Sumário

Fundo

Considerou-se que os métodos de detecção de células tumorais circulantes (CTCs) com base na molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM) subestimam o número de CTC e pode perder um subpopulação metastático com propriedades de células-tronco do câncer (CSC). Portanto, nós investigamos EpCAM-positivos e CTCs -negative no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) pacientes em diferentes fases, avaliou o valor clínico destes CTCs e explorou sua capacidade no seguinte modelo de CSC.

Métodos

CTC foram enriquecidos pela depleção de leucócitos, com bi-anticorpos, utilizando uma técnica de separação de esférulas magnéticas e, em seguida, identificados pela expressão de EpCAM e a citoqueratina 7 e 8 usando múltiplos parâmetros de citometria de fluxo. Determinou-se a distribuição dos CTC classificadas pela expressão de EpCAM em 46 pacientes com NSCLC, com fases I a IV, avaliou o valor diagnóstico destas CTC por monitorização longitudinal em 4 pacientes de índice durante a terapia adjuvante e caracterizado a stemness destes CTC pela expressão de CXCR4 e CD133 em 10 pacientes.

resultados

EpCAM-negativo (E-) CTCs foram detectados a ser significativamente maior do que (e +) CTCs EpCAM-positivo em estágio IV (

p

= 0,003). Os pacientes com o percentual de E-CTCs mais de 95% (

r Art 95%) foram detectados a ser significativamente aumentado de 13,3% em estágio I-II para 61,1% no estágio IV (

p

= 0,006). A análise de Kaplan-Meier indicou que os pacientes com

r Art 95% tiveram tempo de sobrevivência significativamente menor do que aqueles com

r

≤ 0,95 (

p

= 0,041). monitorização longitudinal de CTC indicou que os pacientes com uma elevada percentagem de E-CTC no sangue não foram responsivos à quimioterapia ou terapia-alvo. A caracterização adicional dos CTC revelou que uma subpopulação de haste do tipo CTC CXCR4 + CD133 + foram detectados a ser significativamente mais prevalente em E-CTC do que em E + CTC (

P

= 0,005).

Conclusões

o enriquecimento dos CTC pela depleção de leucócitos, com bi-anticorpos é um método valioso para estimar o número de CTC, o que pode ser potencialmente aplicada na previsão do prognóstico, monitorização do efeito terapêutico de doentes com NSCLC e analisando ainda mais a biologia das CTCs

Citation:. Yin J, Wang Y, Yin H, Chen W, Jin G, Ma H, et al. (2015) Circulação Células Tumorais enriquecida pela depleção de leucócitos, com Bi-anticorpos em Non-Small Cell Lung Cancer: potencial aplicação clínica. PLoS ONE 10 (8): e0137076. doi: 10.1371 /journal.pone.0137076

editor: Huei-Wen Chen, Instituto Universitário de Toxicologia, TAIWAN

Recebido: 24 Janeiro, 2015; Aceito: 12 de agosto de 2015; Publicação: 28 de agosto de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho é apoiado pela Jiangsu Natural Science Foundation (BK20141435); A introdução de talento Foundation (2011RC11); Medical Science Foundation e Tecnologia de Desenvolvimento, Departamento de Saúde Nanjing (YKK13088); O Programa Chave da National Science Foundation Natural da China (81230067); Programa Nacional de Pesquisa Key Básico Grant (2013CB911400)

