MES-1) e analisados ​​actividade repórter da luciferase. Os ensaios mostraram que a atividade luciferase de PMIR /CYP2J2-3? UTR mutante não foi reprimida por deixá-7b, em comparação com o tipo selvagem PMIR /CYP2J2-3? UTR (Figura 1C e D). Entre os seis mutantes restantes mutantes (-1, 2 … mutante-mutante-6), a actividade da luciferase do mutante-3 foi reprimido por deixar-7b, comparando com aleatório e de controlo (

P

0,05) ( Figura 1E). Além disso, local de ligação III combinado completamente a sequência de semente de let-7b se emparelhamento de base oscilação era permitido. Estes dados indicam que CYP2J2 é um dos alvos de let-7b.

A, representação esquemática dos locais-alvo previstos de let-7b na 3’UTR de CYP2J2. A 3’UTR do CYP2J2 foi clonado num plasmídeo repórter de luciferase, denominado PMIR /CYP2J2-3’UTR. Uma série de mutantes realizada nucleotídeos mutantes em seis locais de ligação potenciais para a região da semente da let-7b foram geradas com base no tipo selvagem PMIR /CYP2J2-3’UTR. Mutantes de PMIR /CYP2J2-3’UTR são construídas através da mutação do site complementar (rotulado por sublinhado) na região da semente do let-7b às suas bases complementares. B, a actividade da luciferase foi analisada em células HepG2 24 h após a transfecção com o plasmídeo repórter PMIR /ou CYP2J2-3’UTR PMIR (vector vazio). C-D, full-length CYP2J2-3’UTR sequência contendo locais de ligação mutantes para a região da semente da let-7b foram geradas com base no tipo selvagem PMIR /CYP2J2-3’UTR. Nós transfectadas destas construções nas células (MDA-MB-435 e SK-MES-1) e analisados ​​actividade repórter da luciferase. Como esperávamos, deixe-7b não afetou a atividade da luciferase de mutantes em comparação com o tipo selvagem. E, os seis mutantes foram transfectados em SK-MES-1 células, para além de deixar-7b ou aleatória let-7b. A actividade da luciferase dos seis mutantes não foi reprimido através de let-7b. as actividades da luciferase Renilla foram usadas para normalizar a actividade da luciferase do pirilampo. Colunas, com média de três experiências; Barras, DP. *,

P

. 0,05

Deixe-7b Inibe os níveis de expressão de Endógeno CYP2J2 e sua atividade enzimática in vitro

Para investigar os efeitos da let exógena -7b sobre o nível de proteína e actividade enzimática das proteínas CYP2J2 endógenos, foram examinados os níveis de proteína de CYP2J2 em HeLa, TCA-8113, SK-MES-1 e MDA-MB-435 de células após o tratamento com let-7b durante 48 h (100 nM). A análise Western blot mostrou que a sobre-expressão de let-7b downregulated significativamente a expressão de CYP2J2 em quatro linhas celulares de cancro (Figura 2A). CYP2J2 expressão relativa foi quantificada por densitometria (Figura 2B). Como na Figura S1A e B, transferências de Western mostraram efeito dose-dependente do inibidor let-7b e deixou-7b na expressão da proteína CYP2J2. Dada a instabilidade de EETs, determinou-se a concentração do metabolito estável 14,15-DHET em meios de cultura de células para confirmar a inibição da let-7b sobre a actividade enzimática de CYP2J2. Os resultados mostraram que os níveis de 14,15-DHET foram significativamente diminuída pela transfecção de deixar-7b (Figura 2C). Estes dados mostram que CYP2J2 humana está diretamente reprimidos por deixá-7b.

A, nível de proteína de CYP2J2. HeLa, TCA-8113, MDA-MB-435 e SK-MES-1 foram tratados com let-7b ou deixe-7b aleatório (100 nM) durante 48 h. O nível de proteína de CYP2J2 foi examinada por análise de Western blot. B, nível de proteína de CYP2J2 foi quantificada por densitometria. Colunas, com média de três experiências; Barras, DP. *,

P Art 0,05. C, metabolito estável de 14, 15-DHET em HeLa, TCA-8113, e MDA-MB-435 foram determinados tal como descrito em Materiais e Métodos. As células tratadas com exógeno HSA-let-7b produziu menos EETs do que aqueles tratados com aleatório let-7b. Pontos, com média de três experiências; Barras, DP. *,

