Abstract

cancro do pulmão de pequenas células de ultra-som-guiada (SCLC) é uma doença devastadora com opções limitadas de tratamento. Devido à sua natureza metastática precoce e rápido crescimento, a ressecção cirúrgica é rara. Padrão de regimes de tratamento cuidados permanecem em grande parte inalterado desde a década de 1980, e de sobrevivência de cinco anos permanece perto de 5%. xenoenxerto derivado do paciente modelos (PDX) foram estabelecidos para outros tipos de tumores, material para a pesquisa amplificar e servir como modelos para experimentação pré-clínica; no entanto, limitada disponibilidade de tecido primário tem reduzido desenvolvimento destes modelos para SCLC. O objetivo deste estudo foi estabelecer modelos PDX partir comumente coletadas biópsias por agulha fina aspirado de tumores primários CPPC, e avaliar a sua utilidade como modelos de tumores primários SCLC pesquisa. Estes punção aspirativa por agulha transbrônquicas eficiente enxertada como xenoenxertos e histomorfologia tumor foi semelhante aos tumores primários. Os tumores resultantes foram ainda caracterizados por H E e imuno-histoquímica, criopreservados, e usado para propagar os ratinhos portadores de tumor para a avaliação do nível de regimes de quimioterapia cuidado, para avaliar a sua utilidade como modelo para tumores em pacientes com SCLC. Quando tratados com cisplatina e etoposido, os ratinhos portadores de tumor responderam de forma semelhante para os pacientes de quem os tumores originados. Aqui, demonstramos que os modelos de tumor PDX pode ser eficientemente estabelecida a partir de aspirados de agulha transbrônquicas SCLC primário, mesmo após transporte durante a noite, e que os tumores de xenoenxerto resultantes são similares aos tumores primários correspondentes em doentes com cancro, tanto por histologia e quimio-sensibilidade. Este método permite aos médicos em instituições não-investigação para contribuir de forma colaborativa para o rápido estabelecimento de extensas colecções PDX de SCLC, permitindo a experimentação com tecidos e desenvolvimento de melhores terapias para doentes com CPPC clinicamente relevantes

Citation:. Anderson WC, Boyd MB, J Aguilar, Pickell B, Laysang A, Pysz MA, et ai. (2015) Iniciação e Caracterização de pequenas células do cancro do pulmão xenoenxertos-paciente Derivado do ultra-som-guiada transbrônquica Needle aspirados. PLoS ONE 10 (5): e0125255. doi: 10.1371 /journal.pone.0125255

Editor do Academic: Daniel Chan, da Universidade do Colorado Denver, United States |

Recebido: 24 de setembro de 2014; Aceito: 23 de março de 2015; Publicado em: 08 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Anderson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e a sua arquivos de suporte de informação

Financiamento:. WCA, JA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, e SJD são funcionários da Stem CentRx, Inc., uma empresa focada na biotecnologia segmentação terapêutico de células-tronco cancerosas. O financiador forneceu apoio sob a forma de salários para os autores WCA, JA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, e SJD, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. WCA, JA, PA, AL, mapa, SB, JR, BCS, e SJD são accionistas de Stem CentRx, Inc ., uma companhia de capital e financiamento privado. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas de dados e materiais de partilha

Introdução

Os cancros do pulmão são a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Entre estes, o cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) tem a maior taxa de mortalidade, sendo responsável por ~ 15% das mortes por câncer de pulmão nos Estados Unidos [1]. sobrevivência de cinco anos para pacientes com CPPC permanece perto de 5%, com mais de sucumbir à doença no prazo de um ano de diagnóstico. CPPC é altamente metastático e progride rapidamente. A ressecção cirúrgica não melhora a sobrevivência e, por conseguinte, raramente é prescrita. Por isso, a quimioterapia continua a ser a primeira linha de tratamento [2].

