Abstract

taxas de mortalidade aumentou devido ao câncer de pulmão que se procedesse a busca de potenciais novos compostos anticancerígenos tais como derivados de carbazol. Carbazoles são compostos heterocíclicos aromáticos com anti-cancro, anti-bacteriano e actividade anti-inflamatória. O estudo investigou a capacidade do novo composto de carbazole (Z) -4- [9-etil-9AH-carbazol-3-il) amino] pent-3-en-2-ona (PAEC) para induzir citotoxicidade das células de cancro do pulmão e o seu mecanismo de acção. PAEC foi sintetizado como um pó amarelo com ponto de fusão 240-247 ° C. O brometo de 3- (4,5-dimethythiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT), peroxidação lipídica e os ensaios de cometa foram utilizados para avaliar o efeito citotóxico do composto sobre células de cancro do pulmão A549. A expressão proteica foi determinada utilizando Western blot, a apoptose foi medida por luminometria ensaio (caspase-3/7, -8 e -9) e citometria de fluxo foi usada para medir a externalização de fosfatidilserina (PS). PAEC induziu uma p53 mediada por apoptose de células de cancro do pulmão, devido a uma redução significativa na expressão de proteínas de defesa antioxidantes (Nrf2 e SOD), Hsp70 (p 0,02) e Bcl-2 (P 0,0006), deste modo,-regulação espécies reactivas de oxigénio (ROS) de produção. Isto resultou em danos no ADN (p 0,0001), a sobre-regulação de actividade de expressão e caspase Bax e indução de apoptose em células de cancro de pulmão. Os resultados mostram o potencial anticancerígeno do PAEC, no cancro do pulmão

Citation:. Molatlhegi RP, Phulukdaree A, Anand K, Gengan RM, Tiloke C, Chuturgoon AA (2015) citotóxica Efeito de um novo composto sintetizado Carbazol em A549 Lung Cancer Cell Line. PLoS ONE 10 (7): e0129874. doi: 10.1371 /journal.pone.0129874

editor: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute, da Universidade de Emory, Estados Unidos

Recebido: 07 de novembro de 2014; Aceito: 14 de maio de 2015; Publicação: 02 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Molatlhegi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability: Dados relevantes são disponíveis no Figshare.com: 1) dados MTT Assay Raw: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425070. 2) Ensaio de TBARS células A549: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425071. 3) Os dados células A549 Ensaio Cometa Raw: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425073. 4) As transferências de Western de dados brutos: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425077. 5) caspase luminometria e os dados de ATP em 6 e 24 h: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425078. 6) Anexina mancha para as células A549 por citometria de fluxo de dados: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425080. 7) Carbazol 6 (CML1) Síntese e Characterization_1: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425089. 8) Carbazol 6 (CML1) Síntese e Characterization_2:. https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1425090

Financiamento: RM reconhece Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade de KwaZulu-Natal para . financiamento deste projecto

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Fundo

Cancro tornou-se uma segunda doença que leva risco de vida responsável por elevada mortalidade. taxas após as doenças cardiovasculares em todo o mundo [1, 2]. De acordo com Globocan, em 2012, havia cerca de 14,1 milhões de novos casos de câncer e 8,2 milhões de mortes relacionadas ao câncer no mundo, em comparação com o relatado 12,7 milhões e 7,6 milhões em 2008. A maioria dos casos de câncer globais é relatado nos países em desenvolvimento, com uma mortalidade de 63% taxa de [3]. Um aumento nos casos de câncer de pulmão nos países em desenvolvimento, incluindo a África do Sul (SA) está associada a doenças infecciosas como a Imunodeficiência Adquirida Syndromes (SIDA) e tuberculose (TB) [2]. Em 2006 só cerca de 4.525 mortes relacionadas com cancro do pulmão foram relatados em SA. Um aumento nos casos de câncer de pulmão em SA é também atribuído a outros fatores tais como o fumo, poluentes ambientais, a exposição ocupacional e estilos de vida em mudança [2, 4].

espécies reativas de oxigênio (ROS) são uma das principais causas de malignidade. Eles são produtos do metabolismo do oxigénio nas células e as suas funções variam de sinalização celular, homeostase e efeitos antimicrobianos [5]. As células de mamíferos são continuamente expostos a ROS gerados tanto extrinsecamente e intrinsecamente [6]. A exposição crónica persistente e a níveis elevados de ROS induz danos no ADN, proteínas e lípidos, e pode resultar na indução de doenças tais como cancro [7, 8]. A fim de manter a homeostase do tecido em organismos multicelulares, a proliferação celular e a morte são regulados por processos do ciclo celular e apoptose. No entanto, a mutação do gene supressor de tumor (es) (e.g. p53) e níveis elevados de ROS pode permitir o crescimento desregulado que conduz ao desenvolvimento do cancro. As células de mamífero contêm sistemas de defesa para regular os danos oxidativos, e estes incluem proteínas, tais como superóxido dismutase (SOD), complexo factor eritróide nuclear 2 relacionada-2 (Nrf2) e a proteína de choque térmico 70 (Hsp70) [9-12].