P

. 0,05

Deixe-7b reduz o crescimento de células cancerosas e induz a apoptose por Diretamente downregulating CYP2J2

Temos relatado anteriormente que CYP2J2 estimula a proliferação de células de carcinoma e protege as células de carcinoma humano da apoptose [10]; por isso foi de interesse para avaliar os efeitos da sobre-expressão de let-7b sobre a proliferação celular e apoptose, quando CYP2J2 endógena foi inibida por deixar-7b. Foram tratados HeLa, TCA-8113, SK-MES-1, e células MDA-MB-435 com exógeno let-7b ou aleatória let-7b durante 48 h. A taxa de proliferação foi determinada via celular-Light ™ DNA EDU Kit de Proliferação Celular (Ribobio, China). Os resultados mostraram uma inibição significativa da proliferação celular através de let-7b. Por exemplo, em células MDA-MB-435 e SK-MES-1, células let-7b reduziu a proliferação celular em 50% em comparação com controlo negativo e aleatório let-7b (Figura 3A). A apoptose, medido por coloração com Anexina V e iodeto de propídio, aumentou significativamente em células transfectadas com let-7b (Figura 3B). Em adição, deixou-7b exógeno diminuiu a percentagem de células EDU-positivos e aumentou as células apoptóticas e em células HeLa TCA-8113 (Figura 3C e D). Para fornecer evidência adicional de que os efeitos da expressão let-7b sobre a proliferação celular e apoptose foram relacionadas com CYP2J2, as células transfectadas com let-7b foram tratados com C26 (10 uM) (inibidor específico CYP2J2 [12]) e 14,15-EET (250 nM) durante 48 h. Para minimizar a redução nos níveis de 14,15-IIT devido a auto-oxidação, as células foram estimuladas com 14,15-IIT ou um volume equivalente de veículo (DMSO) a cada 6 h. Como esperado, os efeitos de deixar-7b expressão sobre a proliferação celular e apoptose foram reforçados por C26 e abolida por 14,15-IIT (Figura 3E e F). Além disso, para determinar se deixe-7b tratamento afetam o crescimento de células de H9c2 (células H9c2 não têm

CYP2J2

), utilizou-celular-Light DNA EDU ™ Kit de Proliferação Celular e anexina V e iodeto de propídio coloração para medir a proliferação celular e a apoptose de células H9c2. Como mostrado na Figura S2A e B, não só a proliferação celular mas também a célula apoptose de células H9c2 não foram afectados pelo tratamento com inibidor da let-7b ou deixe-7b. Estes dados sugerem que a sobre-expressão de let-7b resultou na proliferação diminuída e ativado apoptose de linhas de células de carcinoma.

A, ensaio de proliferação celular via-Light ™ DNA EdU Proliferação Celular Kit mostrando diminuição da taxa de proliferação de células MDA-MB- 435 e SK-MES-1 as células tratadas com let-7b, em comparação com as células tratadas com aleatório let-7b ou controlo. As células coradas de azul foram coradas por Hoechst, eo vermelho foram EdU complemento nas células. células EDU-positivos foram calculados como (UDE add-in células /células Hoechst-coradas) × 100%. Colunas, com média de três experiências; Barras, DP. *,

P Art 0,05. B, a percentagem de células apoptóticas foi aumentada em células MDA-MB-435 e SK-MES-1 As células tratadas com let-7b. Apoptose medida por anexina V-FITC (eixo x) e coloração com iodeto de propídio (eixo y). As percentagens de células apoptóticas (percentagem de células no quadrante superior direito (anexina V-positiva, PI-negativo), mais as células no quadrante de baixo direita (anexina V-positiva, PI-positivas) no número total de células) são dados sob o gráfico relevante. Colunas, com média de três experiências; Barras, DP. *,

P Art 0,05. C-D, percentagens de células e células em apoptose EDU-positivo foram analisados ​​em células HeLa e TCA-8113 transfectadas com let-7b ou aleatório deixá-7b. E-F, MDA-MB-435 e SK-MES-1 transfectadas com let-7b foram tratados com C26 (inibidor específico CYP2J2, 10 uM) ou 14,15-IIT (250 nM). 48 h mais tarde, foram analisadas as percentagens de células apoptóticas e células EDU-positiva. Colunas, com média de três experiências; Barras, DP. *,