O regime quimioterápico mais comumente administrados para SCLC é cisplatina e etoposídeo (P /E), como tem sido por mais de três décadas [2]. Este regime inicial atinge resposta significativa na maior parte dos pacientes, frequentemente redução de tumores aos níveis indetectáveis. Infelizmente, os tumores quase sempre se repetem logo após a interrupção do tratamento. tumores recorrentes são geralmente mais agressivo e resistente a tentativas posteriores para retardar o crescimento do tumor usando P /E ou outros regimes quimioterápicos aprovados, como topotecano [3-5]. Em pacientes ainda menos afortunados, primeira linha P /E de tratamento produz uma resposta parcial, acelerando a necessidade de terapia de segunda linha, quando tolerada. Apesar de regimes de quimioterapia atuais prolongar a sobrevivência de doentes com CPPC (versus nenhum tratamento), os benefícios são limitados e o impacto sobrevida de 5 anos é trivial. Uma explicação para o progresso negligenciável na descoberta e no desenvolvimento de novas terapias que têm impacto sobre a sobrevivência SCLC paciente é a falta de modelos de tumores apropriados que permitam o estudo da doença. bons modelos devem permitir a avaliação pré-clínica de terapias experimentais, morfologicamente se assemelham a tumores de pacientes, e responder de forma semelhante a regimes quimioterápicos padrão

in vivo

.

xenoenxerto derivado do Paciente (PDX) modelos, que são gerados a partir de tecido tumoral acabado de ressecar implantado, cultivadas, e exclusivamente passadas em ratinhos imunodeprimidos, estão cada vez mais a ser gerado e utilizado para estudar a biologia do tumor humano [6-8]. Estes modelos reter semelhanças significativas para os tumores do paciente a partir do qual eles foram gerados. modelos de tumor PDX gerados a partir de vários outros tipos de tumores geralmente mantêm o seu perfil de sensibilidade com o padrão de respostas de quimioterapia cuidados observadas clinicamente. Além de facilitar o crescimento de tumores humanos para

ex vivo

estudo, os tumores PDX também oferecem modelos fisiologicamente relevantes com as quais a estudar a biologia do tumor e avaliar a eficácia pré-clínica de agentes terapêuticos

in vivo

. modelos de tumor PDX também podem ser criopreservadas e minuciosamente estudado ao longo do tempo, sem extensa passaging, impedindo que os resultados adversos da

in vitro

cultura prolongada, tais como as alterações genômicas que afligem ambas as linhas celulares e seus xenoenxertos de linhas celulares convencionais resultantes [ ,,,0],9, 10].

Porque SCLC raramente é extirpado cirurgicamente, a investigação nesta indicação não se beneficiou da disponibilidade de modelos de tumor PDX gerados a partir de ressecções, embora existam alguns modelos SCLC PDX [10-13]. Acesso a material tumor SCLC primário é predominantemente limitado a aspirações por agulha fina de diagnóstico que são comumente considerados demasiado pequeno para facilitar o enxerto. Leong et ai. demonstraram que estas aspirações por agulhas finas pode gerar tumores morfologicamente PDX e geneticamente semelhantes às dos seus tumores primários correspondentes [11]. Estas aspirações por agulha fina são frequentemente recolhidos em clínicas e hospitais sem acesso no local para animais imunocomprometidos ou a infra-estrutura para gerar novas linhas de PDX. Aqui, mostramos que, primários belos exemplares SCLC simples aspiração de agulha, tomada após a coleta de amostras de diagnóstico e enviado durante a noite a uma instalação de pesquisa colaborando, são capazes de estabelecer de forma eficiente tumores PDX morfologicamente semelhantes ao tumor primário a partir do qual foram produzidos. Além disso, demonstra-se que

In vivo

quimio-responsividade destes tumores PDX para o tratamento combinado com P /L é geralmente conservada dos tumores primários para as suas correspondentes tumores em ratinhos PDX. Este trabalho demonstra que os investigadores e médicos, que trabalham de forma colaborativa, mesmo a grandes distâncias, pode rapidamente e eficientemente criar grandes coleções de linhas tumorais PDX da punção aspirativa por agulha fina abundantemente disponíveis de SCLC. histomorfologia conservada e capacidade de resposta a nível de cuidados regimes quimioterápicos fazer essas excelentes modelos com os quais a estudar melhor SCLC biologia do tumor, e facilitar a descoberta e desenvolvimento de terapêuticas que melhoram a sobrevida do paciente.