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de pulmão é a principal causa de câncer. morte -relacionados [1], e aproximadamente 85% dos casos de cancro do pulmão são o cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Embora o tratamento sistemático foi melhorado, a taxa de sobrevida global em 5 anos é apenas 10-20% [2]. A principal razão para a baixa taxa de sobrevivência é metástases à distância das células tumorais. Na cascata metastática, as células tumorais circulantes (CTCs) foram considerados como participantes-chave na formação de metástases distantes [3]. Um estudo anterior mostrou que CTCs que expressam a molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM) são detectáveis ​​em pacientes com NSCLC fase IV e são um romance fator prognóstico para esta doença [4]. No entanto, tem sido sugerido que os métodos baseados na expressão de EpCAM subestimam o número de CTC e pode perder uma subpopulação de metastático CTC com as propriedades das células de haste do cancro (CSC) [5, 6]. Um estudo recente relatou que CTC são detectados 2 vezes mais eficazmente pelo ISET (isolamento por tamanho de células de tumor epitelial) do que os de CellSearch, e que uma subpopulação de CTC, que não expressam EpCAM (por exemplo, E-CTC), pode ser detectado no sangue de doentes com NSCLC [7]. Outro estudo demonstrou também que a enumeração destas células é muito maior do que a da CTC capturado por CellSearch [8]. Até agora, o valor clínico e biologia destes E-CTCs tem sido pouco clara, e uma publicação recente indicou que futuros estudos devem incluir a detecção de E-CTCs [9].

CTCs em transição epitelial-mesenquimal (EMT) têm sido considerados a desempenhar um papel importante na formação de neoplasias [5]. EMT pode gerar células com propriedades de células-tronco [10]. Durante EMT, a expressão de EpCAM em células tumorais irão ser regulados negativamente. Um estudo anterior relatado que o eixo SDF-1 /CXCR4 desempenha um papel importante na mediação da migração de células e a sobrevivência após um EMT induzida por TGF-β [11]. No entanto, ainda não está claro se estes (ou qualquer) CTCs com EpCAM regulamentada-down têm uma maior metastático semeadura resistência ou potencial elevado para a terapia sistêmica e, como foi recentemente indicado, maior valor prognóstico [12]. O nosso estudo anterior revelou que CTC-expressam CXCR4 foram detectados no sangue de doentes com tumores sólidos [13]. Um estudo recente relatou que a sobre-regulação dos receptores CXCR4 é funcionalmente cruciais para a manutenção de células NSCLC na stemness resistentes a drogas [14]. Por isso, é necessário caracterizar a stemness de E-CTC.

CTC são raras no sangue de pacientes com tumor, e os estudos sobre a biologia dos CTC são limitados pela baixa concentração e rendimento dos CTC [9] . Embora os estudos anteriores mostraram que a técnica ISET é mais eficaz na captura de E-CTC em NSCLC [7, 8], um estudo recente relatou que pulmão tumores crescem mais rapidamente e lançar um número significativo de células metastáticas letais em tamanhos pequenos [15]. Por conseguinte, um “imparcial” método de isolamento de CTC é desejável. Temos anteriormente estabelecido um enriquecimento negativo dos CTC [16], que se baseia na depleção de leucócitos, usando uma técnica de separação de esférulas magnéticas e subsequente detecção por múltiplos parâmetros de citometria de fluxo. No presente estudo, nós melhoramos esta técnica, esgotando leucócitos com bi-anticorpos para melhorar a pureza de CTCs para sua caracterização e aplicação futura na análise molecular. Por este método, determinou-se a distribuição de CTCs classificadas pela expressão de EpCAM em 46 pacientes com NSCLC com estágios de I a IV, investigou seu valor diagnóstico na terapia sistemática de acompanhamento longitudinal destas CTCs em 4 pacientes índice, avaliaram o valor prognóstico da estes CTCs e caracterizou a stemness destes CTCs medindo a expressão de CXCR4 e CD133.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes e voluntários saudáveis ​​antes de participar no estudo. coleta de sangue e as análises foram aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade Médica de Nanjing. O desenho ea realização do presente estudo envolvendo seres humanos foram claramente descrito em um protocolo de pesquisa.

