Abstract

Durante a progressão do câncer, as aberrações cromossômicas específicas surgir que pode determinar o escopo da doença e podem ser usados ​​como marcadores preditivos ou prognósticos. A detecção de amplificações de genes específicos ou supressões nas células transmitidas pelo sangue ou tumores disseminados únicos que podem dar origem ao desenvolvimento de metástases é de grande interesse clínico, mas tecnicamente desafiador. Neste estudo, nós apresentamos um método para de alta resolução análise genômica quantitativa de células individuais. As células foram isolados sob controlo microscópica permanente seguido de alta fidelidade amplificação totalidade do seu genoma e análises subsequentes com multa azulejos array CGH e qPCR. O ensaio foi aplicado a células cancerosas da mama individuais para analisar região cromossómica centrado pela

EGFR

gene relevante terapêutico. Este método permite a análise quantitativa precisa de variações no número de cópias em diagnósticos de células únicas

Citation:. Hannemann J, Meyer-Staeckling S, Kemming D, Alpers I, Joosse SA, Pospisil H, et al. (2011) Quantitative alta resolução análise genômica de células cancerosas único. PLoS ONE 6 (11): e26362. doi: 10.1371 /journal.pone.0026362

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 17 Agosto, 2011; Aceito: 25 de setembro de 2011; Publicado: November 30, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Hannemann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF FKZ: 01ES0724, https://www.bmbf.de/de/1398.php). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Durante a formação e progressão de cancro, populações de células com aberrações genéticas distintas surgem que representam entidades clínicas exclusivas que abrigam alvos terapêuticos específicos [1], [2]. Um exemplo proeminente é o locus do gene do receptor do factor de crescimento epidérmico (

EGFR

), que é um jogador-chave na biologia do tumor e um alvo importante para a terapia do cancro individualizado. copiar o DNA números para este único locus determinar significativamente o fenótipo das células cancerosas e são indicadores para a resposta do paciente à quimioterapia ou radioterapia [3]. Os anticorpos e os inibidores de moléculas pequenas têm sido desenvolvidos prejudicando a actividade da tirosina-cinase EGFR em vários tipos de tumores [1] – [3]

A maioria dos tumores podem ser completamente removidos por cirurgia e são, por conseguinte, disponível para a amostragem repetido para monitorizar qualquer um dos tratamentos. resposta ou alterações induzidas pelo tratamento na aberrações genómicos ou a progressão da doença, respectivamente. Recentemente, estes processos cruciais pode ser avaliada através da detecção de células cancerosas transportados pelo sangue ou células tumorais disseminadas (CDT) na medula óssea, como órgão homing proeminente e importante local de metástases evidentes em pacientes com cancro. A análise molecular destas células pode revelar informação única para adaptar as terapias prevenção da progressão metastático [4], [5].

Portanto, foi desenvolvida uma abordagem de uma alta resolução análise genética quantitativa fiável de células tumorais individuais isolados no exemplo do

gene EGFR

. Após o enriquecimento, as células foram isoladas por micromanipulação e subsequente amplificação de toda genoma linear foi realizada. A avaliação deste processo tem sido feito por fine-azulejos array CGH e PCR quantitativa, a fim de determinar com precisão a amplitude e extensão do

EGFR

amplicon nas células tumorais individuais.

Resultados

Micromanipulação e amplificação do genoma de células individuais

O mamário humano linha celular de adenocarcinoma de MDA-MB-468 foi seleccionado como modelo adequado para avaliação método, uma vez que abriga um

EGFR e amplificação

mostra forte sobre-expressão de EGFR, bem como exibe um /comprometida fenótipo de células progenitoras stemness [6], [7]. No entanto, o nível de amplificação varia entre células. Para a amplificação do genoma completo (WGA), as células não fixas ou fixas ligeiramente foram recolhidas a partir da superfície do vidro utilizando um micromanipulador equipado com um capilar desenhado para os nossos requisitos específicos. As células foram transferidos em meio aquoso circundante para um stick C