Materiais e Métodos

os pacientes

o estudo foi aprovado pelo Carilion Clinic Institutional Review Board. Todos os 12 pacientes com câncer de pulmão de pequenas células assinaram consentimento informado antes de participar no estudo. As amostras foram tomadas por endobrônquica aspiração com agulha transbrônquica guiada por ultra-som (EBUS-TBNA), quer a partir de um tumor primário central ou de suspeita de envolvimento ganglionar. classificação de estadiamento foi feita de acordo com tanto a Administração Lung Study Group Veteranos e Associação Internacional para o Estudo dos sistemas de estadiamento do câncer de pulmão [14, 15]. performance status foi determinada no momento do diagnóstico inicial [16] .Patients foram oferecidas padrão de tratamento e resultados de cuidados medições foram monitorados.

EBUS-TBNA

Todos os procedimentos foram realizados sob sedação profunda usando um broncoscópio de ultra-som flexível (CP-EBUS XBF-UC260F, Olympus, Tóquio, Japão) [17] e uma agulha de 21G Vizashot. Pelo menos 6 amostras de biópsia de agulha transbrônquicas foram tomadas em cada tumor suspeita ou estação nodal. As amostras iniciais foram processados ​​de forma institucional padrão, com preparação de lâminas para uma rápida interpretação citológica no local, bem como coleta de material para construir um bloco de células para avaliação patológica atrasado. A última amostra recolhida foi expelida para dentro de gelo-frio HypoThermasol-FRS (Sigma, St. Louis, MO) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo um volume de pelo menos 10 vezes maior do que o volume do tecido, e enviados durante a noite para Stemcentrx, Inc. para implantação no prazo de 30 horas de biópsia.

regime de tratamento clínico de pacientes com SCLC doadores

pós-biópsia

Oito dos doze pacientes dos quais foram biopsiados recebeu amostras tumorais intravenosa 60-80 mg /m

2 cisplatina no dia 1 mais 80-120 mg /m

2 Etoposide nos dias 1-3 a cada 21-28 dias com uma antecedência de pelo menos quatro ciclos de tratamento. Ambos os regimes necessária hidratação e administração de fármacos antieméticos. Se a contagem de leucócitos caiu abaixo de 2.000 por mm

3, ou a contagem de neutrófilos caiu abaixo de 1000 por mm

3, granulokine humana recombinante foi administrada até leucócitos e /ou neutrófilos foram restaurados. Os ajustes de dose foram feitas com base na identificação de toxicidades do órgão associada a quimioterapia. Três pacientes optado por tratamento. Um paciente foi perdidos para follow-up e, assim, seu curso de tratamento é desconhecida.

Os seguintes critérios foram utilizados para avaliar as respostas dos pacientes ao padrão de cuidados tratamento com cisplatina e etoposídeo (P /E). imagem radiológica, seja computadorizada de tórax ou Positron Emission Tomography, foi utilizado para determinar a resposta ao padrão de terapia de tratamento. Critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos (RECIST) foi utilizado para a resposta do tumor grau da seguinte forma: Resposta Completa (CR): Desaparecimento de todas as lesões alvo. Resposta Parcial (RP): Pelo menos uma diminuição de 30% na soma do diâmetro maior (LD) de lesões alvo, tomando como referência o LD soma da linha de base. Doença estável (SD): Nem o encolhimento suficiente para se qualificar para PR nem aumento suficiente para se qualificar para Doença Progressiva (PD), tendo como referência o menor LD soma já que o tratamento começou. PD: pelo menos um aumento de 20% na soma do LD de lesões alvo, tomando como referência a menor soma LD registado desde o início do tratamento ou o aparecimento de uma ou mais novas lesões [18]. Sobrevida global (OS) foi definido como o intervalo entre o diagnóstico inicial e morte do paciente medido em semanas.

geração PDX

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Animal Care e Use o Stemcentrx Institucional (Protocolos SCAR -3-2008 e SCAR-5-2008). mouse estudos foram realizados de acordo com a Associação Americana de Ciência Animal Laboratory. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia isoflurano, e todos os esforços foram feitos para reduzir o sofrimento animal. Os ratos foram sacrificados utilizando comprimido CO