População do estudo e preparação de amostras de sangue

amostras de sangue periférico de 46 pacientes com NSCLC foram coletados de janeiro a novembro, em 2013, em Nanjing Chest Hospital e Jiangsu Hospital do Câncer. As características dos pacientes estão listadas na Tabela 1. O sangue foi colhido após descartar o primeiro 2 mL para evitar a contaminação de células da pele potencial de punção venosa, e então processado dentro de 4 horas após a coleta. As amostras de sangue de 4 pacientes índices também foram coletadas no final de cada período de quimioterapia ou terapia-alvo imediatamente, e foram avaliados os efeitos terapêuticos dos pacientes de acordo com os Critérios de Avaliação de resposta em tumores sólidos.

CTC enriquecimento

As soluções de células a partir de amostras de sangue foram preparados como anteriormente descrito [16]. CTCs foram então enriquecida pelo esgotamento dos leucócitos com bi-anticorpos de acordo com as seguintes etapas: a primeira, com base em leucócitos antígeno CD45 comum, humana Kit Whole CD45 Sangue Esgotamento (EasySep, as células-tronco Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canadá) foi usado como o primeiro passo para a remoção de leucócitos; Em segundo lugar, com base no antigénio de superfície de leucócitos CD53, as células foram coradas por rato PE anticorpo CD53 anti-humano (BD Bioscience, EUA), lavou-se com PBS e, em seguida, ainda mais reduzidos com o Kit de selecção positiva PE (EasySep, Stem Cells Technologies, Inc., Vancouver , BC, Canada) como o segundo passo para os leucócitos. O procedimento foi realizado seguindo as instruções dos fabricantes com pequenas modificações.

A citometria de fluxo

Após o enriquecimento, CTCs foram divididos igualmente em 2 tubos e coradas com anticorpo anti-EpCAM, anti-CK7 /8 , anti-CD45 (BD Bioscience, EUA) no primeiro tubo e correspondentes anticorpos de controlo do isotipo no segundo tubo. Para explorar a biologia dos CTC em stemness, as células enriquecidas foram juntos coradas com anticorpo anti-CXCR4 (BD Bioscience, EUA) e anti-CD133 (Miltenyi Biotec GmbH, Alemanha) (no primeiro tubo) e os anticorpos de controlo correspondente de isotipo ( no segundo tubo) em 10 amostras. A concentração final de cada anticorpo foi de 10 ug /mL. Um sistema FACS AriaIII (BD Biosciences) foi realizado para determinar a expressão de todos os marcadores, e os dados foram analisados ​​utilizando o software 7.2.5 FlowJo (ár, Ashland, OR, EUA). As células com a expressão dos marcadores acima foram fechado por o de controlo de isotipo correspondente com base na divisão distinta entre eles. CTCs foram definidos como células Cytokeratin + CD45-CD53-.

Spiking experimento

A linha de células de cancro do pulmão humano PC9 (alta expressão de EpCAM e Cytokeratin) foi contribuído pelo Centro de Câncer de Nanjing Medical Universidade e cultivadas em meio DMEM rico em glicose, contendo 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. PC9 células foram colhidas de acordo com o mesmo procedimento como anteriormente descrito [16]. Zero, 10, 50, 100 e 500 células PC9 foram incrementadas em 2 ml de sangue de voluntários saudáveis. PC9 células foram, em seguida, enriquecido de acordo com o método descrito acima. Após o enriquecimento, CTCs foram divididos igualmente em 2 tubos e coradas com anticorpo anti-EpCAM, anti-CK7 /8, anti-CD45 e os anticorpos de controlo de isotipo correspondentes. Na análise por citometria de fluxo, a percentagem de CTC em todas as células (incluindo leucócitos e CTC) após enriquecimento foi definido como o grau de pureza dos CTC permaneceu. A recuperação e a pureza foi calculada para avaliar o desempenho do método, que foram determinadas como se segue: Recuperação = N

1 /N

2 × 100%, Pureza = N

1 /(N

1 + n

3) x 100% (N

1 é o número de células PC9 encontrados após enriquecimento; N

2 é o número de células PC9 cravado em 2 mL de sangue; N

3 estava o número de leucócitos encontrados após enriquecimento). O experimento spiking em cada condição foi repetido três vezes

