Sumário

Sintético triterpenóide metil-2-ciano-3, 12-dioxooleana-1, 9 (11) -dien-28-oato de metilo (CDDO-Me) tem sido mostrado como um agente promissor contra ovário Câncer. No entanto, o mecanismo subjacente não é bem compreendido. Aqui, demonstramos que o CDDO-Me interage directamente com a Hsp90 em células por ensaio de desvio térmico celular. tratamento CDDO-Me leva a regulação positiva de Hsp70 e degradação dos clientes Hsp90 (ErbB2 e AKT), indicando a inibição da Hsp90 por CDDO-Me nas células. Knockdown da Hsp90 inibe significativamente a proliferação de células e aumenta o efeito anti-proliferação de CDDO-Me em H08910 células de cancro do ovário. Ditiotreitol inibe a interação de CDDO-me com Hsp90 em células e anula o CDDO-Me sobre-regulação induzida por Hsp70, degradação de Akt e inibição da proliferação celular. Isto sugere que o efeito anti-cancro do ovário de CDDO-Me está possivelmente mediada pela formação de aductos de Michael entre o CDDO-Me e nucleófilos reactivos no Hsp90. Este estudo identifica Hsp90 como uma nova proteína alvo de CDDO-Me, e fornece um romance visão sobre o mecanismo de ação do CDDO-Me em células de cancro do ovário

Citation:. Qin DJ, Tang CX, Yang L, Lei H, Wei W, Wang AA, et al. (2015) Hsp90 é uma nova molécula alvo de CDDO-Me na inibição da proliferação de células de cancro do ovário. PLoS ONE 10 (7): e0132337. doi: 10.1371 /journal.pone.0132337

editor: L. Michel Espinoza-Fonseca, da Universidade de Minnesota, Estados Unidos

Recebido: 09 de maio de 2015; Aceito: 12 de junho de 2015; Publicação: 02 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Qin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. (. NÃO 2015CB910403, 2013CB910903) Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa), National Natural Science Foundation da China (91313303, 31100980, 81272886), ciência e Tecnologia Comitê de Shanghai (11JC1406500, 13431900501, 13ZR1456900)

CONFLITO dE iNTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de ovário é um das principais causas de morte por câncer de malignidade ginecológica. Apesar dos grandes avanços na quimioterapia e tratamento cirúrgico, 70 a 90% das mulheres com câncer de ovário vai apresentar uma resposta completa após o tratamento inicial e desenvolver recaída no prazo de 2 anos e a taxa de sobrevida em 5 anos dos pacientes com câncer de ovário avançado mantém-se em cerca de 30% [1]. Nos EUA, estima 22, 000 novos casos de câncer de ovário foram previstos para ser diagnosticado em 2014, resultando em ~ 14, 000 mortes associadas a esta doença [2]. Portanto, para melhorar os resultados para as mulheres com câncer de ovário avançado, esforços significativos foram dedicados para identificar agentes de proteína alvo [3].

proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma proteína chaperone altamente evolutivamente conservada e é o mais bem estudado membro da família de proteínas de choque térmico. Como uma chaperona molecular dependente de ATP, a Hsp90 desempenha um papel crítico na maturação, estabilidade, e a activação de um certo número de proteínas diversa de clientes. Embora abundantemente expressa em células normais, a sua sobre-expressão em células malignas promove a activação persistente de muitas quinases celulares e factores de transcrição dos stresses celulares induzidas com malignidades [4]. Interessantemente, muitos clientes ou interactores de Hsp90, tal como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), receptor do factor de crescimento epidérmico humano 2 (ErbB2), o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) e o transdutor de sinal e activador da transcrição 3 (STAT3), têm sido implicado na patogênese de células do cancro do ovário [5-7] e nível de Hsp90 elevado é comum em efusões peritoneal e pleural de pacientes com células de câncer de ovário em estágio avançado [8]. Hsp90 tem sido considerada como um alvo atractivo para o cancro do ovário [9-10].

éster de metilo em C-28 de 2-ciano-3, 12-dioxoolen-1, o ácido 9-dien-28-óico ( CDDO-Me) é um romance triterpen�de oleanano sintético. CDDO-Me está atualmente em desenvolvimento clínico de fase final para o tratamento da doença renal crónica [11-13] e em fase I /II de ensaios clínicos para doenças malignas [14-15]. CDDO-Me exibe citotoxicidade contra uma variedade de células de cancro incluindo cancro do ovário [16-17], o cancro da próstata [18] leucemia [19], o cancro da mama [20], o cancro do pulmão [21], do cancro do pâncreas [22-23], sem manifestando qualquer toxicidade em células normais. Os estudos mecanísticos revelaram que o CDDO-Me é um composto multitarget. Curiosamente, algumas proteínas afetadas por CDDO-Me tal como ErbB2, Akt, STAT3 e mTOR [17] são clientes da Hsp90. Portanto, nós especulamos que a Hsp90 pode ser um alvo de CDDO-Me, que contribui para as diversas atividades de CDDO-Me.