As taxas de sobrevivência para pacientes com cancro do pulmão submetidos a cirurgia é pobre, portanto, não há necessidade de mais potentes medicamentos contra o câncer anti-pulmonares. O desafio ainda é a capacidade de desenvolver medicamentos altamente eficazes específicos para câncer de pulmão com efeitos colaterais pouco ou nenhum sobre as células normais [13]. Heterociclos tornaram-se uma classe importante de compostos orgânicos para pesquisa por causa das suas numerosas aplicações médicas e agrícolas [14].

Carbazóis são compostos orgânicos aromáticos heterocíclicos, com uma estrutura tricíclica composto de dois anéis de benzeno fundidos cada um para um de cinco anel contendo azoto -membered [14, 15]. Estes produtos sintéticos ou naturais funcionam através da interação com o DNA; que danificam o DNA, resultando em inibição da síntese de novo de ADN ou ARN [16]. Carbazóis e os seus derivados inibem o crescimento do cancro por intercalação no DNA, inibindo a actividade da ADN-topoisomerase II, bem como através da formação de aductos de DNA covalentes mediadas por oxidação por citocromo P

450 e peróxidos [15]. Diferentes derivados de carbazol natural e sintética, incluindo elipticina, olivacina, acetato de eliptínio, mahanimbine, mukonine, koenoline e rebaccamycin têm sido relatados como tendo actividade anti-neoplásica [15].

Com base na sua antitumoral relatado, as actividades anti-bacterianas e anti-inflamatórios , diferentes análogos sintéticos de carbazole ter sido sintetizado a partir de carbazoles que ocorrem naturalmente [14, 15, 17]. Carbazóis e seus derivados são cada vez mais alvo potencial para uso no tratamento do câncer devido lo ao seu grande sistema de π conjugado que, torná-lo fácil de introduzir diferentes grupos funcionais no anel carbazole rígida [15].

O estudo investigou as propriedades anticancerígenas de PAEC em células cancerígenas do pulmão e determinou-se a via de anti-neoplásica ele modula em conjunto com as proteínas associadas. Supõe-se que PAEC induzida apoptose das células cancerosas do pulmão A549 através da indução do estresse oxidativo.

Materiais e Métodos

Carbazol derivado (PAEC) foi sintetizado no Departamento de Química (Universidade de Tecnologia de Durban , SA). As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram isoladas a partir de sangue total de um voluntário masculino saudável após obter a aprovação institucional ético (BF 170/11). As células A549 foram obtidas a partir de Highveld Biologicals (Johannesburg, SA), os reagentes de cultura celular de Whitehead Scientific (Johannesburg, SA), Ellipticine (Sigma, St Louis, MO, EUA) e reagentes de Western blot da Bio-Rad (EUA). Outros reagentes foram obtidos da Merck (SA)

Síntese do ácido (Z) -4 -. ((9-etil-9H-carbazol-3-il) amino) pent-3-en-2-ona

Uma mistura de acetilacetona (1,02 mL, 0,01 mol), 3-amino-9-etilcarbazole (2,1 g, 0,01 mol) e cloreto de índio (0,22 g, 0,001 mol) em etanol (25 mL) foi aquecida sob de refluxo durante 5 h. Depois de completada a reacção, o excesso de solvente foi evaporado. O resíduo foi dissolvido em gelo /água e extraiu-se com acetato de etilo. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio anidro. Em seguida, foi purificado sobre uma coluna de gel de sílica (eluente éter-petróleo: acetato de etilo (90:10)). O produto puro foi recristalizado a partir de metanol

O composto do título (Z) -4 -. ((9-etil-9H-carbazol-3-il) amino) pent-3-en-2-ona (PAEC ) foi preparado com um bom rendimento por meio de reacção de dois componentes sob cloreto de índio como promotor estrutura do composto preparado (Figura 1). A estrutura do composto preparado foi então estudado e caracterizado através de infravermelhos (IR), Hydrogen-1 (

1H) e carbono-13 (

13C) técnicas espectroscópicas.