P Art 0,05. L, deixou-7b superexpressão expressão influenciado de genes relacionados com tumores em células MDA-MB-35. Deixe-7b sobreexpressão em células MDA-MB-435 downregulated significativamente PI3K, pAkt, e pERK mas aumentou e Bax nm-23 de expressão. Os dados mostrados foram repetidas três vezes.

também investigada a influência de deixar-7b sobre a expressão da proteína Bax e pró-apoptótica nm-23 proteína antimetastática e a activação da sinalização de PI3K /Akt e MAPK vias, que desempenham papéis importantes em P450 epoxygenase- e tumorigênese EET-mediada e metástase [10], [11], [12]. Verificou-se que a sobre-expressão let-7b em células MDA-MB-435 a PI3K regulada negativamente de forma significativa, de pAkt, vias pERK mas aumentou e Bax nm-23 expressão (Figura 3G). Resultados semelhantes foram também observados em células MDA-MB-435 tratadas com que deixe-7b agomir (Figura S1C e D). No entanto, deixe-7b não afetou PI3K, pAkt e Bax de células H9c2 (Figura S2C). Especulamos que este é porque as células H9c2 não têm

CYP2J2

. Estes resultados indicaram que o efeito de aumento da CYP2J2 na formação do tumor pode ser atenuada por deixá-7b.

Expression Nível de CYP2J2 proteína e deixe-7b no cancro do pulmão humano e em tecidos normais adjacentes são inversamente correlacionados

Para investigar a associação entre o nível de let-7b ea expressão de CYP2J2 em carcinomas humanos, a expressão da proteína CYP2J2 e deixe-7b em 18 emparelhado pulmão tecidos de câncer escamoso humano e tecidos não tumorais adjacentes foi examinado por análise de western blot e real -tempo de RT-PCR, respectivamente. Os resultados mostraram que CYP2J2 foi altamente expressa na maioria das amostras de tecido de cancro em comparação com os tecidos normais adjacentes (Figura 4A). Real-time RT-PCR foi utilizado para determinar os níveis de let-7b maduros em 18 pares de pulmão humano tecidos de câncer escamoso e tecidos não tumorais adjacentes. Embora as mudanças de valores -ΔΔCT [- (ΔCT

não-tecido tumoral-ΔCT

tecido canceroso)] foram relativamente leves (de -1,85 para 5,4, 2,6 ± 1,27), a mudança vezes (2

– ΔΔCT) de expressão let-7b entre 18 emparelhado pulmão humano tecidos de câncer escamoso e tecidos não tumorais adjacentes foi significativa (,277-42,22, 6,06 ± 2,43). Consequentemente, os resultados mostraram que os níveis de maturidade let-7b foram significativamente menores em 14 tumores de pulmão em comparação com os seus controles pareados entre 18 amostras analisadas (Figura 4B). Nós próxima investigada a correlação entre o nível de expressão let-7b e nível de proteína CYP2J2 no pulmão humano tecidos de câncer escamosas. E lá é estatisticamente significativa correlação inversa entre nível de expressão let-7b e nível de proteína CYP2J2 em 18 conjuntos de cancro do pulmão tumores escamosos e tecidos não tumorais adjacentes emparelhados (Figura 4C). Além disso, descobrimos que CYP2J2 tinha níveis de expressão inversas para let-7b em quatro tecidos emparelhados de cancro da mama humano e não tumorais adjacentes (Figura 4D e E). E-7b permitem a expressão em SK-MES-1 e células MDA-MB-435 foi mostrado na Figura S3.

a, os níveis de expressão de CYP2J2 no pulmão canceroso (C) e tecidos não tumorais adjacentes (N) foi medido por análise de Western blot. B, a comparação entre os níveis de deixá-7b Expressão em tecidos não tumorais de pulmão canceroso e adjacente (n = 18). Embora as mudanças de valores -ΔΔCT [- (ΔCT

não-tecido tumoral-ΔCT

tecido canceroso)] são relativamente leves (de -1,85 para 5,4, 2,6 ± 1,27), as mudanças vezes de expressão let-7b entre 18 pulmão humano escamosas câncer e não tumorais adjacentes tecidos emparelhados são significativas (0,277-42,22, 6,06 ± 2,43). C, a relação entre a proteína CYP2J2 e deixe-7b expressão no câncer de pulmão e emparelhados tecidos não tumorais adjacentes. O nível de expressão da proteína CYP2J2 foi aumentada em 13 dos 18 conjuntos de cancro do pulmão em comparação com os tecidos normais adjacentes (A modificação vezes 1). Como esperado, os níveis de deixar-7B foram geralmente reduzida nestes tumores, em comparação com os tecidos normais adjacentes (A modificação dobra 1). D-E, os níveis de expressão de CYP2J2 e deixá-7b em tecidos da mama canceroso e adjacentes não tumorais (n = 4). Em tempo real de RT-PCR foi utilizado para determinar os níveis de let-7b maduros. O nível de expressão U6 snRNA foi utilizado para normalizar o nível de let-7b relativa. Colunas, com média de três experiências; Barras, DP. *,

