Abstract

A desregulação do sonic hedgehog (Shh) via de sinalização tem sido associado com câncer de células estaminais (CSC) e implicada na iniciação de cancro pancreático. CSCs pancreáticas são células tumorais rara caracterizada pela sua capacidade de auto-renovação, e são responsáveis ​​pela recorrência do tumor acompanhada por resistência às terapias atuais. A letalidade desses tumores pancreáticos incuráveis, agressiva e invasiva continua a ser um desafio clínico assustadora. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da Shh percurso no cancro do pâncreas e para examinar os mecanismos moleculares pelos quais o sulforafano (SFN), um composto ativo em vegetais crucíferos, inibe a capacidade de auto-renovação das CSCs pancreáticos humanos. Curiosamente, demonstramos aqui que a Shh via é altamente activada em CSCs pancreáticas e desempenha um papel importante na manutenção stemness através da regulação da expressão de genes stemness. Devido à necessidade de Hedgehog em câncer pancreático, investigamos se o bloqueio hedgehog pelo SFN poderia ter como alvo a população de células-tronco no câncer de pâncreas. Em um

in vitro

modelo, CSCs pancreáticos humanos esferas derivados foram significativamente inibido por tratamento com SFN, sugerindo o esgotamento clonogênica da CSCs. Curiosamente, SFN inibiu os componentes da via de Shh e a actividade de transcrição Gli. Interferência de sinalização Shh-Gli bloqueou significativamente os efeitos inibidores induzidos por SFN que demonstram a exigência de uma via activa para o crescimento das CSCs pancreáticas. SFN também inibiu alvos a jusante de transcrição Gli suprimindo a expressão de factores de pluripotência manutenção (nanog e Out-4), bem como PDGFRα e Ciclina D1. Além disso, SFN apoptose induzida por inibição da BCL-2 e activação de caspases. Os dados evidenciam o papel essencial de sinalização Shh-Gli em controlar as características de CSCs pancreáticas. Propomos que o cancro pancreático efeitos preventivos de SFN pode resultar da inibição da via de Shh. Assim Sulforaphane potencialmente representa uma alternativa barata, segura e eficaz para a gestão do câncer de pâncreas

Citation:. Rodova M, Fu J, Watkins DN, Srivastava RK, Shankar S (2012) de Sonic Hedgehog sinalização Inibição oferece oportunidades para terapia-alvo por sulforafano em Regulação Pancreatic Cancer Stem Cell auto-renovação. PLoS ONE 7 (9): e46083. doi: 10.1371 /journal.pone.0046083

editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de maio de 2012; Aceito: 27 de agosto de 2012; Publicado: September 28, 2012 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:.. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Competir interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes .

Introdução

o câncer de pâncreas (PC) tem um dos prognósticos mais pobres entre todos os tipos de câncer e taxa de sobrevida em 5 anos global de 3% [1], [2], [3]. Infelizmente, na maior parte dos casos de cancro pancreático não é operável no momento do diagnóstico. Há opções limitadas de tratamento disponíveis para esta doença, porque quimioterapia e rádio-terapias são ineficazes, e doença metastática frequentemente renova a mesmo após a cirurgia [4]. Portanto, há uma necessidade urgente de descobrir novos e eficazes abordagens quimiopreventivos para o cancro pancreático.

câncer de células estaminais /início de tumor células (TICs) têm sido propostas para ser a causa da iniciação do câncer, progressão e falha na quimioterapia várias malignidades humanas, incluindo câncer de pâncreas [5], [6], [7]. A hipótese CSC sugere que só compartimento de células estaminais em tumores é capaz de auto-renovação ilimitada e que a eliminação destas células, em última análise suspender a expansão neoplásica, como células melhor diferenciadas têm limitado a capacidade mitogénica e não vai contribuir para o crescimento do tumor a longo prazo . Portanto, é imperativo para conceber novas estratégias baseadas em uma melhor compreensão das vias de sinalização que controlam aspectos de auto-renovação e sobrevivência em CSCs, a fim de identificar novos alvos terapêuticos nestas células. Assim, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visam especificamente as CSCs pancreáticas podem ser eficazes na erradicação de tumores e na redução do risco de recidiva e metástase.