Para verificar nossa plataforma CTC ainda é viável, foi obtido linha de células PC9 com baixa expressão de EpCAM de acordo com as seguintes etapas:. Células foram semeadas a uma densidade de 5 × 10

5 células em quatro 6cm-pratos e incubadas em 5% de CO

2, 95% de ar a 37 ° C até que a sua densidade atingiu 80%. As células cultivadas foram mantidas em DMEM isento de soro (0,1% de BSA, 2 mM de L-glutamina, 100 U /mL de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO a 5%

2 ambiente durante a noite, e, em seguida, estimulada por 5 ng ml de TGF-β1 /(PeproTech, EUA) no mesmo meio durante 3 dias. Os experimentos foram spiking procedeu usando este tipo de células PC9 (chamado PC9-EMT) de acordo com o mesmo procedimento descrito acima.

Cutoff

valor

Determinou-se a linha de base de E + e E-CTC por sua enumeração nas amostras de sangue a partir de 11 voluntários saudáveis. Os valores de corte de E + e E-CTC foram calculados por o limite superior do valor médio dos CTC mais desvio padrão (SD). Se os dois tipos de CTCs eram ambos sob os valores de corte, este paciente seria definido como tendo CTCs detectados e seriam excluídos da análise estatística. Se apenas um tipo de CTC estava sob o valor de corte, este tipo de CTC seria tratado como 0 para a conveniência em análise estatística. A percentagem de E-CTC foi calculada de acordo com o número total de E + e E-CTC. Se a percentagem de E-CTC foi superior a 95% (

R

95%)., Este paciente seria considerado ter maioria absoluta de E-CTC no sangue

Estatística análise

a análise dos dados foi realizada com pacotes STATA (Stata Corporação, College station, TX, EUA). Mann-Whitney e χ

2 testes foram usados ​​para comparar os dois grupos. Cox modelo de riscos proporcionais foi realizada usando SPSS (Statistical Package for Social Sciences) v. 16.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL) para avaliar a correlação entre o tempo de sobrevivência dos doentes ea percentagem de CTCs.

P

valores 0,05 foram considerados apresentar diferenças significativas.

Resultados

Avaliação do método de enriquecimento CTC

Depois de estimulação por TGF-β, durante 3 dias, a expressão de EpCAM em células PC9 diminuiu de 97,7% para 51,7%. Utilizando o nosso método em experiências spiking, o valor médio da recuperação /pureza de células PC9 e PC9-EMT foram 80,7% /9,5% e 74,3% /9,5%, respectivamente. A curva de calibração é mostrada na FIG 1. Existe uma relação linear com a inclinação em 0,678 (0,782) entre os logaritmos das células PC9 (células EMT-PC9) encontrados e células PC9 (células EMT-PC9) adicionado.

As curvas de calibração em spiking experimentos usando linha celular PC9 (A) e (B) células PC9-EMT; (C) Análise FACS para a expressão de EpCAM em células PC9 e PC9 EMT-estimulada por 5 ng /mL de TGF-β durante 3 dias.

Os valores de corte de E + e E-CTC foram determinados em 11 amostras de sangue de voluntários saudáveis. E + CTC foram detectadas em apenas uma amostra, e E-CTC foram detectadas em 8 amostras. O valor médio de CTCs + SD foi de 0,09 + 0,30 e 1,18 + 0,98 /mL de sangue para E + e E-CTCs, respectivamente. Portanto, zero e 2 foram definidos como os valores de corte para E + e E-CTCs, respectivamente.