2 gás, de acordo com as Orientações AVMA mais recentes sobre a eutanásia. Após a recepção por Stemcentrx, cada tumor SCLC espécime de biópsia foi sedimentado por centrifugação a luz (50 RCF durante 5 minutos), re-suspenso em 100-150μL Médio-199 (Mediatech, Inc., Manassas, VA) e misturados com um volume igual de Matrigel (BD Biosciences, Milpitas, CA). Em seguida, 100 uL da solução foi injectada subcutaneamente sob as almofadas de gordura mamaria de ratinhos receptores inferiores 8-10 semanas de idade, fêmeas NOD /SCID. Rato de saúde, peso, e volume (s) do tumor foram avaliados, pelo menos, semanalmente. Quando os volumes tumorais medida entre 800-1,500 mm

3, os destinatários foram humanamente eutanasiados e os tumores foram ressecados.

Propagação e análise de tumores PDX

tumores recentemente ressecados foram dissociadas a uma única célula suspensão tal como descrito anteriormente [19, 20]. Em cada passagem da propagação do tumor, origem epitelial humana foi confirmada por coloração positiva por citometria de fluxo utilizando EpCAM anti-humano (clone 9C4), e coloração negativa com CD45 anti-humano (clone HI30), anti-ratinho CD45 (clone 30-F11 ) e anti-rato H-2K

d (Clone SF1.1) anticorpos (todos da BioLegend, San Diego, CA). Todos citometria de fluxo, os anticorpos foram utilizados a uma concentração final de 10 ug /mL. Para propagar os tumores PDX, as células dissociadas foram suspensas 1: 1 em volume em Matrigel a uma concentração de 50.000 células por 100 uL de volume final por local de injecção. As células foram implantados bilateralmente sob as almofadas de gordura mamária inferiores usando um crescimento de agulha 27G e tumor foi monitorado semanalmente.

tempo de progressão (TTP) foi definido como o intervalo entre as respostas ao tratamento e identificação de doença progressiva por RECIST medido em semanas. Para medir as respostas de tumor de xenoenxerto de derivados de paciente para o tratamento padrão de cuidados com a cisplatina e etoposido, foram utilizados os seguintes critérios: tempo de duplicação foi definida como o período de tempo significativo, em que o volume do tumor (dias) dobrada; A taxa de crescimento do volume do tumor foi monitorado, calculada utilizando a fórmula d

dbl = (d

id

f) /log

2 (v

iv

f), com uma média de todos os tumores, enquanto na gama de 150 milímetros

3-1200mm

3; A percentagem de inibição do crescimento do tumor (TGI%) foi calculada como o volume médio de tumores tratados com quimioterapia, dividido pelo volume médio de tumores tratados com o veículo de 21 dias após o tratamento inicial.

biópsias SCLC e tumores primários PDX foram fixadas com formalina e embebidos em parafina (FFPE), e secções planas de blocos de tecido foram cortadas e montadas em lâminas de vidro para microscópio. Para IHC, secções de tecido de xileno-parafinado foram pré-tratados com o antigénio Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA), bloqueadas com soro de burro a 10% em BSA a 3% em tampão PBS e depois incubadas com o anticorpo primário. Os anticorpos primários utilizados foram como se segue: sinaptofisina (1: 200; clone SP11; mola Bioscience, Pleasanton, CA), cromogranina A (0,2 ug /ml; Clone SP12; mola Bioscience, Pleasanton, CA), e CD56 (0,2 ug /ml; Clone EP2567Y; Origene, Rockville, MD), queratina 5 (1,4 ug /ml; Clone SP178, mola Bioscience, Pleasanton, CA), queratina 6 (0,15 ug /mL; Clone SP87, mola Bioscience, Pleasanton, CA), queratina 7 (0,7 ug /ml; Clone SP52, mola Bioscience, Pleasanton, CA), queratina 14 (1 ug /mL; clone LL002, Abcam, Cambridge, MA), queratina 20 (1:50; Clone SPM140, Abcam, Cambridge , MA), TTF1 (Clone 8G7G3 /1, Biocare Medical, Concord, CA), TP63 (0,125 mg /mL; Clone 4A4, Biocare Medical, Concord, CA), Napsina A (Clone TMU-AD02, Biocare Medical, Concord, CA). As secções foram incubadas em conjugado com biotina, específico das espécies anticorpos secundários (Immunoresearch, West Grove, PA), seguido por incubação em estreptavidina-HRP (ABC Elite Kit, Vector Labs, Burlingame, CA). detecção cromogénica foi desenvolvido com 3, 3′-diaminobenzadina (Thermo Scientific, Rockford, IL) e tecidos foram contrastadas com hematoxilina e fotografada com um microscópio óptico com aumento de 40 vezes.