A sobre-regulação da via de sonic hedgehog têm sido demonstrados em CSCs, que a progressão tumoral, incluindo a migração , invasão e metástase. actividade inapropriada da via de sinalização Hh também tem sido associada a tipos de tumores que surgem esporadicamente ou em indivíduos geneticamente predispostos [8], [9]. A via Shh é um mediador precoce e tardia de desenvolvimento de neoplasias em cancros epiteliais. A activação da sinalização de Shh parece preceder a transformação de células estaminais tecido pancreático para células estaminais cancerígenas pancreáticas, com o factor de transcrição Gli funcionando como um mediador de sinais ambientais e na progressão da CSCs pancreáticas em células tumorais metastáticas. sinalização Shh é iniciado pela ligação do péptido Shh secretado para a proteína transmembranar 12- extensão Patched (Ptch), resultando em perda de actividade Ptch e consequente estabilização pós-transcricional e fosforilação da proteína transmembranar Smoothened 7-extensão (Smo), um membro da receptores serpentina [10], [11]. Como um resultado, a expressão de genes alvo HH é inicializado por meio de activação pós-tradução da família de factores de transcrição Gli de dedos de zinco [12]. A família é uma Gli do gene alvo induziu consistentemente sempre que a via de Shh é activado, fazendo com que este transcrito de um marcador fiável da actividade de sinalização tanto Shh fisiológico e patológico. Ativação da via de sinalização Shh está envolvido na regulação da proliferação das CSCs pancreáticas. Assim, através da segmentação das vias de sinalização que são activadas de forma aberrante e de importância para a manutenção de células estaminais cancro pode levar ao desenvolvimento de novos regimes de tratamento para o cancro do pâncreas, através da eliminação de CSCs com cancro pancreático [13], [14].

Os estudos epidemiológicos têm sugerido que aumentam os riscos de câncer de pâncreas estão associados com o tabaco, obesidade e alto consumo de gordura, peixe, carne de porco ou carne, e que diminuiu os riscos estão associados com o consumo de vegetais crucíferos. Um grupo importante de agentes que têm esta propriedade são os compostos organo tais como isotiocianatos (ITC), abundantes em vegetais crucíferos cujo consumo tem mostrado epidemiologicamente uma ligação inversa com câncer pancreático. ITC têm mostrado exibir várias actividades quimioprotectores potenciais em modelos celulares e animais [15], [16], [17], [18]. Foi anteriormente demonstrado que a administração oral de sulforafano inibiu o crescimento de células PC-3 implantados ortotopicamente na próstata de ratos sem pêlo através da indução de apoptose e inibição da proliferação de células de tumor, metástase e angiogénese [19]. Nós também demonstraram recentemente que SFN sozinho e em combinação com a quercetina inibe o crescimento de células-tronco do câncer de pâncreas derivados de linhas celulares de cancro do pâncreas

in vitro

através da regulação de proteínas FOXO [20]. Assim, SFN é uma grande promessa para o desenvolvimento como um agente quimiopreventivo /terapêutico. Apesar destes constatação, não há estudos que demonstram a regulação dos CSCs do pâncreas por SFN, e se SFN pode inibir Shh percurso.

Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da via Sonic hedgehog no pâncreas câncer e para examinar os mecanismos moleculares pelos quais o sulforafano (SFN), um composto ativo em vegetais crucíferos, inibe a capacidade de auto-renovação das CSCs pancreáticas. O mecanismo molecular sublinhada em exibindo este efeito foi através da inibição da via de sinalização de hedgehog sónico ao nível da transcrição Gli, proliferação de células estaminais e as características de indução de apoptose. Estes dados sugerem que o SFN pode ser um agente benéfico para a prevenção e tratamento do cancro pancreático. Tal informação não só irá permitir que o desenho racional de estratégias baseadas no SFN para a prevenção e /ou tratamento de câncer pancreático, mas também poderia facilitar o desenvolvimento de protocolos de-driven mecanismo para efeitos clínicos ideais.