Em 46 amostras de sangue, CTCs foram não detectado em cinco amostras (1 em fase II e 4 em estágio IV), devido a ambos e + e e-CTCs sob os valores de corte correspondentes. Em 41 amostras de sangue com CTC detectado, o valor médio [gama] da pureza dos CTC foi de 10,6% [0,1% -51,1%]. Destas amostras, 36,6% (15 de 41) tinha uma pureza de mais de 10,0% CTC. O grau de pureza máximo de CTC foi de 51,1%. Os resultados representativos das análises de FACS estão disponíveis em S1 Fig.

Distribuição dos CTC em pacientes

As taxas de detecção de E + e E-CTC são mostrados na Fig 2A. + CTCs E foram detectados em 13 dos 16 (81,3%) fase I-II, 6 de 8 (75,0%) no estádio III e 8 de 22 (36,4%) fase IV pacientes. E-CTCs foram detectados em 13 dos 16 (81,3%) fase I-II, 8 de 8 (100%) no estádio III e 18 de 22 (81,8%) fase IV pacientes. + CTCs E estava determinada a ser significativamente mais baixos pacientes no estágio IV do que na fase de pacientes I-II (

p

= 0,007). E + CTCs e E-CTCs foram detectados a ser significativamente diferente pacientes no estágio IV (

p

= 0,003). Além disso, 2 dos 15 (13,3%) fase I-II, 3 de 8 (37,5%) no estádio III e 11 de 18 (61,1%) fase IV pacientes foram detectados a ter uma maioria absoluta de E-CTCs no sangue (

r Art 95%). A freqüência de pacientes com

r Art 95% foi detectada a ser significativamente maior no estágio IV do que na fase de pacientes I-II (

p

= 0,006, Fig 2B).

(A) Distribuição das taxas de detecção de E + e E-CTCs em pacientes em diferentes fases; (B) Percentagem de pacientes detectados com uma percentagem de E-CTCs superior a 95% (

r Art 95%); (C) A distribuição do número de E + e E-CTC de pacientes em diferentes estágios; (D) Distribuição do percentual de E-CTCs em diferentes estágios. (+ /+, + Cytokeratin EpCAM +; +/-, Cytokeratin + EpCAM-).

De acordo com os valores de corte, CTCs foram detectadas em 41 pacientes ea distribuição do número de E + e E -CTCs é mostrado na Figura 2C. Os valores medianos [Interquartil Gama, IR] /mL de sangue de E + e E-CTCs eram 6.0 [2,5-12,0] e 18. [11,0-47,5] na etapa pacientes I-II, 11,0 [3.25-16.0] e 31,5 [22,5 -31,5] no estágio III e 6,5 [2,25-49,25] e 15,5 [5,75-35,75] no estágio IV pacientes, respectivamente. Houve uma diferença significativa no número de E + e E-CTCs em ambas fase I-II e III (

p

= 0,001 para ambos), mas não no estágio IV porque o número de E + CTCs foi aumentada em vários pacientes. A distribuição da percentagem de E-CTC é mostrado na Fig 2D. Os valores medianos [IR] do percentual de E-CTCs eram 83,0% [50,0% -91,0%] na fase I-II, 90,0% [72,8% -99,0%] no estágio III e 100,0% [60,5% -100,0% ] no estágio IV pacientes. Embora uma elevada percentagem de E-CTCs foi encontrado em todas as fases, não houve uma diferença significativa.

acompanhamento longitudinal de CTCs em terapia adjuvante

E + e E-CTCs foram monitorados de forma dinâmica em 4 pacientes de índice, e os resultados são mostrados na Figura 3. o paciente 1 (Fig 3A e S2 figura), que tinham doença progressiva após o tratamento inicial com gefitinib, mostraram que a doença se parcial a completa remissão no tratamento com ALIMTA (pemetrexeddisodium) + cisplatina . O número de E + CTC diminuiu 4-0 /ml de sangue, mas o número de E-CTC aumentou de 15 para 44 /mL de sangue no primeiro período e diminuiu para perto de 0 /mL de sangue nos últimos três períodos. A percentagem de E-CTC foi de 79% no início, ligeiramente aumentada para 100% durante o primeiro período, diminuiu para 50% e mantida a esse nível nos dois períodos que se seguem, mas nao foi detectada no último período.