Neste estudo, foi demonstrado que a Hsp90 é uma nova proteína alvo de CDDO-Me em células de cancro do ovário, o que contribui para o efeito anti-câncer do CDDO-Me em células de câncer de ovário.

Materiais e Métodos

cultura celular

as células de cancro do ovário epiteliais humanas SKOV3 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). linha de células HO8910 foi obtido a partir de Xangai Cultura Celular Coleção (Xangai, China). HO8910 linha celular foi cultivada em meio RPMI-1640 (Gibco, Foster City, CA) suplementado com 10% (w /v) de soro fetal bovino (FBS; Gibco) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco). A linha celular foi cultivada em SKOV3 5A de McCoy (Gibco, Foster City, CA) suplementado com 10% (w /v) de soro fetal bovino (FBS; Gibco) e 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco). Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2.

Western Blotting

As células foram lavadas com PBS e lisadas com tampão de lise (50 mM de Tris -HCl, pH 6,8, DTT a 100 mM, SDS a 2%, glicerol a 10%). Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 20.000 g durante 10 min, e as proteínas nos sobrenadantes foram quantificadas. Os extractos de proteína foram igualmente carregados com 8% de gel de 12% SDS-poliacrilamida, a electroforese e transferida para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad). As membranas foram coradas com Ponceau S a 0,2% vermelho para assegurar o carregamento igual de proteína. Após bloqueio com 5% de leite desnatado em PBS, as membranas foram sondadas com anticorpos contra a Hsp90 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), Hsp70 (Santa Cruz Biotech), vinculina (Santa Cruz Biotech), Akt (Santa Cruz Biotech), ErbB2 (Cell Signaling, Beverly, MA), Erk (Cell Signaling), Erk fosforilada (Cell Signaling). Os sinais foram detectados com um quimioluminescência phototope HRP-kit (Cell Signaling) de acordo com as instruções do fabricante. Quando necessário, as manchas foram retirados e sondado com anticorpo anti-β-actina como controlo interno. Todas as experiências foram repetidas três vezes com resultados semelhantes.

Cellular deslocamento térmico Ensaio (CETSA)

PBS diluída HO8910 suspensões de células foram congeladas-descongeladas três vezes com azoto líquido. A fracção solúvel (lisado) foi separado dos resíduos celulares por centrifugação a 20, 000 x g durante 20 min a 4 ° C. Os lisados ​​celulares foram diluídas com PBS e divididas em duas alíquotas, com uma alíquota tratada com DMSO e a outra aliquota com CDDO-Me (25 uM). Após 10-30 min de incubação à temperatura ambiente os respectivos lisados ​​foram divididos em aliquotas mais pequenas (30 ul) e aquecidos individualmente a diferentes temperaturas durante 3 min (Veriti termociclador, Applied Biosystems /Life Technologies) seguido por arrefecimento durante 3 minutos à temperatura ambiente . As temperaturas apropriadas foram determinadas em experiências preliminares CETSA (dados não mostrados). Os lisados ​​foram aquecidos centrifugado a 20, 000 x g durante 20 min a 4 ° C, a fim de separar as fracções solúveis de precipitados. Os sobrenadantes foram transferidos para novos microtubos e analisados ​​por electroforese de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de análise Western Blot. Dose efeito de CDDO-Me sobre a estabilidade da Hsp90 foi avaliada de forma semelhante.

Para examinar o efeito do DTT na ligação de CDDO-Me para a Hsp90 em células vivas, células HO-8910 foram tratadas com DMSO, DTT (2 mM), o CDDO-Me (25 uM), ou o CDDO-Me (25? M) pré-incubadas com DTT (a 2 mM, 30 min) durante 3 horas. Em seguida, as células foram colhidos e diluídos em PBS suplementado com um cocktail inibidor da protease completo e aqueceu-se a 63 ° C durante 3 minutos, seguido por arrefecimento à temperatura ambiente durante mais 3 min. As suspensões de células foram congeladas-descongeladas duas vezes com azoto líquido. Os lisados ​​foram centrifugados a 20 000 × g durante 20 min a 4 ° C, a fim de separar as fracções solúveis de precipitados. Os sobrenadantes foram transferidos para novos microtubos e analisados ​​por electroforese em gel de sulfato de poliacrilamida dodecil de sódio (SDS-PAGE) seguida de análise Western Blot.