18-silano-revestido de vidro transportando um local de tampão de lise celular completa seca (ver métodos on-line). O lisado de células na vara de vidro foi directamente transferido para um tubo de reacção já preparada com o tampão de amostra para WGA para evitar qualquer perda de material genómico. O procedimento baseia-se na amplificação de vários deslocamento através da utilização de hexâmeros aleatórios e a revisão de ADN polimerase phi29 para assegurar a amplificação linear [8]. Uma única célula proporcionou na 2,04-2,96 ug de ADN PCR-amplif icável (média: 2,42 jig, SD 0,26), o que é superior aos resultados previamente descritos [9]

eficiência de transferência de micromanipulação e fidelidade do WGA. de uma única célula, incluindo o

EGFR

lócus de aproximadamente 4,5 MB foram validados com microssatélites PCR. loci microssatélites foram adaptados a partir Tidow et al. [10] e detalhada informação é fornecida como informação complementar (Tabela S1, S2). Todos os loci microssatélites pôde ser verificada.

Descrição do amplicon EGFR nas células individuais por matriz de telha fina CGH

Para controlar a amplificação linear das sequências de ADN pelo WGA e investigar a estrutura do

EGFR

amplicon, analisamos a região abrigar o

EGFR

gene por uma alta resolução de duas cores bem-azulejos array CGH (Roche NimbleGen Inc., Madison, WI, EUA). As matrizes de oligonucleotídeos de design personalizado com 15 pb espaçamento sonda mediana cobrir uma sequência genômica de aproximadamente 4,7 Mbp no cromossomo 7p11.2, incluindo o próprio

gene EGFR

, e duas regiões de referência no cromossomo 2 e cromossomo 10 de cerca de 200 comprimento kbp cada [11]. Em geral, estas regiões genómicas de referência mostram aberrações apenas pequenas. Uma curva de correlação comparar as intensidades do sinal entre a hibridação do ADN amplificado obtido a partir de uma única célula em comparação com o ADN genómico obtidos a partir de 500 células indica a fiabilidade da preparação, a etapas de pré-amplificação e hibridação matriz (Figura 1C).

a: parcelas matriz-CGH de DNA genómico de diferentes linhas de células de carcinoma da mama com diferentes

EGFR

número de cópias do gene. b: lotes de matriz-CGH de WGA amplificado de ADN a partir de 500 MDA-MB-468 ou única MDA-MB-468 células (comprado em ATCC), respectivamente. A região do

gene EGFR

é retratado em verde. C: curva de correlação das intensidades de sinal após a hibridização matriz comparar os sinais do ADN a partir de uma única célula MDA-MB-468 para os sinais obtidos a partir do ADN isolado a partir de 500 células MDA-MB-468. Spots representadas em amarelo representam os sinais fora da região do amplicon, enquanto que os pontos indicados pela cor azul representam os sinais obtidos pela região amplicon no cromossomo 7.

analisa

Os dados de linhas de células transportando

EGFR

amplificações (MDA-MB-468, A431, e BT20) revelou um fragmento amplificado no cromossomo 7, que consiste em uma parte principal que contém toda a

gene EGFR

. Este elemento central estende-se na direcção telomérica com uma borda afiada na extremidade (figura 1 a, b), o que indicou que o fragmento amplificado é iniciada a uma sequência de ADN distintas. A partir de análise de células isoladas de células MDA-MB-468 visualizadas diferente

EGFR

copiar números, as fronteiras precisas amplicon foram calculados pela função de alisamento do algoritmo Quantsmooth [12]. Uma extensão adicional do fragmento amplificado foi encontrado em células MDA-MB-468 células com maior número de cópias de ganho (32 cópias), que mostra uma extensão de sequência adicional no site centromérico (Figura 1B). Os dados foram validados por PCR quantitativa utilizando SYBR verde-sequências repetitivas Linha1 como um controle de cópias constante intrínseca [13] (Tabela S3 e S4). Esta abordagem permite a quantificação de DNA absoluta reprodutível em uma única célula, o que não foi relatado até agora.