(A) gefitinib e, em seguida, ALIMTA + cisplatina tratamento; (B) O paclitaxel lipossoma + cisplatina e, em seguida, radioterapia + erlotinib tratamento; (C) ALIMTA + carboplatina e, em seguida, tratamento erlotinib; tratamento (D) Erlotinib. Cada período de tratamento foi de um mês.

O paciente 2 (Fig 3B e S3 Fig), que teve a doença progressiva após o tratamento inicial com paclitaxel lipossomal + cisplatina, mostrou doença estável durante o primeiro período, mas teve progressiva doença durante o segundo período, devido a uma metástase cerebral. Após o tratamento com radioterapia + erlotinib, este paciente mostrou remissão parcial da doença. O número de e-CTC caiu de 34 a 3 /mL de sangue no primeiro período, aumentada para 13 /mL de sangue durante o segundo período e depois diminuiu para 3 /mL de sangue no último período, enquanto que o número de E + CTC mostrou alteração insensível a partir de 0, 0, 2 a 1 /ml de sangue durante a terapia. O percentual de E-CTCs foi mantida no nível elevado (100%) durante o primeiro período, e depois diminuiu para 87% e 75% nos dois últimos períodos.

O paciente 3 (Fig 3C e S4 Fig ), que teve a doença progressiva após o tratamento inicial com ALIMTA + carboplatina, mostrou remissão parcial durante o primeiro período, mas teve a doença progressiva durante o segundo período do tratamento com erlotinib. Este paciente morreu um mês depois. O número de e-CTC diminuiu 69-10 /mL de sangue no primeiro período, e aumentou para 25 e 19 /mL de sangue nos dois últimos períodos. O número de E + CTC mostrou uma mudança desordenada de 8 para 23 /mL de sangue no primeiro período, e depois diminuiu para 7 /mL de sangue e indetectável nos dois últimos períodos. A percentagem de E-CTC foi mantida a um nível elevado (90%) no início, diminuiu para 30%, juntamente com uma resposta a remissão parcial da doença e, em seguida, aumentada para 78% e 100%, após a progressão da doença.

o paciente 4 (Fig 3D e S5 Fig), que teve a doença progressiva no diagnóstico inicial, mostrou remissão parcial, a doença estável, doença progressiva e doença estável a partir do primeiro ao quarto período do tratamento com erlotinib. O número de e-CTC mostrou uma alteração flutuante a partir de 23, 17, 6, 17 a 5 /mL de sangue, enquanto que E + CTC foram quase sem serem detectados em todos os momentos. O percentual de E-CTCs foi mantida perto de 100% em todos os momentos.

Follow-up

Todos os pacientes tiveram registros de acompanhamento de 10 a 20 meses, dependendo do tempo de amostragem. Dezessete pacientes morreu devido a uma metástase distante (fases I-II: 3 casos; fase III: 3 casos; estágio IV: 11 casos). Nos 17 casos, 4 pacientes foram excluídos da análise estatística, pois CTCs não foram detectadas. Em 41 pacientes com CTCs detectáveis, 9 dos 16 pacientes com maioria absoluta dos E-CTCs no sangue (

r Art 95%) e 8 de 25 pacientes com

r

≤ 95% morreu. A análise de Kaplan-Meier indicou que os pacientes com

r Art 95% tiveram tempo de sobrevivência significativamente menor do que aqueles com

r

≤ 95% (

p

= 0,041, Fig 4).

