Abstract

Introdução

Segmentação mutações ativadoras motorista oncogênicos em adenocarcinoma de pulmão levou a sobrevivência prolongada em pacientes portadores dessas alterações genéticas específicas. O valor prognóstico destas mutações ainda não tenha sido elucidado. A prevalência da mutação não-codificante somática recentemente descoberto na região promotora de

TERT

gene está também a ser validado no câncer de pulmão. O objetivo deste estudo é mostrar a prevalência, a associação com características clinicalpathological e valor prognóstico desses fatores.

Métodos

Em uma coorte de pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) (n = 174, incluindo adenocarcinoma 107 pulmão e carcinoma de células escamosas 67 pulmão),

EGFR

,

KRAS

,

HER2

e

BRAF

foram diretamente seqüenciados em adeoncarcinoma pulmão, fusões ALK foram rastreados usando FISH (fluorescência

in situ

Hibridização).

TERT e região promotora foi sequenciado em todas as amostras de NSCLC 174. Foi avaliada a associação destas mutações somáticas e características clínico-patológicas, bem como fatores prognósticos.

Resultados

EGFR

,

KRAS

,

HER2

,

BRAF

mutação e

ALK

fusão foram mutado em 25,2%, 6,5%, 1,9%, 0,9% e 3,7% dos adenocarcinomas do pulmão. Não

TERT

mutação promotor foi validado por sequenciação inversa lados. adenocarcinoma de pulmão com

EGFR

e

KRAS

mutações não mostrou nenhuma diferença significativa na sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global (OS). Cox multivariada análise revelou que só fase N e

HER2

mutação foram preditores independentes de sobrevida global pior (HR = 1,653, IC 95% 1,219-2,241,

P

= 0,001; HR = 12,344, 95% CI 2,615-58,275,

P

= 0,002).

Conclusões

Temos confirmado que

TERT

mutação promotor pode só existem em uma fração muito pequena do CPNPC. Estes resultados indicam que a divisão em subtipos de adenocarcinoma de pulmão moleculares de acordo com a mutações oncogénicas do controlador não prediz diferença de sobrevivência da doença

citação:. Li C, Hao G, Li Y, Wang S, Chen H, Zhang L , et ai. (2014) Valor prognóstico Análise mutacional e Fatores clínicopatológicos na Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (9): e107276. doi: 10.1371 /journal.pone.0107276

editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de junho de 2014; Aceito: 08 de agosto de 2014; Publicação: 08 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. A folha de resultados do nosso experimento de dados original pode ser encontrada na informação de apoio

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (81302001 para CG Li e 81201649 a BS Sun, http: //www.nsfc.gov.cn), China Pós-Doutorado Science Foundation (2014M550147 a CG Li, https://res.chinapostdoctor.org.cn/BshWeb/index.shtml), Programa chave de Investigação Anti-câncer da Ciência Municipal Tianjin e Tecnologia da Comissão (12ZCDZSY15400 para CL Wang, https://www.tstc.gov.cn/) e do Programa de Key of Application Foundation, Tianjin Municipal de Ciência e Tecnologia da Comissão (12JCYBJC17800 para CL Wang, https://www.tstc.gov .cn /). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das doenças mais devastadoras e a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1]. câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC), que responde por cerca de 85% dos casos de câncer de pulmão, é dividido em subtipos histológicos de adenocarcinoma (ADC), carcinoma de células escamosas (SCC) e carcinoma de grandes células. Adenocarcinoma tornou-se o mais comum subtipo de câncer de pulmão [2]. A taxa de sobrevida em 5 anos de NSCLC continua baixo quanto 15-16%, apesar da melhora do tratamento nas últimas décadas [1], [3]. Melhor compreensão da tumorigênese NSCLC e os fatores associados é necessário prognóstico.

descoberta de mutações ativadoras no domínio da tirosina quinase de

EGFR

levou ao desenvolvimento e ampla utilização de gefetinib e erlotinib, que tem provaram ser eficazes no tratamento de parte dos

EGFR

adenocarcinomas do pulmão mutadas [2], [4]. De acordo com mutações específicas motorista oncogênicos, adenocarcinoma de pulmão é dividido em subtipos moleculares, tais como