Descrição do amplicon EGFR nas células individuais por qPCR

Nosso próximo objetivo foi o desenvolvimento de um ensaio confiável que pode ajudar decisões de terapia na rotina clínica. Os resultados da fino ladrilhos matriz-CGH têm mostrado que as regiões amplificadas diferem em comprimento dependente do nível de amplificação de toda a região (Figura 1), mas em todos os casos, o

EGFR

é próprio gene incluído. Com base nos níveis de número de cópias determinado por análise de arranjo de fine-azulejos, padronizamos medições qPCR absoluto para o

EGFR

exons 4, 7, 9, 15 e 21 e do 5′-seqüência não codificante do amplicon na posição 54.485.000 em um ensaio de verde SYBR para descrever com precisão

EGFR

amplificações em uma única célula (Tabela S5). A eficiência da PCR variou entre 98,07% e 99,02% (média: 98,78%, DP 0,36). Todos os ensaios apresentaram resultados consistentes, tal como apresentado na figura 2a. Na rotina clínica, em que um ensaio simples e robusta é desejável, a redução destas reacções de PCR ao exão 7 e 9 e encontram-se na extremidade 5′-sequência é suficiente

A:. Os ensaios de PCR quantitativo para diferentes

EGFR

exons em MDA-MB-468 clones b: as curvas de calibração dos ensaios de qPCR para o controle lINE-1 e

EGFR

exons 7 e 9, que indicam que as eficiências de amplificação do controle como bem como o ADN da amostra são semelhantes. C, D: Os resultados da análise de qPCR do exão 7 e 9 em células tumorais individuais a partir de doentes com cancro. C: Boxplots medições de qPCR de 10 células não tumorais de 3 pacientes diferentes. A mediana dos valores medidos nas células que não de tumor é de cerca de 0,9 (linha horizontal em caixas). Valores acima dos limites de confiança de 95% 1,377 e 1,679 são considerados como sendo de ganho do exão 7 e 9, respectivamente. Os únicos pontos pretos representam os valores medidos nas células tumorais de amostras de doentes, de acordo com o quadro que consta do d.

heterogeneidade Genomic em células cancerosas transmitidas pelo sangue e populações DTC de pacientes individuais

para investigar se esta abordagem integrante desenvolvido e optimizado usando células MDA-MB-468, como o modelo é também adequado para as análises de amostras de pacientes, nós testamos amostras de sangue e amostras de medula óssea de pacientes com cancro da mama metastático. As células foram preparadas como previamente descrito [5], [14]. anticorpos para citoqueratina e EpCAM são usadas como marcadores para a detecção de células de cancro ou divulgada transmitidas pelo sangue [5]. Isolamos várias células individuais, coradas com o anticorpo A45B /B3, a partir de diferentes amostras de doentes por micromanipulação e WGA realizada como descrito acima. A WGA produziu no 1,96-2,84 ug de ADN (média: 2,36 jig, 0,25 SD), que é comparável com o rendimento obtido a partir de células de cultura individuais. WGA foi controlada pela utilização de LINHA1 ADN [13], em que produziu uma média de 330 ng (faixa 3 ng-621 ng, 211 SD) do produto de amplificação e permitiu o cálculo preciso do ADN PCR-amplif icável, em cada amostra. A partir de cada amostra de paciente, analisou-se quatro células por qPCR para os exões 7 e 9 (Figura 2) e o-sequência 5′-terminal (dados não mostrados). Os valores de

EGFR

medições em células não tumorais têm uma média de cerca de 0,9 em ambos os ensaios qPCR, que está previsto de modo a reflectir o número normal de cópias (2 diagramas de caixa da figura 2c). Em comparação com estes valores, um terço das células mostraram um elevado

EGFR

amplificação de pelo menos 5 vezes (p 0,0001), e cerca de 25% das amostras apresentaram um ganho de entre 2- e 3-dobra (p 0,001). Os resultados detalhados para as células individuais são mostrados na Figura 2c e 2d. Uma amostra não mostrou consistência entre as medidas em exons 7 e 9. Para esta amostra, foram realizadas medidas adicionais qPCR em exons 4, 15 e 21, que todos mostram um número normal de cópia para o respectivo lugar. Nenhuma única célula tumoral apresentados com um número de cópias do gene “normal”. As células cancerosas sem amplificação do gene de EGFR apresentou valores baixo número de cópias ( 0,7). Estes valores são bastante deverá ser causada pela variação no procedimento WGA do que por artefactos técnicos do qPCR, uma vez que a quantidade de partida calculada de ADN da maioria das amostras aplicadas à reacção de qPCR ( 40 pg) é suficiente para medições fiáveis ​​e é na gama das curvas de calibragem, como mostrado por controle LINHA1 intrínseca (figura 2d).