Para coloração IHC, os seguintes anticorpos de controlo

negativos e foram utilizados tecidos de controlo positivo. CHGA: IgG1 (BioLegend, Inc., San Diego, CA) e pâncreas humanos normais. Sinaptofisina: IgG de coelho (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) e pâncreas humanos normais. CD56: IgG de coelho (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) e pâncreas humanos normais. Queratina 5: IgG de coelho (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) e de próstata humana normal. Queratina 6: IgG de coelho (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) e de próstata humana normal. Queratina 7: IgG de coelho (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) e de próstata humana normal. Queratina 14: IgG1 (BioLegend, Inc., San Diego, CA) e pele humana normal. Queratina 20: IgG2a (BioLegend, Inc., San Diego, CA) e do cólon humano normal. Napsina A: IgG de coelho (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) e de pulmão humano normal. P63: IgG2a (BioLegend, Inc., San Diego, CA) e normal da próstata humana. TTF-1: IgG1 (BioLegend, Inc., San Diego, CA) e normal pulmão humano

Resultados

Segurança da técnica de amostragem minimamente invasivo

De cada um. dos 12 pacientes SCLC consentem que participaram neste estudo, uma única amostra de biópsia de agulha adicional foi recolhido por EBUS-TBNA com a finalidade de tentar iniciar tumores de xenoenxerto. Estas amostras de aspirado de células foram retirados de qualquer tumores primários de pulmão, ou nós envolvidos a partir de uma variedade de pacientes com média de 62 anos de idade (Tabela 1). Dez desses doze tumores foram diagnosticados como metastático (

i

.

e

. Doença extensa) e, destes, dois foram coletadas amostras de linfonodos comprometidos. Nenhum dos pacientes experimentaram efeitos adversos atribuíveis à coleta de amostras de biópsia adicional.

geração de tumor PDX e caracterização

Após a coleta, as amostras foram enviadas durante a noite em gelo do Carilion Clinic Hospital, em Roanoke, Virginia para Stemcentrx em San Francisco, Califórnia. Dentro de 30 horas de biopsia, células provenientes das amostras de aspiração foram implantadas subcutaneamente em ratinhos imunocomprometidos NOD /SCID receptores e monitorizados para o crescimento do tumor, durante 32 semanas. Embora uma única amostra de células do aspirado pode não representam completamente a diversidade celular de um tumor do paciente, a amostragem mais completa e representativa do mesmo tumor paciente teria desnecessariamente aumento do risco para os pacientes. Por 26 semanas pós-implante, as amostras do paciente 8 de 12 (67%) produzidos confirmou tumores CPPC, com o tempo médio para chegar a 150 mm

3 que variam de 81-151 dias pós-transplante. Para facilitar ambos os estudos imediatos e futuros, resultantes “passagem 1” (P1) tumores foram fixados em formalina ou dissociados em suspensões de células individuais para a propagação imediata em novos ratinhos receptores, ainda fenotípica e /ou caracterização genética, ou criopreservação. Entre as 4 amostras SCLC paciente que não resultaram em linhas úteis tumorais SCLC PDX, três falhou em iniciar tumores (LU108, LU112, LU125) e um (LU122) consistiu de uma conseqüência de linfoma de células B humanas. Para garantir a propagação fiel de tumores não contaminados, um ensaio de fingerprinting SNP foi realizada em células tumorais primárias e células PDX em cada passagem. Estes resultados confirmam que cada tumor PDX é único e a sua derivada de tumor primário cognato.