EGFR

,

KRAS

,

ALK

,

HER2

,

BRAF

e assim por diante [5], [6]. A maioria destes genes motorista tem medicamentos específicos orientados em uso ou ensaios clínicos. Em comparação com adenocarcinoma, o conhecimento sobre as alterações genéticas do carcinoma de células escamosas do pulmão é limitada. Freqüente mutação, amplificação ou perda de

FGFR1

,

PTEN

,

PIK3CA

,

NFE2L2

,

NRF

foram identificados em estudo genômico abrangente no carcinoma epidermóide de pulmão [7]. Porque o espectro mutacional em grande parte indefinido e baixas frequências desses genes, terapias direcionadas no carcinoma epidermóide de pulmão está ficando para trás e apertado para ensaios clínicos.

Recentemente, estudos de sequenciamento do genoma do câncer humano revelaram mutaitons somáticas no promotor nuclear da telomerase humana transcriptase reversa (

hTERT

)

Gene, que codifica a subunidade catalítica da telomerase [8] – [10].. Ou C228T ou C250T da

hTERT

mutações do promotor elevada atividade transcricional da

gene hTERT

nos ensaios de repórter de luciferase [8]. Os tipos de tumores com frequente

hTERT

mutações do promotor incluídos melanoma (71%), glioma (51%), lipossarcoma mixóide (79%), carcinoma urotelial da bexiga (66%) [8], [9]. Evidências em estudos anteriores sugeriram que

hTERT

mutações do promotor potencialmente atuar como um gene motorista em melanoma. No entanto, a prevalência de

hTERT

mutação promotor em amostras clínicas de câncer de pulmão está ausente nestes estudos. É necessário mostrar a prevalência de

hTERT

mutação promotor em amostras de NSCLC como ações de câncer de pulmão motorista genes com melanoma, tais como

BRAF Comprar e mutado

ARN

[8], [9], [11].

neste estudo, o objetivo foi mostrar as características moleculares e clínico-patológicos abrangentes em NSCLC, bem como o valor prognóstico destas características.

Métodos

pacientes e tecidos

amostras de tumores primários foram obtidos a partir de 174 pacientes submetidos à ressecção pulmonar potencialmente curativa no Hospital do Câncer Tianjin University Medical partir de Janeiro de 2004 a Janeiro de 2008. Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Instituto do Câncer Tianjin University Medical and Hospital. Todos os participantes assinaram termo de consentimento. Os pacientes foram incluídos neste estudo específico com base nos seguintes critérios: eles tinham um diagnóstico patológico de adenocarcinoma de pulmão ou carcinoma de células escamosas, sua amostra de tumor continha um mínimo de células tumorais de 50%, como determinado por patologistas do estudo, eles não receberam quimioterapia neoadjuvante, e eles tinham tecido suficiente para a análise molecular. características clínicas e informações prognóstico foram recolhidos.

isolamento de DNA e análise mutacional

O DNA genômico foram isolados a partir de amostras fixadas em formalina parafina-embedded (FFPE) de acordo com protocolos padrão (TIANquick FFPE Kit DNA, Tiangen Inc, China).

EGFR

(exons 18-22),

HER2

(exão 20),

KRAS

(exons 2 a 3),

BRAF

(exão 15 ) e

TERT e região promotora foram amplificados por PCR usando DNA e directamente sequenciado. A análise de PCR multiplex foi feita com ADN-polimerase rTaq (Toyobo, Osaka, Japão). Os iniciadores utilizados nestas experiências estão listados na Tabela S1. fusões ALK foram rastreados usando FISH com slides FFPE.

A análise estatística

As associações entre mutações e características clínicas e biológicas foram analisados ​​pelo

χ

2

ou teste exato de Fisher . As curvas de sobrevida foram atraídos pelo método de Kaplan-Meier. A Cox riscos proporcionais regressão (modelo para a frente da razão de verossimilhança) foi utilizado para análises de sobrevida multivariada. Todos os dados foram analisados ​​utilizando o Statistical Package for Software Ciências Sociais, versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). O nível de significância de dois lados foi fixado em

P

. 0,05

Resultados

características do paciente

Cento e sete ADC pulmão e 67 SCC pacientes foram incluídos neste estudo, incluindo 105 homens e 69 mulheres (média de 58 anos, variando de 39-77 anos). Havia 109 65 fumadores e não fumadores, o que representa 63% e 37%, respectivamente. O número de pacientes em estágios I-III foi de 57, 46 e 69, respectivamente. Duas amostras foram com estágio indefinido. A informação detalhada é listada na Tabela 1.