A interferência de ARN e transfecção

Curto ARN interferente (siRNA) segmentação Hsp90 humana foram sintetizados por Biomics Biotechnologies, Jiangsu, China. As sequências de direccionamento são as seguintes, 5′-GUAUUGUCACAAGCACAUAdTdT-3 ‘e 5′-CGUCUCGCAUGGAAGAAGU-3’. Universal siRNA controlo negativo (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3 ‘) foi utilizada como um controlo. células HO-8910 foram semeadas (3 × 10

5 células /1500 ul /poço de uma placa de 6 poços) e depois misturada com uma solução de complexo de lipofectamina-ARN [100 nM de RNA, 5 lipo2000 ul, 500 ul Opti- MEM /poço], de acordo com a recomendação do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção de siRNAs, as células foram submetidas ao ensaio de imunotransferência ou outras experiências.

celular Ensaio de Proliferação

HO-8910 ou SKOV3 células foram tratadas com CDDO-Me sozinho ou em combinação com DTT. A proliferação celular foi determinada utilizando um kit de contagem de células (Laboratórios, Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante.

t-teste de análise estatística

Student foi utilizado para avaliar a diferença entre os dois tratamentos diferentes . A

valor p

inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

CDDO-Me interage com Hsp90 em células

A fim de saber se CDDO-Me interage com Hsp90 em células, CETSA, um método recentemente desenvolvido para avaliar a ligação a proteína alvo em células de droga, foi realizada. células cancerosas do ovário HO8910 foram lisadas e incubadas com DMSO ou CDDO-Me durante meia hora à temperatura ambiente. Em seguida, várias alíquotas de lisado celular foram aquecidos a diferentes temperaturas. Após arrefecimento, as amostras foram centrifugadas para separar as fracções solúveis de proteínas precipitadas e a presença de Hsp90 na fracção solúvel foi analisada por Western blot. Como mostrado na Fig 1A e 1B, em comparação com DMSO, na presença de CDDO-Me marcadamente aumentou a acumulação de Hsp90 na fracção solúvel às temperaturas examinadas. Nós também testar a resposta à dose de CDDO-Me sobre a estabilidade de Hsp90 ou com aquecimento. Como mostrado na Fig 1C e 1D, com o aumento da concentração de CDDO-Me, a acumulação de Hsp90 marcadamente aumentada. Como um controlo negativo, o CDDO-Me pode não aumentar a estabilidade da vinculina em células. Estes dados sugerem que o CDDO-Me interage directamente com a Hsp90 em células.

CETSA foi realizada em HO8910 células tal como descrito em materiais e métodos. O efeito de estabilização da CDDO-Me sobre a Hsp90 e vinculina a diferentes temperaturas (A) e doses diferentes (C) foram avaliadas por transferência de western. A intensidade das bandas foi quantificada por Hsp90 uma quantidade de software (B, D). Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes.

CDDO-Me inibe a atividade da Hsp90 em células

Uma das marcas da inibição da Hsp90 é a indução de Hsp70 e esta resposta tem sido usada como um biomarcador para muitos ensaios clínicos de inibidores de Hsp90 [24]. Se CDDO-Me inibe a Hsp90, pode regular positivamente a expressão de Hsp70. Com efeito, o tratamento CDDO-me leva à sobre-regulação de Hsp70 de uma forma dependente da dose e tempo (Fig 2A e 2B), que é semelhante ao observado em STA-9090, um conhecido inibidor de Hsp90, tratou-se células SKOV3 e HO8910 células (S1 Fig ). Outra característica da inibição de Hsp90 é a degradação de proteínas clientes [25]. Alguns deles, como ErbB2 tem sido relatada como sendo muito sensíveis à inibição de Hsp90, enquanto que outros como Akt são registadas como sendo menos sensível [26-27]. Nós examinamos o nível de proteína de ErbB2 e Akt em células CDDO-me tratou. A expressão de ErbB2 é detectável em células SKOV3, mas não em células H08910 (dados não mostrados). tratamento CDDO-Me leva à diminuição da proteína ErbB2 em uma dose e forma dependente do tempo em células SKOV3 (Fig 2C e 2D). Para a proteína Akt, tratamento CDDO-me leva à diminuição da Akt de uma forma dependente da dose e do tempo nos dois HO8910 células (Fig 2A e 2B) e as células SKOV3 (fig 2C e 2D). Estes dados sugerem que o CDDO-Me inibe a actividade de HSP90 em células de cancro do ovário.