tumores SCLC tem uma morfologia distinta caracterizado por o achatamento das células, moldagem nuclear e citoplasma escasso [21]. Na maioria dos casos, estas características pode ser usado para distinguir claramente SCLC das várias formas de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). tumores SCLC tem morfologia variável, de alta celularidade às células tumorais escassos em meio a estroma e tecido necrosado. No entanto, a morfologia característica de células de aveia, moldagem nuclear e citoplasma escasso pode ser prontamente confirmada em amostras tumorais PDX (FIG 1A e 1B, S1 e S2 Figs). exame citológico do aspirado de células de tumores de pacientes e seções FFPE de tumores PDX combinados foram coradas com corante Kwik-Diff. Foram observadas semelhanças morfológicas entre os tumores primários e de xenotransplante (S5 FIG). Enquanto exame citológico do aspirado de células mal preservar a organização do tecido tumoral, morfologias celulares são semelhantes.

seções FFPE foram preparados a partir de tumores PDX (LU086p1 é representado). (A) As secções de tecido foram coradas por IHQ para marcadores SCLC diagnóstico Chromagranin A (CHGA), Sinaptofisina (AEP) ou CD56. barras de escala representam 10um. (B) As secções de tecido foram coradas por IHQ para diagnóstico marcadores não-SCLC queratina 5 (KRT5), queratina 6 (KRT6A), queratina 7 (KRT7), queratina 14 (KRT14), queratina 20 (KRT20), Napsina A (NAPSA) , TP63, ou TTF1. barras de escala representam 10um. células de tumor (C) PDX foram dissociados em suspensões de célula única e analisadas por citometria de fluxo para a expressão de EpCAM (CD326) e NCAM1 (CD56). Histogramas que exibem os níveis de expressão são mostrados (linha preta escura), enquanto que o sinal de fundo foi determinado utilizando um anticorpo de controlo de isotipo (cinzento cheio).

Para confirmar a sua identidade SCLC, os tumores foram avaliados quanto à sua expressão de várias proteínas característicos comumente usado para confirmar o diagnóstico. Em primeiro lugar, secções de tecido FFPE de tumores PDX foram coradas por IHQ para os antígenos de diagnóstico SCLC positivos cromogranina-A, Sinaptofisina e CD56 (Fig 1A e S1 Fig). Além disso, as secções de tecido PDX geralmente não expressa característica antigénios de cancros do pulmão de células não-pequenas, incluindo queratina 5, queratina 6, queratina 7, queratina 14, queratina 20, TTF1, TP63, e Napsina A (Fig 1B e S2 figura). A coloração positiva para queratina 5, queratina 6, queratina 14, ou TP63 pode indicar carcinomas de células escamosas do pulmão. A coloração positiva para a queratina 7, TTF1 ou Napsina A pode indicar adenocarcinoma de pulmão. Queratina 20 é tipicamente expresso em cancros do tracto gastrointestinal e a sua expressão negativa pode ser utilizada para excluir os cancros de origem não pulmonares. Apenas 3 dos 8 SCLC PDX neste estudo foram positivos para o TTF-1 expressão. Enquanto TTF-1 expressão em CPPC é comum, que é utilizado principalmente para identificar o adenocarcinoma pulmonar e a coloração positiva é provavelmente influenciado pelo clone de anticorpo. Finalmente, os tumores foram dissociadas de uma única célula suspensões e caracterizada por citometria de fluxo para verificar a sua origem epitelial humana (

i

.

e

. Humana EpCAM +) e confirme expressão de CD56 (Fig 1C e S3 FIG). Representante de IHC e citometria de fluxo são mostrados para imagens LU086 na Fig 1 e um resumo de coloração IHC para todas as linhas de PDX testados é mostrada na Tabela 2.

em tumores PDX, também realizada resequenciamento alvo dos oncogenes (Tabela S1). TP53 é o gene mais comumente mutado em SCLC, afetando aproximadamente 3 de 4 tumores. Encontramos TP53 mutações em 6 de 8 tumores. RB1 é mutado em aproximadamente metade dos SCLC e encontramos mutações RB1 em 3 de nossos 8 tumores SCLC PDX testados. Estas frequências de mutação são consistentes com frequência notificada para SCLC.

Em resumo, os tumores SCLC PDX reter semelhança impressionante com seus tumores primários SCLC apesar de ter sido iniciada a partir de muito pouco material. Além disso, a eficiência com que os tumores PDX pode ser estabelecida utilizando material de biópsia de agulha sugere que a célula perpetuar tumor (TPC;..

i

e

células-tronco do câncer) frequência é relativamente elevado, o que poderia esperar, dada a agressividade ea natureza refractária da SCLC.