Discussão

o objectivo do estudo foi o desenvolvimento de um protocolo que permite que a análise quantitativa das genómico única células tumorais. células de tumor primário de origem epitelial são heterogêneos. Especulou-se que apenas uma pequena proporção destas células mostram específica “célula estaminal – como” características e podem dar origem a metástases (revisto em [15]). Estas células podem ser caracterizados por aberrações genómicos específicos que lhes proporcionam vantagens de crescimento e um fenótipo mais agressivo. Esta visão é apoiada por dados de estudos inibidor EGFR, como tal, adenocarcinoma, mutado-EGFR representa uma entidade clínica única necessitando de diagnóstico molecular para orientação terapêutica [1]. Além disso, a geração de clones de células resistentes à terapia com mutações adicionais EGFR ou amplificações durante a terapia, assim como a sobre-expressão e amplificação de genes que regulam a EGFR, e.g. ERFI1, já foram relatados [2], [16] Por isso, a investigação genómico de células tumorais únicas que residir no sangue ou na medula óssea pode ajudar a melhorar o diagnóstico molecular preditivos. Nomeadamente no cancro da mama, a sinalização EGFR parece ser regulada em tumores basais-like (triplo-negativos), especialmente em células com características de células-tronco como [6], [7], [17], [18]. existem dados experimentais preliminares que benetits de EGFR a terapia dirigida por cetuximab ou laptinib estão relacionadas com o nível de amplificação de EGFR [6].

Vários grupos de pesquisa investigaram a possibilidade de analisar uma única célula de tumor no nível molecular [19] , [20]. Demonstrou-se que o genoma de largura de detecção de aberrações através da utilização de matrizes de BAC é possível em leucócitos e células de linhas de células [21]. Além disso, os estudos de Stoecklein et al indicou uma divergência entre a doença primária e sistêmica [19] em pacientes com câncer de esôfago, o que mostra notavelmente a necessidade da análise de células tumorais disseminadas individuais.

Em nosso estudo, escolheu o modelo de linha celular MDA-MB-468 para desenvolver o protocolo devido aos diferentes níveis de amplificação de EGFR estáveis ​​em diferentes clones desta linha celular. Por isso, estas células de alguma forma a imitar heterogénea

In vivo

situação e servir como um controlo bem equilibrada para a determinação de níveis de cópias do gene. Nós podemos mostrar que o ADN amplificado obtido a partir de uma única célula é de qualidade suficiente para ser utilizado em um de alta resolução fina ladrilhos análise matriz. Os perfis de células individuais mostram mais fundo, mas em comparação com os perfis de ADN genómico de a população de células os mesmos fronteiras amplicon pode ser claramente identificado. Genoma análise arrayCGH ampla dá uma excelente visão geral sobre as grandes aberrações do genoma dentro de uma única célula, mas a quantificação das alterações genômicas é limitado. Uma abordagem qPCR não pode ser utilizado para pesquisar novos aberrações, mas permite-nos quantificar conhecida, amplificação potencialmente relevantes clínica e deleções. Pelo uso da técnica de qPCR, diferenças no número de cópias do gene podem ser claramente distinguidas, bem como sobre o nível do ADN genómico de uma associação de células como no ADN amplificado obtido a partir de uma única célula. Poderíamos mostrar que células obtidas de um paciente individual são heterogêneos quanto à sua amplificação do gene EGFR. A análise de apenas uma ou duas células por amostra de sangue pode, portanto, levar a resultados que podem não refletir a verdadeira situação clínica. Análise de tantas células quanto possível, é essencial identificar as células que não pode ser alvo de uma terapia específica, devido à heterogeneidade da população de células. Esta descoberta, se confirmada em uma coorte maior de amostras, poderia fornecer novas perspectivas na biologia da metástase e pode ajudar a explicar o fracasso de terapias-alvo em uma proporção significativa de pacientes

.