Resultados

a expressão de genes da via de sinalização sonic hedgehog em CSCs pancreático

The Hedgehog (Hh) via de sinalização é essencial para o desenvolvimento de tecidos e órgãos [8]. No entanto, a activação aberrante de sonic hedgehog (Shh) via de sinalização desempenha um papel importante na tumorigênese e progressão de vários tumores [8], [9]. Para avaliar a possibilidade de que a sinalização de Hh é activo nos CSCs pancreáticos humanos comparou-se a expressão do mRNA de vários componentes da via de Shh no pâncreas humano CSC (PanCSC) para células humanas pancreáticas normais ductais epiteliais (HPNE) e células estaminais pancreáticas humanas normais ( HNPSC), em uma

in vitro

modelo de cultura de células e como quantificado por qRT-PCR. Como mostrado na Fig. 1.A-C, observou-se uma expressão robusta de componentes-chave da via Shh-Gli na CSC pâncreas, em comparação com as suas peças normais de contador. A expressão da proteína destes componentes foi ainda confirmada por transferência de Western, como mostrado na Fig. 1.D. Curiosamente, demonstramos aqui que a via hedgehog Sonic está altamente activado em CSCs pancreáticas, sugerindo que a sinalização de Shh-Gli hiperactivo podem regular a expressão de genes em stemness CSCs pancreáticas e desempenhar um papel na proliferação celular e na progressão da CSCs pancreáticas.

(a-C), a expressão relativa de vários componentes da via de Shh foi quantificada nas células humanas do cancro do pâncreas estaminais (PanCSC), as células estaminais normais pancreáticos humanos (HNPSC) e as células pancreáticas humanas normais epiteliais do ducto (HPNE). A expressão de genes Shh foi quantificada utilizando reacção em cadeia da polimerase transcriptase reversa ensaio em tempo real quantitativa (Q-RT-PCR), e normalizada para a expressão de GAPDH. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e foram calculados com base na ΔΔ

C t

método. Os dados representam SD ± média. %, E $ = significativamente diferente do controlo, P 0,05. (D), de imunotransferência de Gli1 /2, Smo e β-actina das células humanas do cancro do pâncreas estaminais (PanCSC), as células estaminais normais pancreáticos humanos (HNPSC) e as células normais epiteliais do ducto pancreático humano (HPNE).

o sulforafano inibe a via de sinalização hedgehog em CSCs pancreáticas

in vitro

Estamos, portanto, procurou examinar os efeitos do SFN na expressão do receptor de Shh (Smothened) e atuadores (GLI1 e Gli2) por qRT-PCR em CSCs pancreáticos humanos. Como pode ser visto na (Fig. 2.A-C), SFN inibiu a expressão de Smo, Gli1 e Gli2. Desde que nós temos mostrado previamente a ativação da via Shh em um painel de linhas celulares pancreáticas humanas [21], nós também procurou examinar os efeitos do SFN na expressão do receptor de Shh (Smothened) e atuadores (GLI1 e Gli2) por qRT-PCR em células de câncer de pâncreas ASPC e PANC-1. Como mostrado na Fig. 3, SFN inibiu a expressão de Smo, Gli1 e Gli2 nestas linhas celulares, bem como, sugerindo que o SFN podem inibir a activação da sinalização de Shh no cancro pancreático.

(A-C), a inibição de componentes de sónica via hedgehog. CSCs pancreático foram tratados com sulforafano (0-20 uM), durante 24 h. A expressão de Gli1, Gli2 e Smo foi medida por qRT-PCR e normalizada para a expressão de GAPDH. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e foram calculados com base na ΔΔ

C t

método. Os dados representam SD ± média. *, @ E $ = significativamente diferente do controlo, P 0,05; (D), de imunotransferência de Gli1 /2, Smo e β-actina de células estaminais humanas do cancro do pâncreas (PanCSC) tratada com sulforafano (0-20 uM).

(A-B), Inibição de componentes da via sonic hedgehog. ASPC1 e PANC1 foram tratados com sulforafano (0-20 uM), durante 24 h. A expressão de Gli1, Gli2 e Smo foi medida por qRT-PCR e normalizada para a expressão de GAPDH. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e foram calculados com base na ΔΔ

C t

método. Os dados representam SD ± média. $, @ E = Significativamente diferente do controlo, P 0,05.