EGFR, KRAS, HER2

e

BRAF

Mutation Estado e ALK fusões

Do 107 amostras de adenocarcinoma de pulmão, 25,2% (27/107) dos tumores foram encontrados para abrigar

mutações EGFR

domínio quinase. Entre estes, 17 eram deleções no exão 19 e 6 foram as mudanças de sentido trocado L858R. Outras alterações incluíram um exão 20 de inserção, mutações do exão 20 D807N e T790A, 1 exom 18 R705K mutação. Seis amostras (5,6%) teve um

KRAS

mutação, incluindo cinco mutações G12V e uma mutação missense I36M. Duas amostras abrigavam

HER2

mutação exão 20, incluindo uma inserção 776-779 YVMA e uma mutação S789P. Apenas um

BRAF

mutação sem sentido L588F foi identificada nestas amostras tumorais (Figura 1). fusões de LFA foram detectados em 4 (3,7%) amostras. Porque as mutações de

EGFR, KRAS, HER2, BRAF

, bem como

ALK

fusões foram bem estabelecidos para serem existia no adenocarcinoma de pulmão [5], [12] – [14], estes genes de mutação e de fusão que adenocarcinoma de pulmão ‘unidades’ não foram exibidos em carcinoma de células escamosas do pulmão.

As taxas de mutação de

EGFR, KRAS, HER2

e

BRAF

foram 25,2, 5,6, 1,8 e 0,9%, respectivamente.

5 ‘não codificante mutações região de

TERT

gene em NSCLC

nem C228T nem C250T mutações foi validado em 174 amostras de NSCLC após sequenciação inversa. Estes resultados indicaram que

TERT

mutação promotor só pode existir em uma fração muito pequena das amostras de NSCLC primários.

Análise de Sobrevivência

Pela análise univariada, avançado estadiamento clínico (

P

= 0,018), metástase linfonodo (

P Art 0,001), ≥2 estação de linfonodo metastático (

P Art 0,001), recebeu quimioterapia adjuvante (

P

= 0,004) estiveram associadas recidiva da doença (Tabela 2).

EGFR

e

KRAS

estado de mutação não foram associados a sobrevivência livre de recidiva (

P

= 0,600) ou sobrevida global em adenocarcinoma de pulmão (

P

= 0,873) (Figura 2). Cox multivariada análise passo a passo para a frente (o ajuste para idade, sexo, história de tabagismo, estadiamento clínico, subtipos histológicos e estado mutacional) revelou que apenas linfonodo fase (fase N) e

HER2

mutação foi preditores independentes de sobrevida global mais pobres ( HR 1.653, IC 95% 1,219-2,241;

P

= 0,001; HR 12,344, 95% CI 2,615-58,275;

P

= 0,002). informações mutacional e sobrevivência detalhada é listada na Tabela S2.

EGFR

e

KRAS

estado de mutação não foram associados a sobrevivência livre de recidiva (

P

= 0.600) ou sobrevida global (

P

= 0,873) em adenocarcinoma de pulmão; CD. Linfonodo fase (fase N) foi significativamente associada à sobrevida livre de recidiva (

P

= 0,001) ou a sobrevida global (

P

= 0,001) em NSCLC.

Discussão

NSCLC é uma doença heterogênea, resultado difere mesmo em pacientes com características clínico-patológicas idênticos. Identificação de mutações motorista oncogênicos em adenocarcinoma de pulmão tem muito promoveu o uso clínico e desenvolvimento de medicamentos direcionados [5], [6], [15], [16]. Embora

EGFR

e

KRAS

mutações foram estabelecidos como marcadores preditivos e prognósticos para os pacientes que recebem

EGFR

-TKIs [4], [17], [18], resultados sobre o valor prognóstico destas alterações a nível genômico em pacientes que não receberam

EGFR

-TKIs raramente foram relatadas.