P

. 0,05

Deixe-mediada-7b Knockdown de CYP2J2 inibe o crescimento de tumores e metástases

Além disso, investigamos a influência de let- 7b no crescimento do tumor num modelo in vivo. Para gerar um modelo de xenoenxerto do tumor, 2 × 10

6 células MDA-MB-435 foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus. Duas semanas após a injecção, quando os tumores tinham crescido a aproximadamente 40 mm

3, o deixar-7b vector de expressão pSilencer-let-7b foi injectada em ratinhos a uma dose de 4 mg /kg de peso corporal por meio da veia da cauda a cada 3 semanas. Como esperado, os ratinhos injectados com pSilencer-let-7b via veia da cauda demonstraram uma redução significativa no volume do tumor em comparação com os controlos (Figura 5A). Durante o período de tratamento, foi determinado o nível de 14,15-DHET na urina de ratinhos nus e encontrou uma redução significativa em 14,15-DHET no grupo de tratamento let-7b, quando comparada com os controlos (Figura 5B). No final do período de tratamento, deixou-7b resultou numa diminuição significativa do peso do tumor, o peso corporal, mas não tinha mudado (Figura 5C). Nós também tratada celular MDA-MB-435 com agomir let-7b (150 nM) ou controlo agomir durante 48 h, e, em seguida, estas células injectadas no flanco direito de ratinhos nus. Após 4 semanas, foram necropsiados, e todos os tumores por ratinho foram pesados. Deixe-7b agomir resultou numa diminuição significativamente o peso do tumor (Figura S4). Além disso, o nível de madura let-7b foi validado por em tempo real de RT-PCR; os resultados mostraram que o tratamento pSilencer-let-7b resultou num aumento significativo em ambos os tumores e órgãos (Figura 5D e E). A análise Western blot mostrou uma acentuada diminuição do nível de expressão da proteína CYP2J2 e um aumento significativo do nível de proteína pró-apoptótica Bax expressão e nm-23 proteína antimetastática nos camundongos permitem-tratados-7b em comparação com os controles (Figura 5F). Estes resultados sugerem que deixe-7b pode inibir a expressão e funções de promoção de tumores de CYP2J2.

células MDA-MB-435 foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus para gerar o modelo de ratinho de cancro da mama. Duas semanas mais tarde, os ratinhos receberam o tratamento let-7b aleatoriamente. O vector de expressão let-7b (plasmídeo pSilencer-let-7b) foi injectada em ratinhos através de uma veia da cauda a uma dose de 4 mg /kg de peso corporal a cada 3 semanas. A, os x-axis foi rotulado como os dias de tratamento pSilencer-let-7b. O volume do tumor foi medido semanalmente e calculado como TV (mm

3) = comprimento x largura

2 × 0,5236. B, a medição do nível de 14,15-DHET em ratinhos nu urina foi realizada por ELISA, de acordo com as instruções do fabricante. Pontos, com média de três experiências; Barras, DP. *,

P Art 0,05. C, peso médio do tumor e peso corporal de controle e tratamento de let-7b grupos após o crescimento durante 8 semanas. Colunas, quer dizer; Barras, DP. *,

P Art 0,05 versus controlo. D-E, a expressão do let-7b madura nos tumores primários e órgãos foi validado por em tempo real de RT-PCR. Colunas, com média de três experiências; Barras, DP. *,

P Art 0,05. F, a análise Western blot mostrou alteração do nível de proteína CYP2J2 e genes relacionados ao tumor de amostras de tumores de expressão.