Caracterização de CTCs no stemness

Para explorar a capacidade dos CTC seguintes modelo CSC, determinou-se a expressão de CXCR4 e CD133 em e e e +-CTC, respectivamente, em 10 pacientes. CXCR4 foi detectado em 10/08 dos pacientes dentro de um subgrupo de E-CTC, ao passo que foi detectado em apenas 3/10 dos pacientes dentro de um subgrupo de E + CTC. Ambos CXCR4 e CD133 foram detectados em 10/06 dos pacientes dentro de um subgrupo de E-CTC, ao passo que foi detectada apenas em 1/10 dos pacientes dentro de um subgrupo E + CTC. CXCR4 + CTCs e CXCR4 + CD133 + CTCs foram detectados a ser significativamente maior em E-CTCs que em E + CTCs (

p

= 0,021 e 0,005, respectivamente, Fig 5A). Além disso, a expressão de CD133 verificou-se ser significativamente mais elevada em CXCR + E-CTC do que em outros tipos de CTC (

P

= 0,029, Fig 5B). Curiosamente, nos mesmos indivíduos, o número de CTC com a expressão de CXCR4 e /ou CD133 foi sempre mais dentro do subgrupo de E-CTC do que a de E + CTC. Nenhum paciente poderia ser encontrado que a expressão de CXCR4 e /ou CD133 foram detectados apenas em E + CTCs, mas não em E-CTCs.

Distribuição de (A) o número de CXCR4 + e CXCR4 + CD133 + células e ( B) as taxas de detecção de positividade de CXCR4 + CD133 + células em CTCs classificadas pela expressão de EpCAM em 10 pacientes com NSCLC.

Discussão

CTCs pode ser usado como um marcador de prognóstico [17 , 18]. Estudo No entanto, o pequeno número e baixa concentração de CTC tem limitado da biologia dos CTC [9, 19]. Devido à heterogeneidade dos CTC, é difícil para capturar todos os tipos de CTC por métodos à base de EpCAM. Uma estratégia mais razoável é a esgotar leucócitos. Utilizando o nosso método melhorado, a pureza dos CTC foi aumentada em 10 vezes em experiências enriquecidas, e até 50 vezes mais elevadas em amostras de sangue, em comparação com um método anteriormente apresentados com base em nanobeads magnéticos [16]. Usando este método, o valor médio da pureza dos CTC poderia ser de até 10% em experiências spiking e 10,6% nas amostras de sangue de pacientes, o que também suportados sua ulterior aplicação na análise molecular. Este método é comparável para a detecção de CTC com e sem a expressão de EpCAM. Nos resultados, 36,4% (para E + CTCs) e 81,8% (para E-CTCs) dos pacientes tinham doença em estágio IV. Estes dados são consistentes com os resultados publicados que E + CTC foram detectadas em apenas 23 ~ 32% de doentes com NSCLC avançados por CellSearch e 80% daqueles pela estratégia de isolamento tamanho [4, 7]. Este método é específico para a identificação dos CTC com e sem expressão de EpCAM. Ambos E + e E-CTC foram detectados a ser muito menor nas amostras de sangue de voluntários saudáveis ​​em relação às dos doentes, o que também era consistente com um estudo publicado anteriormente [20]. Embora E + e E-CTC não foram detectadas em cinco pacientes, é possível que a enumeração dos CTC foi menor do que os valores de corte ou ausente de marcadores específicos adicionais para identificar as células tumorais heterogéneas em NSCLC [21, 22].

no presente estudo, foi investigada a distribuição dos CTC com e sem a expressão de EpCAM em pacientes com NSCLC por um método melhorado. Nos resultados, E + e E-CTCs foram detectados a ser significativamente diferentes apenas no estágio IV pacientes, embora eles não estavam em estágio I-II e III pacientes. Além disso, o percentual de pacientes com a maioria absoluta dos E-CTCs no sangue aumentou significativamente de fase I-II a IV. Além disso, os resultados por análise de Kaplan-Meier indicou que os pacientes com a maioria absoluta dos E-CTCs no sangue tiveram uma sobrevida menor do que aqueles pacientes com uma baixa percentagem de E-CTCs. Estes resultados sugerem que a percentagem de E-CTC poderia ser utilizada para prever o prognóstico de doentes com NSCLC.