O uso de um ensaio de PCR quantitativa exibe um método robusto e de baixo custo que pode ser estabelecida em condições de rotina. Em comparação com o uso de finos-Telha-microarrays, que são mais onerosos e menos robustos sobre a interpretação dos dados, estes métodos poderiam ser utilizados na rotina clínica para a investigação molecular de células individuais. Este método para a primeira vez que exibe uma abordagem simples para quantificar a quantidade de ADN de uma região genómica específica de uma única célula.

Por isso, apresenta-se um método fiável para a determinação quantitativa absoluta de cópias de genes em cancro da única células isoladas a partir de sangue periférico ou na medula óssea de pacientes com cancro. Este método não pode ser limitada a investigar a biologia de disseminar as células tumorais, mas também pode se tornar uma nova ferramenta para a avaliação da genómica de células individuais com uma ampla aplicabilidade em muitas áreas de pesquisa experimental. Além disso, pode prever-se aplicações clínicas futuras. Além da investigação da

gene EGFR

, nosso método pode ser adaptado para avaliar outros alvos moleculares (por exemplo HER2 [21]), e analisar as células cancerosas em outras amostras citológicas, onde o baixo percentual de limites de células tumorais as análises genômicas por métodos atuais.

Materiais e métodos

Ética Declaração

a partir de pacientes que forneceram amostras de sangue, o consentimento informado por escrito foi obtida. A partir de amostras de medula óssea colhidas após autópsia, aprovação por escrito foi dado pelos membros da família. O uso de registros médicos, sangue e medula óssea foi aprovado pela comissão de ética do Conselho Médico da Hamburg (número de referência # 190504).

Linhas Celulares e cultivando

As linhas celulares de cancro da mama MDA -MB-468, BT-20, e MCF-7, bem como a linha celular de carcinoma A431 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em DMEM com soro fetal de vitelo inactivado pelo calor a 5% em 5% de CO

2. As células foram cultivadas até 70% a 80% de confluência antes da colheita e de transferência para as lâminas para a colheita de células individuais.

A imunocitoquímica

células foram incubadas durante 45 minutos com o anticorpo primário A45B /B3 (Micromet, Munique, Alemanha), seguido por um passo de lavagem e uma incubação de 30 minutos com um anticorpo de coelho anti-ratinho de ponte (Z0259, Dako, Glostrup, Dinamarca). A detecção foi realizada com o complexo anticorpo monoclonal de ratinho-APAAP (Dako, Glostrup, Dinamarca) e BCIP /NBT como substracto cromogénico de acordo com o protocolo do fabricante (BioRad, Hercules, CA, EUA).

Material paciente foi obtido a partir do University Medical Center Hamburg-Eppendorf, na Alemanha. Foram utilizadas amostras de medula óssea Arquivo sobre cytospins. Dos pacientes que forneceram amostras de sangue, o consentimento informado por escrito foi obtida. Estas amostras foram obtidas de pacientes submetidos a autópsia e da qual os membros da família tinham dado autorização por escrito para tirar amostras de medula óssea para fins de pesquisa. Este procedimento foi aprovado pelo comitê de ética local. Dos pacientes que forneceram amostras de sangue, o consentimento informado por escrito foi obtida.

Operação de enriquecimento para as células cancerosas transmitidas pelo sangue e DTC

amostras de medula óssea e amostras de sangue periférico foram processados ​​por um Ficoll gradiente de densidade para enriquecer as células mononucleares e células tumorais epiteliais, possivelmente, como previamente descrito [12]. Logo, as amostras de medula óssea foram obtidas a partir da crista ilíaca superior por aspiração com agulha e armazenado em tubos tratados com heparina. As células mononucleares, incluindo células tumorais foram separadas por Ficoll-Hypaque de gradiente de densidade com uma densidade de 1,077 g /ml. 7 × 10

5 células foram cytospun em lâminas de vidro, seco à temperatura ambiente e armazenados a -80 ° C.