Além disso, uma vez que a presença de expressão Gli nuclear é indicativo de sinalização de Hh activa, foram examinados os efeitos de SFN na translocação nuclear de factores de transcrição Gli usando imunocitoquímica (ICC). CSCs pancreático foram tratados com SFN (0-20 uM), durante 24 h. As células foram então coradas com anticorpos anti-Gli e o anticorpo Gli2 (fluorescência verde) e DAPI (fluorescência vermelha). imagens integradas são mostradas, que indicam coloração amarelo-laranja de Gli 1 e Gli2 localizado no núcleo devido à fusão da fluorescência verde e vermelho. Como mostrado na Fig. 4A, SFN inibiu a translocação nuclear de Gli1 Gli2 e, tal como medido pela CCI. Estes dados portanto, sugerem que o SFN inibe a via hedgehog sónica ao nível de activação Gli.

(a), a translocação nuclear de Gli1 e Gli2, foi medida por imunocitoquímica. CSCs pancreático foram tratados com sulforafano (0-20 uM), durante 24 h. As células foram então coradas com anticorpos anti-Gli e o anticorpo Gli2 (fluorescência verde) e DAPI (fluorescência vermelha). imagens fundidas são mostradas, que indicam coloração amarelo-laranja de Gli 1 e Gli2 localizado no núcleo devido a co-localização de fluorescência verde e vermelho. (B), a inibição da transcrição Gli. CSCs pancreáticas foram transduzidas com GFP Gli-responsive /partículas virais luciferase de pirilampo (pGreen Fire1-Gli com EF1, Sistema Biosciences). Após a transdução, o meio de cultura foi substituído e os CSCs foram tratados com sulforafano (0-20 uM), durante 24 h. actividade repórter Gli-responsivo foi medida utilizando um ensaio de luciferase (Promega Corporation). Os dados representam SD ± média. @,%, E * = significativamente diferente do controlo, P 0,05.

Rompimento de Shh sinalização por Sulforaphane inibe a actividade repórter Gli no pâncreas CSCs

Desde fator de transcrição Gli medeia os efeitos da Shh que desempenham papéis importantes na manutenção stemness e tumorigênese, nós próxima medida a actividade de transcrição Gli (fig. 4B). CSCs pancreáticas foram transduzidas com GFP Gli-responsive /partículas virais luciferase de pirilampo (pGreen Fire1-Gli com EF1, Sistema Biosciences). SFN inibiu a actividade de transcrição Gli de uma forma dependente da dose. Estes dados sugerem que o SFN pode regular carcinogénese pancreática, que é mediado através da inibição da sinalização de Shh.

Inibição de Gli aumenta os efeitos de sulforafano sobre a formação de esferóides no pâncreas CSCs

Além disso, para determinar o efeito do SFN na inibição do sinal Shh sobre a proliferação CSC pancreática e auto-renovação, foi realizado ensaio de formação de esfera. CSCs pancreático foram tratados com SFN (0-20 uM) durante 1 semana e avaliado pela sua capacidade intrínseca para formar esferas primárias em cultura. No final de uma semana, o número total de esferas foram medidas e capacidade para formar esferas secundárias foi ainda avaliado por mais uma semana. CSCs pancreático humano esferas derivadas foram significativamente inibido por tratamento com SFN, sugerindo o esgotamento clonogénicas do CSCs (Fig. 5A).