AD, e HO8910 células SKOV3 foram tratados com CDDO-me em doses diferentes (A, C) e tempo diferente (B, D), e as proteínas foram detectadas indicados por western blot. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes.

Knockdown de Hsp90 sobre o efeito da CDDO-Me em células de cancro do ovário

Para determinar se a inibição da Hsp90 correlacionada com CDDO-me induziu inibição da proliferação de células, utilizou-se RNA de interferência para reduzir a expressão de Hsp90 em HO8910 células. Como mostrado na Figura 3A, a proteína Hsp90 foi especificamente reduzido por Hsp90-targeting siRNA (HO8910

siHsp90) em comparação com o siRNA não específico (HO8910

Sinc). Em comparação com as células transfectadas com vector, knockdown da Hsp90 crescimento celular inibiu significativamente (Figura 3B) e reforçada CDDO-Me inibição da proliferação induzida (Figura 3C) no HO8910 células. Estes dados sugerem que Hsp90 contribui para CDDO-Me inibição da proliferação induzida em células de cancro do ovário.

HO8910 células foram transfectadas com controle siRNA (HO8910

Sinc) ou Hsp90 específica siRNA (HO8910

siHsp90), então tratada com ou sem CDDO-Me para os tempos indicados. As proteínas indicados foram detectadas por Western Blot e a intensidade das bandas foi quantificada pela quantidade de um software de (A). A proliferação celular foi examinada por CCK-8 de ensaio (B, C). Cada experiência foi repetida como menos três vezes.

# p 0,05, em comparação com células de controlo transfectadas siRNA

A interação de CDDO-Me com Hsp90 em células de cancro do ovário por seus a, grupos carbonilo p-insaturados em anéis A e C.

análise a estrutura ea actividade mostrou que os grupos de carbonilo a, p-insaturada sobre um dos anéis a e C é a chave para a actividade de CDDO-Me (Fig 4A) [11]. DTT poderiam formar adutos reversíveis com CDDO Me-a, grupos carbonilo p-insaturados e revogará a sua actividade. Para testar se a interacção de CDDO-me com Hsp90 em células vivas depende da α, porção carbonilo β-insaturado, o CDDO-Me (25? M) pré-incubadas com ou sem DTT (2 mM) foi utilizado para tratar a HO8910 células, seguido com exame CETSA. Com efeito, DTT poderia revogada o efeito estabilizante de CDDO-Me sobre a Hsp90 (Fig 4B). Consistente com isto, o tratamento de DTT CDDO-Me completamente inibida (2 uM) induziu aumento de Hsp70 (Fig 4C e 4D) e a inibição da proliferação das células (Figura 4E e 4F). DTT tem sido amplamente utilizado como anti-oxidante para reduzir o nível de ROS nas células e CDDO-Me também foi demonstrado que o aumento do nível de ROS nas células. Assim, DTT pode inibir a expressão de Hsp70, reduzindo ROS. No entanto, H

2O

2 tratamento não upregulate a expressão de Hsp70 (S2 Fig). Estes dados sugerem que CDDO-Me podem interagir com Hsp90 através de seus a, grupos carbonilo p-insaturados.

A. estrutura química do CDDO-Me. células B. estar HO8910 tratados com DTT, DMSO, CDDO-Me (25 uM) e o CDDO-Me (25? M), pré-incubadas com DTT (2 mM), em seguida, foram sujeitos a CETSA como descrito em materiais e métodos. As alterações de HSP90 de estabilidade foram avaliadas por Western blot (B). HO8910 células SKOV3 e foram tratados com CDDO-Me (2 uM) durante 24 horas na presença ou ausência de DTT (2 mM). As proteínas indicados foram detectadas por Western blot (C, D) e a viabilidade celular foi examinada por CCK-8 de ensaio (E, F). Cada experiência foi repetida como menos três vezes. * P . 0,05

Discussão

CDDO-Me tem mostrado grande eficácia contra uma variedade de cânceres, incluindo câncer de ovário. No entanto, o mecanismo subjacente à acção de CDDO-Me em células de cancro do ovário é menos claro. Neste estudo, foi demonstrado que a Hsp90 é uma nova proteína alvo de CDDO-Me e direcionamento Hsp90 contribui para CDDO-Me morte celular induzida de células de cancro do ovário.