Extração de sangue periférico de células mononucleares

células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas a partir de sangue total heparinizado por centrifugação de gradiente de densidade. Volumes iguais de sangue e de Histopaque 1077 (Sigma, Alemanha) foram divididas em alíquotas para tubos cónicos de 15 ml e centrifugou-se (400 g, 30 min). A camada buffy coat contendo PBMCs foi aspirado e lavado duas vezes com 0,1 M de tampão de fosfato salino (PBS; 400 g, 10 min).

cultura de células de tecido

células A549 foram cultivadas de acordo com um método anteriormente descrito [18]. Em resumo as células A549 foram cultivadas a 37 ° C, 5% de CO

2 em meio essencial mínimo de Eagle (EMEM) suplementado com 1% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina-fungizona e 10% de soro fetal de vitelo. O crescimento celular foi monitorizado e meio de cultura de células (CCM) foi mudado como necessário. frascos confluentes foram tripsinizadas e azul de tripano foi utilizado para a numeração de células. As PBMC obtidas a partir de um dador do sexo masculino foram cultivadas a 37 ° C, 5% de CO

2 em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 1% de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina-fungizona e 10% de soro fetal de vitelo .

a viabilidade celular ensaio

a viabilidade das células foi realizada como descrito anteriormente [18], com ligeira modificação. O ensaio tiazol metil tetrazólio (MTT) foi usado para determinar a citotoxicidade de PAEC em PBMC e as células de cancro do pulmão A549. PBMC e as células A549 (20, 000 células /poço) foram incubadas com diferentes concentrações (0, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,6, 0,7 e 0,8 ug /ml) de PAEC e incubadas numa placa de microtitulação de 96 poços em triplicado a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 24 h. As células incubadas com DMSO a 1% foram usados ​​como controlo de veículo (controle V) e elipticina em concentrações (0, 0,01, 0,025, 0,050, 0,10, 0,25, 0,6 e 0,8 ug /ml) foi utilizado como um controlo positivo. Após 24 h de incubação, a solução de sal de CCM /MTT (5 mg /ml) foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 4 h. O sobrenadante foi então removido e 100 ul /poço de dimetil sulfóxido (DMSO) foi adicionado seguido por incubação (1 h). A absorvência do formazano produzido foi medida a 570 nm e comprimento de onda de referência de 690 nm utilizando um espectrofotómetro Bio Tek μQuant. software GraphPad Prism V5.0 foi utilizada para traçar uma curva de concentração-resposta, que foi posteriormente usado para determinar um

valor IC50 do PAEC, em PBMCs e células A549.

ensaio de peroxidação lipídica para quantificação de malondialdeído ( MDA)

ensaio de ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi utilizado para medir a capacidade do PAEC para gerar ROS. O sobrenadante de controlo, de controle V e células PAEC tratado foi transferido para tubos de ensaio com 2% H

3PO

4 (200 ul), solução de TBA /BHT (400 ul) e 7% H

3PO

4. Utilizou-se um controlo positivo de 1% de MDA e um controlo negativo de HCl 3 mM (400 ul). O pH da amostra foi marcada (pH 1,5) e aqueceu-se a 100 ° C durante 15 min. As amostras foram deixadas a arrefecer até à temperatura ambiente (RT), seguido pela adição de 1,5 ml de butanol, vórtex e, em seguida, deixada a separar em fases distintas. A fase de butanol foi superior aliquotadas em 96 poços de placas de microtitulação em triplicado. A densidade óptica foi medida a 532 nm com comprimentos de onda de referência de 600 nm. A densidade óptica média foi calculada para cada amostra e dividido pelo coeficiente de absorção de 156 mM

-1 para se obter a concentração MDA (M) por tratamento.

DNA danos

O teste do cometa foi usado como anteriormente descrito [18], com ligeira modificação, para determinar o dano de DNA. Os três tratamentos (controlo, de controlo e V PAEC) foram preparados, respectivamente, seguida por remoção do sobrenadante, e depois tripsinizadas. Duas corrediças por amostra foram preparados como se segue; a primeira camada de 700 ul, 2% de baixo ponto de fusão de agarose (IMPA, 37 ° C), a segunda camada de células (25 uL), 1% IMPA (175 uL, 37 ° C) e vermelho de gel (1,5 mL), e a terceira camada de 1% IMPA (250 uL, 37 ° C), e, em seguida, coberta com a tampa desliza microscópio. Após a solidificação, as lâminas foram imersas em solução de lise frio [2,5 M NaCl, 100 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, 1 M de Tris, 10% de DMSO] e incubou-se a 4 ° C durante 1 h. Após a lise, as lâminas foram colocadas em tampão de electroforese [NaOH 300 mM, 1 mM de Na