(A), os efeitos inibidores dos SFN sobre a viabilidade do esferóide CSC. CSCs pancreáticos foram inoculadas como descrito acima e tratadas com SFN (0 e 20 uM). Após 7 e 14 dias, esferóides primários e secundários foram dissociadas e as células viáveis ​​foram contadas por ensaio de azul de tripano. Os dados representam SD ± média. @ E $ = significativamente diferente do controle, P 0,05. (B), do pâncreas CSCs foram transduzidas com quer mexidos ou shRNA Gli1 e Gli2 shRNA vectores lentivirais expressando (pLKO.1), e os lisados ​​celulares foram recolhidos e a análise Western blot foi efectuada utilizando anti-Gli1 ou anticorpo Gli2. (C), a CSC /mexidos e CSC /Gli shRNA foram inoculadas como descrito acima e tratadas com SFN (0-20 uM). Após 7 dias, os esferóides foram recolhidas e as suspensões de células foram preparadas e as células viáveis ​​foram contadas por ensaio de azul de tripano. Os dados representam SD ± média. @,%, E * = significativamente diferente do controlo, P 0,05. (D), Gli shRNA aumenta os efeitos inibitórios do SFN sobre a viabilidade do esferóide CSC. CSC /mexidos e CSC /Gli shRNA foram inoculadas como descrito acima e tratadas com SFN (0 e 20 uM). Após 7 dias, esferóides foram fotomicrografados.

Devido à necessidade de Hedgehog sinalização em câncer pancreático, investigamos se o bloqueio do ouriço por sulforafano poderia ter como alvo a população de células-tronco no câncer de pâncreas. Para entender o papel da sinalização de Shh no SFN inibição induzida da proliferação CSC pancreático, buscou-se inibir a sinalização de Shh em CSCs do pâncreas por derrubar o fator de transcrição Gli usando lentiviral transdução mediada de Gli shRNA inibição de ambos os Gli1 e 2 expressão. A expressão de Gli em CSC pancreática foi suprimida em cerca de 100% utilizando as GLI1 e Gli2 shRNAs de segmentação como quantificada por transferência de Western (Fig. 5B). Tal como mostrado na (Fig. 5C-D), a percentagem de capacidade de formação de esfera CSCs pâncreas foi significativamente reduzido em células Gli knock-para baixo em relação às células de controlo. Além disso, a interferência de Shh- Gli sinalização através de lentivírus – silenciamento mediado efeitos inibitórios bloqueou significativamente induzidos SFN demonstram a exigência de um percurso activo para o crescimento de células estaminais do cancro do pâncreas

SFN inibe a expressão de factores de transcrição de pluripotência manutenção.

Temos demonstrado recentemente que expressam as células-tronco do pâncreas da CSC marcadores CD133, CD44, CD24, ESA, expressam altos níveis de fatores de pluripotência manutenção, e genes de resistência a drogas MDR1 e ABCG2 em comparação com células pancreáticas normais e células de câncer de pâncreas [22]. Nós, portanto, caracterizou os CSCs isoladas de tumores pancreáticos humanos por cytometery fluxo utilizado no presente estudo. Tal como mostrado na (Fig. 6A-D), do pâncreas CSCs expressam marcadores de células estaminais CD44, ESA, CD133 e CD24. Curiosamente, pâncreas CD44

+ ESA

+ CD133

+ CD24

+ CSCs também expressou CK19 (câncer pancreático marcador epitelial específica) e os genes de resistência a drogas ABCG2 (Fig. 6E-F).

(A-D), a expressão de marcadores de células estaminais pancreáticas. Citometria de fluxo e pâncreas CSCs expressando foi realizada utilizando marcadores de células-tronco CD44 -PE, ESA-PerCP, CD133-APC, CD24-FITC e de controlos adequados. (E-F), a expressão de marcadores epiteliais pancreáticas e genes de resistência a drogas. análise de citometria de fluxo de pâncreas CD44

+ ESA

+ CD133

+ CD24

+ CSCs também expressou CK19-PE e ABCG2-PE, respectivamente.

Nanog é essencial para pluripotência, juntamente com outros factores como o assinatura ES, tais como OCT4 também são críticos para os CSCs cancros pancreáticos e outros [23], [24]. Eles são aceites genes alvo Hh bem. De facto, os níveis de OCT4 pode induzir displasia epitelial em ratinhos, e tem sido implicado em vários tumores humanos como também regulados por sinalização de Hh-Gli. Estamos, portanto, procurou examinar os efeitos do SFN sobre a expressão destes factores

in vitro

. Tal como mostrado na (Fig. 7A-B), do SFN inibiu a expressão de ARNm de Nanog, e Oct-4 em CSCs pancreáticas. Além disso, tal como foi confirmado por transferência de Western na (Fig. 7C), SFN inibiram a expressão da proteína de Nanog, e Oct-4 em CSCs pancreáticas. Estes dados indicam que a sinalização do Shh pode promover a proliferação CSCs pancreática através maior auto-renovação das células.