Além disso, avaliou-se a sobre-expressão de let-7b afetados metástase. No final da experiência, os baços foram removidos e incisão vertical na contagem das colónias tumorais metastáticas. Metástases em corte longitudinal do baço eram visíveis a olho nu como nódulos. Observou-se uma diminuição significativa no número médio de metástases do baço em ratinhos injectados com pSilencer-let-7b em comparação com controlos (Figura 6A). Nós também determinado o grau de linfonodo metástases através da medição do peso dos gânglios linfáticos. Verificou-se que a injecção de pSilencer-let-7b, através da veia da cauda reduziu o peso médio dos nodos linfáticos axilares (Figura 6B). Outras análises histológica depois hematoxilina e eosina de secções de parafina mostrou uma diferença acentuada entre ratinhos atímicos tratada com let-7b e controlos (Figura 6C e D): o tratamento let-7b causou um aumento significativo na incidência de regiões necróticas no tumor e baço. Comparado com o grupo controle, os focis metástases eram menores e menos em secções de baço do grupo de tratamento let-7b. Além disso, a coloração TUNEL de cortes demonstraram que o tratamento let-7b resultou num aumento significativo nas células positivas TÚNEL nos tumores em ratinhos e o baço (Figura 6E e F). Estes dados indicam que o tratamento let-7b pode inibir a metástase de tumores.

A, número médio de metástases do baço para cada grupo (n = 6). Colunas, quer dizer; Barras, DP. *,

P Art 0,05 versus controlo. B, o peso médio de linfonodos axilares para cada grupo. Colunas, quer dizer; Barras, DP. *,

P Art 0,05 versus controlo. C-D, hematoxilina e eosina de secções de tumor (C1, C2) e do baço (D1, D2). E-F, coloração TUNEL de tumor (E1, E2) e baço (F1, F2) seções.

Discussão

No presente estudo, nós mostramos um novo mecanismo para controlando a função de tumor-promoção de CYP2J2. análise bioinformática previu que let-7b é um regulador potencial da

CYP2J2

gene. Usando linhas celulares de cancro CYP2J2-expressão e um modelo xenografs tumorais, temos mostrado que o ser humano

CYP2J2

é posttranscriptionally regulada por deixá-7b e que o regulamento pós-transcricional é responsável pela função de tumor-promoção de CYP2J2. Além disso, no pulmão e cancro epidermóide humano tecidos não tumorais adjacentes, observou-se uma relação inversa entre os níveis de expressão let-7b e CYP2J2.

Tornou-se aparente que microARNs regular a expressão de genes alvo através da ligação a regiões complementares da 3’UTR de seus genes-alvo [26], mas se HSA-let-7b regula a expressão CYP2J2 humana não é conhecido. estudo anterior demonstrou que deixe-7 regula através da sua RAS 3’UTR [27]. No presente estudo, os ensaios de luciferase mostraram que deixe-7b reprimiu a actividade da construção repórter contendo a região 3 ‘UTR do mRNA CYP2J2. Transfecção de linhas celulares de carcinoma com let-7b e injeção de pSilencer-let-7b produzir amadurecer let-7b in vivo diminuiu a expressão da proteína CYP2J2 e atividade enzimática, sugerindo que

CYP2J2

é posttranscriptionally regulada negativamente por deixá-7b.

estudos recentes têm demonstrado que let-7 pode agir como um supressor de tumor e que reduziu deixá-7 resultados nível no gene let-7-responsiva (cyclinD, RAS, MYC, etc.) superexpressão em tumores [22 ], [23], [24], [25]. Com a análise de Western blot e em tempo real de RT-PCR, que mostrou maior expressão de proteína CYP2J2 e menor expressão de let-7b em 18 tecidos de cancro do pulmão humano escamoso emparelhado em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes. Assim, a expressão elevada de proteína CYP2J2 em tecidos de cancro pode resultar da diminuição da expressão de let-7b, pelo menos em parte. Naturalmente, é provável que um outro mecanismo (s) está envolvido na regulação da expressão CYP2J2. O nosso estudo anterior demonstrou que a sobre-expressão de CYP2J2 ou additing EETs exógenos diminuiu a apoptose e aumento da proliferação celular em linhas celulares de cancro e um aumento do crescimento tumoral e metástase pulmonar num modelo de xenoenxerto de murino [10]. Além disso, nós recentemente descobriu que o Composto 26, o inibidor seletivo da CYP2J2, reprimiu significativamente a função tumor-promoção de CYP2J2 [12].