2EDTA (pH 13)], durante 20 min, e em seguida, a electroforese foi corrida a 25 V durante 35 min. Após a electroforese, as lâminas foram lavadas três vezes durante 5 min com tampão [Tris 0,4 M (pH 7,4)] neutralizantes. As lâminas foram então visto com um microscópio de fluorescência (Olympus IXSI microscópio invertido com 590 filtros de emissão nm e 510-560 nm de excitação). Para cada slide, 50 células foram capturados e seus comprimentos cauda do cometa foram medidos em um utilizando sistema de imagem suave (Life Science-Olympus macia imagem Solução v5).

Western blot análise

A expressão da proteína da p53, Bax, Bcl-2, Nrf2, SOD e Hsp70 em células A549 foi determinada utilizando western blot. As proteínas foram isoladas a partir de células A549 usando reagente Cytobuster suplementado com inibidores de fosfato (Roche, Cat. N. 04906837001) e inibidor de protease (Roche, Cat. N. 05892791001). ensaio do ácido bicinconínico (Sigma, Alemanha) foi usada para a quantificação da proteína. As proteínas foram normalizadas para uma concentração de 3,966 mg /ml. As amostras foram então preparadas num tampão de Laemmli, fervidas durante 5 min a 100 ° C e a electroforese a 150 V durante 1 h em 7,5% de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio (SDS-PAGE) utilizando Bio-Rad corrente compacto de alimentação. sistema de Transferência Trans-Blot Turbo foi usada para transferir as proteínas separadas para membranas de nitrocelulose a 20 V durante 45 min. A BSA a 3% em solução salina tamponada com Tris [(TTBS) -NaCl, KCl, Tris, dH

2O, Tween 20, pH 7,4)] contendo 0,5% de Tween 20 foi utilizado para bloquear as membranas durante 1 hora, seguido por um dia para o outro incubação com anticorpos primários [p53 (2521P), Nrf2 (8882), SOD (4266), Hsp70 (BD 610607) e Bcl-2 (3869); 1: 5000], 5 x lavagem com TTBS, 1 h de incubação com os anticorpos secundários (anti-rato: ab97046; 1: 10000) à TA e 5 x lavagem com TTBS (10 min cada). β-actina (ab8226; 1: 5000) foi utilizado para normalização proteína. Um 50:50 (v /v) de solução luminal /intensificador e peróxido de solução de Claridade de Western foi adicionado para cada membrana de nitrocelulose transferidas electro-para formar o complexo de antigénio-anticorpo. O sinal gerado foi detectado utilizando o sistema de documentação imagem 2,7 Alliance (UViTech). A expressão proteica foi então analisada usando UViBand análise avançada de imagens v12.14 software (UViTech). Os dados foram expressos como alteração de dobragem (FC).

ATP actividades de caspase-3/7, 8, 9 e

ensaios baseados em luminescência dependentes do tempo (6 h e 24 h) foram usadas para avaliar as actividades de caspase-Glo 3/7, 8, 9 e ATP. A seguir ao tratamento com PAEC (6 h e 24 h), as células A549 foram tripsinizadas, ajustada a 20.000 células /poço, seguido de centrifugação a 3000 g x (5 min, RT). O sobrenadante foi removido; as células foram então re-suspenso em 50 ul de PBS /po para cada tratamento e, em seguida, inoculadas em uma placa de 96 poços de microtitulação de poliestireno opaca em seis repetições. as orientações do fabricante foram usados ​​para preparar Caspase-Glo 3/7, 8, 9 e reagentes ATP (Promega). Cerca de 100 ul de reagente foi adicionada a poços específicos, e, em seguida, incubou-se no escuro (30 min, RT). O Módulo de luminómetro de microplacas foi utilizado para a medição subsequente da luminescência e os dados obtidos foram expressos como RLU.