(A-B), os efeitos sobre a expressão de SFN de genes alvo Hh nos CSCs pancreáticas. PCR em tempo real (Q-RT-PCR) foi realizada para examinar a expressão de Nanog e Oct4 e os dados foram normalizados com GAPDH. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e foram calculados com base na ΔΔ

C t

método. Os dados representam SD ± média. @ E% = significativamente diferente do controlo, P 0,05. (C), do pâncreas CSCs foram tratados com SFN (0-20 | iM), e os lisados ​​celulares foram recolhidos e a análise Western blot foi efectuada utilizando anti-Nanog, Oct4 ou anticorpo β-actina. (D-E), os efeitos sobre a expressão de SFN de genes alvo Hh envolvidas na proliferação de células nas CSCs pancreáticas. PCR em tempo real (Q-RT-PCR) foi realizada para examinar a expressão de PDGFRα e Ciclina D1, envolvido na manutenção da proliferação foi analisada e normalizados com GAPDH. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e foram calculados com base na ΔΔ

C t

método. Os dados representam SD ± média. @,%, E US $ = significativamente diferente do controle, P 0,05. (F), do pâncreas CSCs foram tratados com SFN (0-20 | iM), e os lisados ​​celulares foram recolhidos e Immunobloted para anti-PDGFRα, ciclina D1 ou anticorpo β-actina.

Hedgehog sinalização por blockadge sulforafano inibe a proliferação celular e induz a apoptose no pâncreas CSCs

a seguir, examinou os efeitos de SFN sobre a expressão de ARNm de genes a jusante de Gli transcrição que estão envolvidos na proliferação celular. Tal como mostrado na (Fig. 7D-E), do SFN inibida alvos a jusante de Gli transcrição de ciclina D1 e PDGFRα em CSCs pancreáticas que são conhecidos genes alvo Hh envolvidos na proliferação. Além disso, a inibição da expressão da proteína de estes objectivos por SFN nos CSCs pâncreas foi confirmada por Western blotting na (fig. 7F). Estes dados sugerem que o SFN pode regular carcinogénese pancreática através da inibição da via de Shh e seus alvos a jusante.

Além disso, conseguimos demonstrar que a apoptose em SFN CSCs pancreáticas induzida por inibição da expressão de Bcl-2 e através da activação de caspase 3 /7 (Fig. 8A-B). A inibição da expressão da proteína de BCL2 e a regulação positiva de caspase-3 clivada, foi confirmada por transferência Western, como mostrado na (Fig. 8C). Além disso, a análise citométrica de fluxo com coloração de PI das células tratadas em SFN (Fig. 8D), descreve que as doses crescentes de SFN aumentada apoptose em CSCs pancreáticas de um modo dependente da dose. Estes dados sugerem que o SFN pode inibir a proliferação celular e induzem a apoptose em CSCs pancreáticas por segmentação Shh via e os seus genes-alvo.

(A), os efeitos do SFN em Bcl-2expression. Q-RT-PCR foi realizada para examinar a expressão de Bcl-2. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e foram calculados com base na ΔΔ

C t

método. Os dados representam SD ± média. @,% E US $ = significativamente diferente do controle, P 0,05. (B) Efeitos de SFN em caspase-3/7 actividade. CSCs pâncreas tratados com SFN (0-20 uM), durante 24 h, e a actividade da caspase-3/7 foi medido de acordo com as instruções do fabricante. Os dados representam SD ± média. @,%, E US $ = significativamente diferente do controle, P 0,05. (C), do pâncreas CSCs foram tratados com SFN (0-20 | iM), e os lisados ​​celulares foram recolhidos e Immunobloted para anti-Bcl-2, caspase 3 clivada ou anticorpo β-actina. (D), os efeitos sobre a apoptose de SFN. CSCs pancreáticas foram tratados com SFN (0-20 mM) durante 48 h, e apoptose foi medida por coloração PI utilizando citometria de fluxo.