estudos intensivos sobre a ação da CDDO-Me revelaram a proteínas-alvo muito incluindo Akt, Nrf2, PTEN, ErbB2, IKKβ, STAT3, mTOR, PPAR et.al [12]. Curiosamente, algumas das quais, tal como ErbB2, STAT3 e Akt são substratos de HSP90, que, por conseguinte, que o CDDO postular-Me pode inibir directamente a Hsp90, o qual por sua vez medeia o efeito múltiplo de CDDO-Me. Para testar esta hipótese, utilizou-se o método CETSA para avaliar a interação entre CDDO-Me e Hsp90. CETSA utiliza o conceito de que proteínas alvo geralmente são estabilizados quando as moléculas de drogas ligar. Comparado com outros métodos para confirmar a interacção de pequenos compostos de moléculas com proteínas, CETSA é mais viável para executar e pode medir diretamente se uma molécula de droga atingir os seus objectivos em células e modelos animais [28-29]. Usando este método, foi demonstrado que o CDDO-Me interage com Hsp90 em células. Isto foi ainda apoiado pela indução de Hsp70, um universo resposta observada nas células após tratamento com inibidores de Hsp90, especialmente aquelas voltadas para o terminal N de Hsp90 [30]. Além disso, as proteínas Hsp90 de cliente, tal como ErbB2 e AKT, também pode ser reduzida por tratamento CDDO-Me. Por isso, propomos que CDDO-Me interage com Hsp90 e inibe a sua actividade nas células.

Uma questão importante é se a interação de CDDO-Me com Hsp90 contribui para o efeito anticancerígeno de CDDO-Me em células de cancro do ovário . Semelhante ao observado em CDDO-me tratado célula, especificamente silenciamento de Hsp90 resultados na indução de Hsp70 e a sub-regulação de Akt em HO8910 células (Fig 3A) [31-32]. Além disso, knockdown da Hsp90 poderia aumentar significativamente o efeito de inibição da proliferação de CDDO-Me em HO8910 células. Estes dados suportam que a segmentação Hsp90 contribui com o efeito anti-câncer de ovário de CDDO-Me. Como CDDO-Me é um composto múltiplos alvos conhecidos, não descarta que outras proteínas-alvo também contribuem para o efeito anti-cancro do ovário de CDDO-Me.

CDDO-Me tem dois α, β- porção carbonilo insaturado. O mecanismo proposto subjacente ao efeito anti-câncer do CDDO-Me é pela formação de Michael adutos entre CDDO-Me e nucleófilos reactivos, tais como tióis livres de proteínas-alvo [33]. CDDO-Me pode interagir com a Hsp90 de uma forma semelhante, por causa de DTT, um grupo -SH que contém o composto, ab-roga a estabilização induzida por CDDO-me de Hsp90 em resposta ao aquecimento. Além disso, o CDDO-me induziu a regulação positiva de proteínas Hsp70 e redução da Akt também poderia ser invertida por TDT em células. Como CDDO-Me poderia aumentar o nível de ROS nas células cancerosas e inibir o efeito ROS blocos de CDDO-me [23], pode-se argumentar que o efeito do DTT em Hsp70 pode ser devido à sua actividade antioxidante. No entanto, aumentar ROS por H

2O

2 poderia não upregulate a expressão de Hsp70 (S2 Fig). Assim, DTT mais provável reverte o efeito do CDDO-Me, interagindo diretamente com CDDO-Me. O local de ligação de CDDO-Me on Hsp90 momento não é conhecido. Há 6 cisteínas na proteína Hsp90. Que cisteína (s) contribuir para a interação de CDDO-Me com mandados de Hsp90 uma investigação mais aprofundada.

Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar que a Hsp90 é uma nova proteína alvo de CDDO-Me. Segmentação Hsp90 fornece uma nova explicação para os múltiplos efeitos da CDDO-Me observado em células cancerosas diferentes. A aplicação de CDDO-Me às células cancerosas com Hsp90 superexpressão merece mais investigações pré-clínicos e clínicos.

Informações de Apoio

S1 Fig. STA-9090 inibe a função de Hsp90 em células.

HO8910 (A) e SKOV3 células (B) foram tratadas com 9090-STA para diferentes tempos indicados e as proteínas foram detectadas por Western Blot. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0132337.s001

(TIF)

S2 Fig. H

2O

2 activa Erk, mas não regular positivamente a Hsp70.

HO8910 (A) e células SKOV3 (B) foram tratadas com H

2O

2 (10 uM) para diferentes tempos e as proteínas foram detectadas indicados por western blot. Cada experimento foi repetido pelo menos três vezes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0132337.s002

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