PDX resposta do tumor ao P /e reflete a resposta clínica

para determinar se os tumores SCLC PDX, estabelecido como aqui descrito, reter o P /características de resposta e, observada em pacientes de quem foram gerados os tumores PDX, tumores PDX foram expostos a regimes de P /E combinadas com doses máximas toleradas perto que equivalem a doses semelhantes ao esquema utilizado em doentes (

i

.

e

5 mg /kg de cisplatina 24 mg /kg de etoposido, o que equivale a cerca de 20 mg /m

2 cisplatina e 94 mg /m

2 etoposido). Após a implantação subcutânea de células tumorais e SCLC PDX randomização em coortes de 5-8 ratinhos por grupo uma vez que os tumores atingiram 150 mm

3-200 mm

3, os ratinhos foram doseados na data da randomização com 5 mg /kg de cisplatina e 8 mg /kg de etoposido, e novamente a seguir em dois dias com um adicional de 8 mg /kg cada dia etoposido. Coortes que receberam o veículo foram administrados 0,9% de NaCl nos mesmos volumes utilizados para dosear os ratinhos com P /E. A maioria dos tumores SCLC PDX respondeu a este único curso de P /E quimioterapia, resultando numa inibição do crescimento de tumor médio de 79 ± 17% versus os ratinhos tratados com excipiente (Tabela 3). Apesar de uma resposta robusta pela maioria dos tumores PDX, como se observa nos seres humanos, houve recorrência do tumor invariável, geralmente observado no prazo de 3 semanas de randomização (17 ± 10 dias; n = 8), com todos os tumores SCLC PDX recorrentes no prazo de 5 semanas. Por exemplo, tumores LU073 PDX respondeu bem ao P /E, demonstrando uma inibição do crescimento do tumor de 82% e 35 dia (

i

.

e

. 5 semanas) tempo de progressão (Fig 2A e tabela 3), enquanto o paciente do qual foram estabelecidos os tumores LU073 PDX exibiu um tempo de 31 semanas a progressão clínica na sequência de um ciclo completo de tratamento (tabela 1). Em contraste, o modelo de tumor LU086 PDX iniciada a partir de uma vasta paciente fase que não respondem bem ao regime clínico de P /E (TTP clínica = 7 semanas) também foi minimamente sensível à terapia com o P /E (41% TGI TTP = 0; Figura 2B). Em resumo, a grande maioria dos modelos de tumor SCLC PDX estabelecidas demonstraram respostas tumorais que se correlacionaram com métricas TTP observadas clinicamente (Fig 2C; n = 5; R-quadrado = 0,77;

P

-valor = 0,050). O outlier solitária a esta tendência foi PDX LU064 (Fig 2C; cinza círculo aberto). A concordância geral entre tumor paciente primário e a resposta do tumor PDX para P /E

in vivo

apoia a conclusão de que os tumores SCLC PDX iniciadas a partir de biópsias de tumores refletem a biologia do tumor do paciente e servir como excelentes modelos com os quais para melhor estudar e compreender desta neoplasia agressiva.

Ao atingir um volume de tumor médio de 150-200 mm

3, ratos portadores a) LU073p2 ou B) tumores LU086p3 PDX foram randomizados, administrados quer veículo (triângulos fechados), ou P /e (círculos abertos; 5 mg /kg de cisplatina no dia 1 e 8 mg /kg de etoposido no dia 1, 2 3) de tratamento, e os tumores foram medidos semanalmente. O suporte indica o tempo até à progressão (TTP). C) O TTP médio dos tumores PDX seguintes um curso de tratamento P /E foi representada em função TTP clínicos observados. Os dados são representados como média ± SEM e reflete coortes de n = 5 ratos por grupo.