No presente estudo, descrevemos um novo mecanismo de supressão de CYP2J2. Foram tratados linhas celulares de carcinoma com let-7b e descobriram que a sobre-expressão de let-7b resultou na proliferação diminuíram e activados a apoptose das células cancerosas. Também descobriram que o tratamento pSilencer-let-7b crescimento do tumor inibiu significativamente em um modelo de xenotransplante tumoral. Embora a regulação negativa de CYP2J2 por pSilencer-let-7b não resultar na erradicação de tumores, a correlação inversa entre o nível de expressão de CYP2J2 e deixou-7b em tecido de cancro humano e a eficácia de inibir as funções de promoção de tumores de CYP2J2 revelou a benefício potencial terapêutico de let-7b em cancros humanos.

em nosso estudo anterior, informamos que EETs proteger as células endoteliais da apoptose pela ativação do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt e MAPK vias de sinalização [25] . No presente estudo, a sobre-expressão de let-7b suprimiu a expressão de proteínas e os seus produtos CYP2J2 EET in vitro e in vivo. Nós também descobrimos que deixe-7b poderia inibir a proliferação, e aumentar a apoptose, de células tumorais humanas através da inibição da via PI3K /Akt e MAPK vias de sinalização e através da activação da proteína pró-apoptótica Bax e proteína antimetastática nm-23, ambos os quais estão envolvidos em P450 epoxygenase- e tumorigênese EET-mediada e metástase [10]. Os nossos dados sugerem que o efeito de EETs CYP2J2-derivados de formação de tumores foi mediada através de let-7b. Os 11 membros da família let-7 têm genes alvo semelhantes e funções sobre a proliferação celular por causa da alta similaridade entre as suas sequências [23], [28]. No presente estudo, enfocamos o efeito de let-7b na expressão de CYP2J2. Efeitos dos outros membros da let-7 família sobre a expressão CYP2J2 e proliferação de células cancerosas precisam ser melhor estudados.

Em conclusão, nossos dados confirmam que a expressão let-7b é frequentemente diminuída em cancros de células escamosas do pulmão. O nosso trabalho também indicaram que CYP2J2 humano é regulada por posttranscriptionally let-7b, o que resulta na expressão elevada de proteína CYP2J2 nos carcinomas humanos. Nosso estudo demonstrou um novo mecanismo pelo qual tumorigênese CYP2J2- e EET-mediada e metástases estão associadas com let-7b. Além MYC e RAS, deixe-7b pode funcionar como um supressor de tumor, bloqueando CYP2J2.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Tongji Hospital e Tongji Medical College. Os indivíduos recrutados fornecidos consentimento informado por escrito. A investigação está em conformidade com os princípios enunciados na Declaração de Helsinki. Todos os protocolos experimentais animais cumpriram o “Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório”, publicado pelos Estados Unidos National Institutes of Health.

Linhas Celulares

A linha de células de adenocarcinoma colo do útero humano HeLa, a linha de células de hepatoma humano HepG2 do fígado, língua humana de carcinoma de células escamosas TCA-8113, e linha celular de cancro escamoso do pulmão humano SK-MES-1 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). As células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) com soro fetal bovino a 10% (FBS) a 37 ° C na presença de 5% de CO

2 a uma humidade constante. A mama humano linha celular de carcinoma MDA-MB-435 foi também obtido a partir da American Type Culture Collection e foi cultivado em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% e mantida a 37 ° C em 95% ar /5% de CO

2 .

MicroRNA alvo previsão

RNAhybrid (https://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/rnahybrid_submit) foi utilizado para a previsão alvo miRNA. Encontramos quatro locais-alvo potenciais (local I, sítio III, local IV e VI local) em 3’UTR de CYP2J2 humana para deixá-7b. Além disso, nós também comparou a sequência de let-7b à sequência de comprimento total CYP2J2-3’UTR com software DNAMAN (LynnonBiosoft, Quebec, Canadá). Encontramos também mais dois locais potenciais bingding (sítio II e o sítio V), além dos quatro locais-alvo potenciais descrito anteriormente (Figura 1A).

plasmídeo Construção

A sequência de comprimento total CYP2J2 humana -3? UTR foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores 5′-GCGACTAGTGTATCACCATTTCCCCAGTCAGTCA-3 ‘(iniciador CYP2J2-3’UTR-ex) e 5′-GCGAAGCTTCATGGGAATAAGTGTCTGATGGAGG-3’ (iniciador reverso CYP2J2-3’UTR-). Barras, DP. Barras, DP. Barras, DP.