Anexina-V-Fluos ensaio

ensaio de Anexina mancha foi realizado como previamente descrito [19 ], com ligeira modificação. A fosfatidilserina (PS) translocação foi determinada utilizando o kit de detecção de apoptose com anexina V-Fluos (Roche). Para cada suspensão de células A549 100 ul, 100 ul de tampão de coloração Anexina e 100? L de anexina V-Fluos solução de etiquetagem (anexina-V: iodeto de propidio: anexina tampão de coloração (1: 1: 50 vol /vol /vol)) eram adicionada em tubos de 1,5 ml. O citômetro de fluxo BD Accuri foi usado para capturar dados de células coradas. As células foram analisadas usando o gating Accuri C6 e software de análise v1.0 cflow Plus. Para cada amostra de 50.000 eventos foram analisadas em triplicado. Os resultados são apresentados como percentagem de apoptose em células positivas para anexina-V (ITCF) no quadrante inferior direito (início de apoptose) e no quadrante superior direito (final de apoptose) foram fechado.

A análise estatística

software v5.0 GraphPad Prism (GraphPad software Inc., La Jolla, EUA) foi utilizado para a análise estatística. Para todas as experiências, os resultados obtidos dos triplicados foram representados como média com desvio padrão (SD). A significância estatística dos resultados foi analisada com unpaired

t

-teste e um intervalo de confiança de 95%. Os valores de

P . 0

05

foram então considerados estatisticamente significativos

Resultados

Síntese de (Z) -4 -. ((9-etil-9H-carbazol-3 -il) amino) pent-3-en-2-ona

O produto resultante era um sólido amarelo produzido com um rendimento de 94%; ponto de fusão (mp): 240-247 ° C. Os grupos funcionais foram previstas usando IV (KBr, cm

-1): 1774,97 (C = O), 3043,92 (N-H), 2988,76 (C-H) alcanos, 1562,66 (C = C) anéis aromáticos (Fig 2A). A

1H-RMN (400 MHz, CDCl

3) foi utilizado para prever o rácio entre o número de hidrogénio: δ (ppm) 12,59 (s, 1H), 8,20 (q, 1H), 7,8 (d, 1H), 7,45-7,40 (m, 2H), 7,35-7,30 (m, 3H), 5,3 (s, 1H), 4,35 (q, 2H), 2,25 (s, 3H) 1,95 (s, 3H), 1,45 ( t, 3H) (Figura 2B). A

13C-RMN (400 MHz, CDCl

3) foi ainda utilizado para prever a espinha dorsal da molécula: δ (ppm) 195,67, 191,20, 161,94, 140,51, 138,18, 130,13, 126,39, 126,18, 123,93, 123,15, 122,47, 121,00, 120,52, 119,00, 117,65, 109,32, 108,72, 108,59, 96,60, 37,70, 29,08, 27,84, 19,80, 13,82, 13,72 (Fig 2C).

(A) IR, (B)

1H-RMN e (C)

espectros de 13C-RMN.

a viabilidade celular ensaio

o ensaio de MTT foi utilizado para determinar o efeito citotóxico do PAEC no Normal PBMC saudáveis ​​e células cancerosas do pulmão A549. Ellipticine (um potente derivado de carbazole neoplásica) foi utilizado como controlo positivo (Figura 3), enquanto que 1% de DMSO foi usado como um controlo de veículo (Fig S1). Com base nos resultados do controlo de veículo (Fig S1) e os resultados de viabilidade celular DMSO anteriores [20], 1% de DMSO não induzir citotoxicidade, por conseguinte PAEC foi dissolvido em DMSO a 1% e utilizado em todos os tratamentos subsequentes. Os dados de citotoxicidade representada uma relação de resposta à dose com respeito a ambos PAEC e elipticina (Figura 3).

(a) o efeito de (A) PAEC e (B) elipticina sobre a viabilidade celular de PBMC e as células A549 depois 24 h de tratamento. [N = 3 repetições com intervalo de confiança de 95%].

Usando a curva dose-resposta obtida, um IC

50 valor de 1,99 mM no intervalo de confiança de 95% foi calculado para PAEC tratada A549 células de cancro de pulmão (Tabela 1) e subsequentemente usados ​​em todos os ensaios. Além disso, ECAP não mostrou citotoxicidade em PBMC normais e saudáveis ​​(não era possível calcular IC

50 valor para PBMC).

ensaio de peroxidação lipídica para quantificação de malondialdeído (MDA)

a peroxidação lipídica, tal como medido pela concentração de MDA, foi significativamente aumentado nas células PAEC tratados em comparação com o controlo (0,305 ± 0,00490 uM vs 0,190 ± 0,007479 uM (controle)) em 95% de intervalo de confiança (Figura 4).

(p 0,0002) [*** significância em relação ao controle, número de repetições: n ≥ 3]

danos no DNA

dano ao DNA foi avaliada usando. do ensaio do cometa. PAEC aumentou significativamente o comprimento de caudas de cometa em células tratadas em comparação com o controlo com 81,80 ± 1,19