Actualmente, o valor de diagnóstico da CTC com e sem a expressão de EpCAM em NSCLC não é clara. Neste estudo, realizamos o monitoramento longitudinal em 4 pacientes índice durante a terapia adjuvante. A percentagem de E-CTC foi encontrada para ser mais preciso do que o número de E + CTC na avaliação do efeito terapêutico na quimioterapia e terapia-alvo. Além disso, um baixo número de E-CTCs foram associados com uma resposta positiva em pacientes. Estes resultados sugerem que a percentagem de E-CTC pode ter potencial como um marcador na monitorização e previsão do efeito terapêutico em NSCLC. É possível que as células não cancerosas podem ser incluídas no E-CTCs [9], e nós também não encontrou qualquer valor clínico na simples enumeração de E-CTCs. Este fenômeno também foi consistente com os resultados publicados recentemente sobre a quimioterapia no cancro da mama [23]. No entanto, os nossos dados indicam que uma elevada percentagem de E-CTCs podem implicar uma capacidade reforçada de células tumorais em invasão e proliferação.

Para explorar a biologia acima de CTCs, que caracterizou a stemness de CTCs com diferentes perfis de expressão de EpCAM na sequência dos resultados do nosso trabalho anterior [13]. Estudos anteriores sugeriram que a combinação de CXCR4 e CD133 pode ser utilizado como marcador de CSC [24, 25]. Nos nossos resultados, CXCR4 + CD133 + CTC foram detectados a ser significativamente mais prevalente em E-CTC do que aqueles em E + CTC, e o número de E-CTC com a expressão de CXCR4 e /ou CD133 foi sempre mais do que o de E + CTCs em nos mesmos indivíduos que sugeriam que a E-CTCs pareceu ser mais stem-like. Este resultado pode explicar, pelo menos em parte, o fraco resultado nos pacientes com E-CTCs esmagadora no sangue, em certa medida. Além disso, o CXCR4 foi regulado para cima durante a TGF-β EMT induzida. A relação de potencial entre o mais-tronco como E-CTCs e EMT deve ser investigado. Apesar de um número relativamente pequeno de pacientes foram utilizados neste estudo, esses resultados contribuir para uma melhor compreensão da relação entre a CSC e EMT em CTC. A pesquisa adicional com um grande tamanho da amostra e identificação EMT são necessários para esclarecer o status desse tipo de CTCs e sua função na progressão do tumor de NSCLC.

Conclusão

Com base em uma técnica de CTC enriquecimento pelo esgotamento dos leucócitos com bi-anticorpos, este estudo avaliou o valor clínico de CTCs com e sem expressão EpCAM em NSCLC. Os nossos dados sugerem que a percentagem de E-CTC aumentou significativamente de fase I-II a IV e poderia ser utilizado para avaliar a metástases distantes, efeito terapêutico e prognóstico de pacientes em NSCLC. Além disso, E-CTC parecia ser mais do que como tronco-E + CTC. Estes resultados fornecem a primeira evidência para o potencial de aplicação clínica da E-CTCs em NSCLC.

Informações de Apoio

S1 Fig. A análise FACS representante no CTCs nas amostras de sangue de 4 pacientes com NSCLC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s001

(TIF)

S2 Fig. Tomografia Computadorizada (CT) imagens de paciente 1 tratados com gefitinib e, em seguida, ALIMTA (pemetrexeddisodium) + cisplatina

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s002

(TIF)

S3 Fig. CT imagens de paciente 2 tratados com paclitaxel lipossomal + cisplatina e, em seguida, radioterapia + erlotinib

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s003

(TIF)

S4 Fig. CT imagens de paciente 3 tratados com ALIMTA + carboplatina e, em seguida, erlotinib

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s004

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S5 Fig. CT imagens de paciente 4 tratado com erlotinib

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s005

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