Discussão

O câncer de pâncreas torna-se clinicamente aparente no final fases e que resiste a todas as formas de quimioterapia e radioterapia convencional [1], [2]. Temos demonstrado recentemente que CSCs compartilham características moleculares com as células-tronco normais (SCS) e desempenham papéis críticos na resistência aos medicamentos e metástase do câncer. CSCs pancreáticas também demonstram regulação positiva de moléculas importantes em vias de sinalização desenvolvimento, incluindo hedgehog (Shh) via sonora. activação descontrolada da via de Shh tem sido implicada na progressão e manutenção dos adenocarcinomas pancreáticos [25], [26]. a activação da via através de Smo, portanto, pode ocorrer quer por estimulação de proteína Hh ou através da perda de actividade Ptch, como pode ser visto nos cancros esporádicos ou aqueles que surgem no síndrome de predisposição para o cancro familiar, BCNS (síndrome do nevo das células basais, associada com mutação heterozigótica da Ptch humana gene). Ativação da via de sinalização Shh está envolvido na regulação da proliferação das CSCs pancreáticas [27]. Assim, os agentes que inibem a via de Shh tem o potencial para prevenir a progressão da doença e disseminação metastática [28]. Bem como drogas que alvejam seletivamente CSCs oferecer uma maior promessa para a prevenção e terapia do cancro. Este projecto baseia-se na premissa de que o SFN, um composto natural dos vegetais crucíferos, pode ser usado para a prevenção e /ou tratamento de cancro pancreático humano. Assim, o principal objetivo do presente estudo foi investigar o papel da via sonic hedgehog no câncer de pâncreas e examinar os mecanismos moleculares pelos quais o sulforafano inibe características CSC pancreáticas, e avaliar seu potencial quimiopreventivo /terapêutica contra o câncer de pâncreas, visando CSCs.

SFN é um isotiocianato de ocorrência natural com atividade quimiopreventiva promissora [29]. Estudos epidemiológicos têm mostrado que pessoas que comem vegetais crucíferos têm menor incidência de câncer de pâncreas e outros tipos de câncer. Teste com animais demonstraram que a alimentação do SFN reduziu a frequência, tamanho e número de tumores de diferentes origens. Foi bem e rapidamente absorvido e exibia uma biodisponibilidade absoluta de 82% [30]. É uma enzima de indutor de fase 2 [31], e inibe o benzo [a] pireno-formação de aductos de ADN e ADN-1,6-dinitropyrene. Actua como um antioxidante, anti-proliferativo, anti-tumoral, e agente anti-angiogénico, e, assim, um candidato novo para a quimioprevenção [19], [32], [33], [34]. Alguns estudos recentes sobre as células estaminais do cancro do pâncreas derivadas de linhas de células humanas têm sido relatados, onde eles têm mostrado que SFN pode inibir o seu crescimento, através da inibição de NFKB [35]. Estes estudos sugerem fortemente que o SFN é capaz de modular a expressão de genes que se sabe desempenhar um papel no processo de carcinogénese e, portanto, pode ser um potencial agente capaz de quimioprevenção contra o cancro pancreático. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a mostrar que o sulforafano podem inibir o crescimento de CSCs pancreáticas primárias derivadas de tumores humanos

in vitro

através da inibição da via hedgehog Sonic e são, portanto, consideradas como muito romance.