Transferência de células individuais

1. Silanização de varas de vidro.

As varas de vidro com um diâmetro de 1,9-2,3 mm foram lavados durante uma hora em 85 ° C numa solução de 10% Neodisher Laboclean FT (Dr. Weigert, Hamburgo, Alemanha). água limpa-HPLC foi utilizada para todos os passos de diluição e de lavagem. Após a secagem, as varas foram influenciados em H

2SO

4 (98%, Merck, Darmstadt, Alemanha) durante uma hora à temperatura ambiente e lavadas em água. As varas foram deixados a secar durante 15 minutos a 110 ° C e, subsequentemente, influenciado em 0,5% em octadecyltrichlorsilane fracção octano (Fluka, Erlangen, Alemanha) durante duas horas. Após incubação em etanol a 96% durante uma hora, os resíduos de etanol e silano foram removidos por lavagem com água exaustivamente e vigorosamente. Sticks pode ser armazenado em local seco e escuro por até oito semanas.

2. O tampão de lise.

O tampão de lise é composta de 0,25% de sarcosina de N-lauroílo, 2 M de tiocianato de guanidina, 0,01 M de citrato de sódio pH 7,0, e 1% de dimetilsulfóxido em água de HPLC-limpo. O tampão foi esterilizada por filtração através de um filtro de 0,2 um PES (VWR, Darmstadt, Alemanha) e armazenado a -20 ° C até à sua utilização.

3. Cole preparação.

Antes da utilização, foi adicionado DTT para o tampão de lise a uma concentração final de 60 mM. O tampão de lise completa foi diluído 1:10 com água para HPLC-limpo. Para uma extremidade de cada vara de vidro, 0,2 ul de tampão de lise completa foi aplicado e deixado secar à temperatura ambiente até à secura completa. Os sais restantes agora formam o chamado ‘Lysospot’.

4. picking única célula

Em seguida, as células foram coletadas por meio de um micromanipulador:. O microinjetor Celltram Vario e micromanipulador TransferMan NKII (Eppendorf Instruments, Hamburgo, Alemanha) foram equipados com um, capilar flexível tipo customTip design personalizado III com um diâmetro interno de 40 mm e uma extremidade chanfrada (45 °), desenvolvido em estreita colaboração com Eppendorf Instruments. As células foram transferidas da placa de vidro sob o controle visual por um fluorescente DAPI-coloração nuclear para assegurar que os núcleos integrais foram capturados. Para evitar a perda de material durante a transferência e a lise das células, as células foram colocadas directamente para fora do capilar na vara de vidro revestidas com silano levando a Lysospot. Devido ao revestimento de silano, de ADN de ligação ao vidro será evitada. Além disso, os sais da Lysospot são concentradas até uma área muito pequena por causa das mudanças na tensão superficial devido ao revestimento. O Lysospot completa torna-se activado por resolução devido à aquoso envolvente durante a transferência da célula manipulada. A vara de vidro contendo as células foi transferido para um tubo de reacção de PCR de 200 uL contendo 9 ul de tampão de amostra do estojo de amplificação de GenomiPhi V2 (GE Healthcare Europe, Freiburg, Alemanha) e transferido para -80 ° C durante 15 minutos. Após descongelação, adicionou-se 0,1 solução de protease ul (Qiagen, Hilden, Alemanha), seguido por um passo de incubação de 15 minutos a 50 ° C durante a digestão de proteínas e um passo de incubação adicional de 15 minutos a 75 ° C durante a desactivação da enzima.

a amplificação do genoma inteiro

amplificação do genoma total foi realizado com o kit de GenomiPhi V2 (GE Healthcare Europe, Freiburg, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante, com as seguintes modificações: a vara de vidro permanece no tubo reaccional durante a amplificação. A reacção de amplificação foi deixada correr durante 150 minutos a 30 ° C, num volume total de 20 ul. O produto WGA foi limpo com colunas NucleoSEQ SPIN (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha) e concentrações de DNA foram medidas pelo Nanodrop1000 (Peqlab, Erlangen, Alemanha).

microssatélites Detecção

A alelo estado das repetições polimórficas foi investigada através de amplificação por PCR, seguida por separação de cada um gel de agarose a 2% ou electroforese capilar. As reacções foram realizadas num volume total de 10 ul sob as condições dadas abaixo (Tabela S1) num gradiente de Mastercycler (Eppendorf Instruments, Hamburgo, Alemanha). A temperatura de recozimento foi adaptado de acordo com os iniciadores utilizados, como mostrado na Tabela S2. A separação foi realizada utilizando um laser de fluorescência induzida sistema de electroforese capilar de quatro cores (modelo ABIPRISM 3130; Applied Biosystems, Wilmington, GE, EUA) utilizando GeneScan-500 ROX padrão para a avaliação do comprimento do fragmento. A avaliação foi realizada utilizando software GeneMapper avaliação v2.03 (Applied Biosystems, Wilmington, DE, EUA).