Nós temos uma tela de prevalência de mutações driver conhecido de

EGFR

,

KRAS

,

HER2, BRAF

e

ALK

em uma coorte de 107 pulmão amostra adenocarcinoma com informações de prognóstico completa. O

EGFR

mutação,

KRAS

mutação e

EGFR

/

KRAS

grupos de tipo selvagem, não houve diferença significativa tanto na sobrevida livre de recidiva e sobrevida global No presente estudo. Todos os pacientes incluídos neste estudo não recebeu pequenas drogas moleculares visando

EGFR

. Nossos resultados sugerem que a mutação driver específico de

EGFR

ou

gene KRAS

não prevê vantagem de sobrevivência ou desvantagem quando esses pacientes não receberam terapias-alvo específicos. Na análise multivariada,

HER2

mutação foi identificada como preditor independente de prognóstico desfavorável. Porque somente duas amostras abrigava

HER2

mutação, outro estudo com maior número de amostras são necessários para confirmar este resultado. Com base nesses fatos, podemos concluir que dividir adenocarcinoma de pulmão em subtipos moleculares única prevê a resposta terapêutica, mas não benefício de sobrevivência em pacientes que não receberam essas drogas.

O surgimento de mutações somáticas de

hTERT

gene da região 5 ‘do promotor no melanoma providenciou outro gene motorista candidato promissor para câncer de pulmão. Vários estudos têm identificado frequentes

hTERT

5 ‘do promotor mutações no melanoma [8], [10], gliomas, bem como a partir de taxas relativamente baixas de auto-renovação de tecidos como os lipossarcomas, carcinomas hepatocelulares, carcinomas uroteliais, células escamosas carcinomas da língua e meduloblastomas [9], [19]. Nós exibiu o

hTERT e região 5 ‘do promotor em 174 amostras de NSCLC FFPE para explorar a taxa de mutação e potencial valor prognóstico. Foram identificados somente três mutações C250T das 174 amostras, mas nenhum destes foram validados por sequenciação inversa, o que poderia ser possivelmente causada pelo dano do ADN no processo de fixação em formalina e embebidos em parafina. Estes resultados confirmaram que

mutações do promotor hTERT

5 ‘só podem existir em uma fração muito pequena dos casos de NSCLC.

A limitação do presente estudo devem ser discutidos. A fim de explorar o significado prognóstico, foram utilizadas amostras FFPE que têm informações completas sobrevivência. No entanto, a sensibilidade dos resultados de sequenciação é afectado pela qualidade relativamente baixa de amostras FFPE, em que o ADN é degradada e artificialmente mutado. A taxa de mutação de genes motorista bem conhecidos é menor do que estudos anteriores usando alta qualidade amostras de snap-congelados [20], [21] e as mutações artificiais apareceu em

hTERT

5 região do promotor “. Embora amostras consecutivas com dados completos de sobrevivência não estão sempre disponíveis, o nosso estudo, desde que o espectro de mutações e de associação prognóstico dessas alterações genéticas com a amostra e as técnicas disponíveis.

Em conclusão, nosso trabalho ilustrou o espectro de mutações de

EGFR

,

KRAS

,

HER2, BRAF

e

ALK

no adenocarcinoma de pulmão, bem como confirmou promotor que h

TERT

5 ‘ mutação região raramente ocorreu em amostras de NSCLC. Nós também confirmou que estas mutações motorista não têm valor prognóstico em pacientes de adenocarcinoma de pulmão que não receberam tratamento EGFR TKI e subtipos divididos por estas mutações motorista oncogênicos não prever diferença na sobrevida significativa.

Informações de Apoio

tabela S1. : Lista dos iniciadores utilizados para a amplificação da reação em cadeia da polimerase do gene EGFR, KRAS, HER2 e BRAF

doi:. 10.1371 /journal.pone.0107276.s001

(DOCX)

Tabela S2.

mutacional e informações de sobrevivência de 174 pacientes com NSCLC. Sex, 1 masculino, 2 do sexo feminino; Fumar, 0 não-fumante, fumante 1; caminho, patologia; WT, de tipo selvagem; DEL, exclusão; INS, a inserção; NEG, negativo; . POS, positivo

doi: 10.1371 /journal.pone.0107276.s002

(XLS)