Discussão

cancro do pulmão de pequenas células é uma doença muito mortal, contra o qual pouco progresso tem sido feito em décadas. Em parte, a falta de progresso é rastreável a uma escassez de modelos de tumor altamente relevantes disponíveis para a investigação, decorrentes de uma escassez percebido de tecido primário adequado ao estabelecimento de tumores de xenoenxerto derivado de pacientes em camundongos. SCLC é rotineiramente diagnosticada através da recolha de amostras de biópsia por TBNA. O advento da orientação EBUS facilita biópsias mais seguros, mais fácil e mais precisos, permitindo uma maior disponibilidade deste material para fins de pesquisa. Aqui, mostra-se que pequenas amostras de tecidos a partir de biópsias estas são suficientes para enxertar eficientemente e estabelecer linhas de tumor de xenoenxerto em murganhos com o mínimo risco para os pacientes dadores. Estes tumores PDX pode ser gerado por colaboradores distantes e as suas respostas terapêuticas imitam as dos seus tumores primários correspondentes.

A eficiência do enxertando espécimes de tumor primário em ratinhos imunocomprometidos é influenciado por muitos factores, incluindo tecido de origem, viabilidade, tumores tipo, estágio e agressividade, tensão do rato destinatário e outros fatores técnicos e ambientais [6-8]. Por exemplo, tumores da mama primários têm sido relatados para enxertar como xenoenxertos com eficiência de 12,5%, enquanto xenoenxertos NSCLC relataram eficiências de enxerto tão elevadas como 90% [22-24]. Aqui, nós demonstramos que os tumores de xenoenxerto de Quimioterapia pode ser estabelecida com alta eficiência, manter histomorfologia tumor parental, e em grande parte replicar a resposta do tumor parental para P /quimioterapia E.

Enquanto linhas de tumor SCLC PDX foram geradas e descritas anteriormente [9-13], o número de modelos de tumores de SCLC PDX disponíveis continua extremamente limitada, e a geração mais ampla destes modelos não foram prosseguidas, devido à incapacidade para iniciar xenoenxertos percebida a partir de material de biópsia de agulha. Neste estudo, um pequeno esforço de colaboração com origem a uma única clínica produzida 8 sucedidas linhas de tumor SCLC PDX em apenas 19 meses sem um requisito para o acesso local aos animais imunocomprometidos. Na verdade, o transporte de noite de SCLC amostras de aspirado de agulha fina parece ter tido um impacto mínimo sobre a eficiência enxerto do tumor, embora ainda melhor eficiência de enxerto pode ser esperado com o mesmo dia xenotransplante. O sucesso prodigioso deste estudo, estabelecendo rapidamente uma grande coleção de linhagens tumorais SCLC PDX a partir de uma gama diversificada de pacientes doadores usando amostras EBUS-TBNA, demonstra que esta abordagem pode ser executado com êxito.

Porque modelos de tumor PDX foram gerado a partir de uma única agulha de biópsia a partir de locais primários ou nodais, é possível que as linhas resultantes PDX não contêm o completo clonal heterogeneidade presente em pacientes. respostas, no entanto, 5 de 6 (83%) linhas PDX para os quais eram conhecidos tanto os dados de resposta clínica e PDX para P /E regimes de tratamento tinha correlacionando

in vivo

. A concordância destes dados sugere que, ou alguns clones estavam presentes em pacientes com SCLC, no momento da biópsia ou uma única passagem biópsia foi capaz de obter e conferem uma representação dos clones actuais. A excepção solitário para esta observação foi LU064, que parecia ter uma resposta inadequada ao P /E em ratos em comparação com a resposta robusta observados no paciente a partir do qual ela foi derivada. Esta discrepância pode refletir o fato de que um subclone mais agressiva foi criada em ratos ou mutações adicionais possam ter resultado após a implantação.

modelos de tumor SCLC que refletem com precisão doenças humanas têm sido difíceis de encontrar. linhas celulares tradicionais são rotineiramente propagado e estudou em um

in vitro

configuração; no entanto, estas linhas têm diversas discrepâncias irrevogável em comparação com tumores tal como existem em pacientes [9, 25-27]. Surpreendentemente, muitas das linhas de células mais comumente utilizados com o qual se estudam SCLC biologia do tumor foram gerados mais de 30 anos [28], e têm anormalidades genômicas significativas provável associados com décadas de

in vitro

cultura em não- condições fisiológicas [29]. Daniel

et al

. recentemente demonstrado que mesmo os breves períodos de

in vitro

cultura altera irreversivelmente a expressão do gene em células tumorais SCLC [9], assim linhas celulares amplamente expandida

in vitro

não são susceptíveis de reflectir adequadamente o tumor parental.