Fine Tiling matriz Análise

A matriz telha fina foi desenhado por NimbleGen (Roche NimbleGen Inc. , Madison, WI) como descrito anteriormente [22] de acordo com os nossos parâmetros personalizados (Tabela S6). As bases que fazem parte de elementos repetitivos foram removidos de ser considerado para a concepção de sonda. Além disso, as sondas selecionados não foram autorizados a conter códigos de nucleotídeos ambíguas. Critérios adicionais foram: temperatura de 76 ° C, comprimento da sonda entre 50-75 bp recozimento, a sonda foi autorizado a corresponder apenas uma vez em todo o genoma de acordo com a montagem do genoma humano de Março de 2006 (hg18), http: //genome.ucsc. edu (Tabela S6), e as sondas idealmente começou com um deslocamento de 15 pb. Com estas especificações, cerca de 395.000 sondas podem ser vistos em um array. As fronteiras dos produtos de amplificação para os diferentes clones de células MDA-MB-468 foram calculados pela função de alisamento do algoritmo Quantsmooth [12] e depois validados por quantitativa PCR em tempo real. Para o efeito, um montante total de 53 ensaios verde SYBR foram projetados flanqueando o arranque calculada e endpoints compartilhando as mesmas especificações. Os ensaios foram concebidos para amplificar sequências genómicas singulares de 50-150 pb de comprimento, para garantir a quantificação específica. Cromossoma 2 e cromossoma 10 foram usadas como referência para as regiões estáveis ​​de acordo com Naylor

et ai.

[11]. Se necessário, o arranque e endpoints calculados foram corrigidos com base na matriz de CGH enredo e os resultados qPCR.

RT-PCR quantitativo

A quantificação do número médio de cópias do gene da

EGFR

foi realizada utilizando primers específicos visando sequências singulares de 50-150 bps em diferentes exons do

gene EGFR

o indicado no quadro S3. As reacções de PCR foram realizadas num Mastercycler epgradientS Realplex4 sob as condições dadas na Tabela S4in um volume total de 15 ul. Cada amostra foi medida em triplicado. Uma curva de calibração foi separada gerada para cada um como dizer em cada corrida usando DNA de leucócitos a partir do mesmo paciente que varia 10-0,15 ng por reacção. As concentrações de DNA foram normalizados referindo-se a constante de referência do número de cópias LINHA1 [13]. análises de derretimento foram realizados após cada ensaio para verificar a amplificação do produto singular.

EGFR

número de cópias do gene têm sido determinada pelo cálculo da razão entre a quantidade de ADN no

EGFR e região dividida pela quantidade de ADN na região de referência. Um número de cópias do gene normal, diplóide é idealmente reflectido por um (2n /2N), três cópias do

gene EGFR

seria esperado de cerca de 1,5 (3n /2n). Para calcular o valor de corte para chamar uma amostra obtida, foram utilizados 95% dos limites de confiança dos valores de referência (). Todas as medidas acima do limite superior foram considerados uma

EGFR

ganho de número de cópias do gene.

Informações de Apoio

Tabela S1.

protocolo de PCR do microssatélites por PCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s001

(PDF)

Tabela S2.

Visão geral das sequências dos iniciadores microssatélites.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s002

(PDF)

Tabela S3. pares de primers

de PCR para a qPCR do

gene EGFR

.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s003

(PDF)

Tabela S4. protocolo

PCR para o

EGFR

-qPCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s004

(PDF)

Tabela S5. pares

PCR primers no cromossomo 7.

doi: 10.1371 /journal.pone.0026362.s005

(PDF)

Tabela S6.

contíguos para o projeto matriz.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0026362.s006

(PDF)

Reconhecimentos

Agradecemos A. Bauche e O. Mauermann para excelente assistência técnica