no presente estudo, nós demonstramos pela primeira vez, que o agente de prevenção de cancro do SFN inibe a expressão de componentes da via de Shh nos CSCs pancreáticos humanos. SFN inibiu a expressão da molécula de receptor de Smo, bem como efectores Gli 1 e 2, sugerindo que o significado clínico de Shh via na progressão do cancro pancreático. A activação forçada de expressão de Shh ou a inibição da Gli1 mais Gli2 por shRNA bloqueou os efeitos inibidores de SFN, sugerindo que os efeitos do SFN são mediadas através da inibição da via de Shh. SFN inibe a capacidade de auto-renovação das CSCs pancreáticas humanas inibindo pluripotência manutenção de fatores e Shh percurso. Especificamente, SFN inibe a capacidade de auto-renovação das CSCs pancreáticos através da inibição da expressão de factores de pluripotência manutenção de transcrição (nanog e Out-4), os componentes de Shh via, e induz a apoptose através da inibição da proteína Bcl-2, ciclina D2, e activação de caspases -3 e 7. Tomados em conjunto os nossos estudos atuais sugerem fortemente que SFN é um inibidor biológica potente de carcinogênese pancreático humano, reduzindo sua proliferação e atividades invasivas. Estes estudos levanta a perspectiva de que o sulforafano pode ser um agente benéfico para a prevenção e /ou tratamento de câncer de pâncreas por CSCs de segmentação.

Uma vez que as células CSCs /progenitoras desempenham papéis importantes na iniciação do câncer, progressão, recorrência e resistência às drogas , inibição do crescimento do CSC e da sua capacidade de auto-renovação pelo sulforafano pode ser significativo para a gestão do câncer de pâncreas e foi recentemente revisto em vários trabalhos como uma estratégia quimiopreventivo de agentes dietéticos para alvejar as células-tronco do câncer [36], [37]. A elucidação do mecanismo (s) para a actividade anti-proliferativa de SFN é crítico para a avaliação global para a sua potencial utilidade clínica. Tais informações não só irá permitir desenho racional de sulforafano, estratégias baseadas para a prevenção e /ou tratamento de câncer pancreático, mas também poderia facilitar o desenvolvimento de protocolos de-driven mecanismo para efeitos clínicos ideais.

Conclusões

demonstramos aqui pela primeira vez, que o SFN inibiu a capacidade de auto-renovação das CSCs pancreáticos isolados a partir de tumores primários humanos e inibe características CSC pancreáticas. Os efeitos inibitórios do SFN são mediadas através da inibição da via de Shh. SFN inibiu a expressão de factores de transcrição (Nanog e Oct-4), que são necessários para a manutenção da pluripotência das células estaminais. SFN potente elimina as características CSCs pancreáticas, afetando clonogenecity, formação esferóide juntamente com sinalização envolvidos na resistência a apoptose e proliferação. Assim, a regulação da via de sinalização do Shh em CSCs por sulforafano agente não-tóxico, pode ser considerado como uma nova estratégia para o tratamento e /ou prevenção do cancro do pâncreas. Desde sinalização Shh aberrante ocorre na tumorigênese de pâncreas, terapêuticas que visam Shh via pode melhorar os resultados dos pacientes com câncer pancreático, visando CSCs e também facilitar o desenvolvimento de protocolos de-driven mecanismo para efeitos clínicos ideais.

Materiais e Métodos

Reagentes

Os anticorpos contra GAPDH e Gli foram comprados da Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA). SFN foram adquiridos da LKT Laboratories, Inc. (St. Paul, MN). quimiluminescência melhorada (ECL) reagentes de detecção de Western blot foram de Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). Todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

cultura celular

células estaminais normais pancreáticos humanos (HPSC) e células estaminais do cancro pancreático humano (CD133

+ /CD44

+ /CD24

+ /ESA

+) foram obtidas a partir Celprogen Inc. (San Pedro, CA). Eles foram isolados a partir de tumores primários e foram descritos anteriormente [38]. Estes CSCs consistir de uma população de pâncreas grandes quantidades de células-tronco do cancro, e, portanto, não pode ser considerado como uma linha de células. Os CSCs foram cultivadas em DMEM suplementado com 1% de suplemento de N2 (Invitrogen), 2% B27 Suplemento (Invitrogen), 20 ng /ml de factor de crescimento de plaquetas humano (Sigma-Aldrich), 100 do factor de crescimento epidérmico ng /ml (Invitrogen) e 1 % de antibiótico-antimicótico (Invitrogen) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2. células normais pancreáticas humanas ductal epiteliais (HPNE) foram obtidos a partir

Lonza, Clontetics e mantidas em DMEM suplementado com kit growth factor bala.

ensaios Tumor esferóide ensaio

Spheroid formando foram realizados como descrito noutro local [22], [39].