Abstract

Fundo

de células escamosas carcinomas pulmonares são responsáveis ​​por aproximadamente 25% dos novos casos de carcinoma de pulmão e 40.000 mortes por ano nos Estados Unidos. Embora existam várias terapias genomically direcionados para adenocarcinoma de pulmão, nenhum foi ainda relatada em carcinoma do pulmão de células escamosas.

Metodologia /Principais Achados

Usando a análise de matriz SNP, descobrimos que uma região do cromossoma segmento 8p11-12 contendo três genes-

WHSC1L1

,

LETM2

, e

FGFR1

-é amplificado em 3% dos adenocarcinomas de pulmão e 21% dos carcinomas de pulmão de células escamosas. Além disso, demonstrou-se que uma linha celular de carcinoma do pulmão de não pequenas células portadores de amplificação focal

FGFR1

é dependente da actividade de FGFR1 para o crescimento celular, como o tratamento desta linhagem de células, quer com o

FGFR1

– shRNAs ou com FGFR pequenos inibidores enzimáticos molécula específica leva à inibição do crescimento celular.

Conclusões /Significado

Esses estudos mostram que

FGFR1

amplificação é comum no cancro do pulmão de células escamosas, e que FGFR1 pode representar um alvo terapêutico promissor no cancro do pulmão de células não pequenas

Citation:. Dutt a, Ramos AH, Hammerman PS, Mermel C, Cho J, Sharifnia T, et al. (2011) Inhibitor-Sensitive

FGFR1

amplificação in Human Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 6 (6): e20351. doi: 10.1371 /journal.pone.0020351

editor: Ming You, Medical College of Wisconsin, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de dezembro de 2010; Aceite: 30 de abril de 2011; Publicação: 07 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Dutt et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Fontes de financiamento para esse trabalho incluem o apoio da Novartis Pharmaceuticals, a American Lung Association, unindo contra o câncer pulmonar, o Fundo Monopoli Thomas Sarah, a Fundação Seaman e Genentech para MM AD é apoiado por uma bolsa Ramalingaswami do Departamento de Biotecnologia, Ministério da Ciência, Governo da Índia. P.S.H. é apoiado por uma Young Investigator Award da Parceria Nacional do câncer pulmonar. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. M. M. é um consultor para Novartis e recebe apoio de pesquisa da Novartis, recebe apoio para pesquisa da Genentech, e é um conselheiro fundador e consultor e acionista da Fundação de Medicina. N.G. laboratório recebe patrocinado pesquisa da Novartis. No entanto, isso não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em países desenvolvidos com mortes em 2009, estimado em cerca de 160.000 nos Estados Unidos, sendo responsável por cerca de 28% de todas as mortes por câncer [1]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por 75% de todos os cânceres de pulmão e inclui dois subtipos predominantes, adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular (CEC), que compreendem 40% e 25% dos CPNPC, respectivamente [2], [3] . Apesar histológico clara e distinções biológicas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma de células escamosas são largamente tratada com os mesmos agentes quimioterapêuticos com a excepção de o agente antifolato pemetrexed, que está aprovada para o tratamento de NSCLC não-escamosas [4].

avanços significativos no tratamento de adenocarcinoma de pulmão ter se originado a partir de análises genômicas detalhadas e a implantação de agentes molecularmente direcionados principais que levaram a melhorias nos resultados dos pacientes. Exemplos incluem o uso de receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), inibidores, tais como gefitinib e erlotinib [5], [6], [7] para adenocarcinomas do pulmão rolamento

EGFR

mutações [8], [9], [ ,,,0],10], e de inibidores da ALK, como crizotinib [11] para adenocarcinomas pulmonares rolamento

EML4-ALK

translocações [12], [13].

no entanto, pouco se sabe sobre a targetable anormalidades genéticas subjacentes cancro do pulmão de células escamosas. Além de

TP53

mutações [14], carcinomas do pulmão de células escamosas foram mostrados para abrigar amplificações de

PIK3CA

[15],

SOX2

[16], e

EGFR

[16], bem como

EGFR

mutações variante III [17]

DDR2

mutações [18] e amplificações raros de

PDGFRA /KIT

[ ,,,0],19], [20] e

BRF2

[21]. Um estudo recente demonstrou amplificação focal dos

FGFR1

locus no 8p cromossoma associados com a dependência celular no

FGFR1

e sensibilidade para FGFR inibidores [22]. Neste momento não há terapias direcionadas aprovado pelo FDA para o cancro do pulmão de células escamosas.

Segmentação tirosina quinases amplificados com anticorpos ou com inibidores de pequenas moléculas levou a melhorias dramáticas nas taxas de resposta e sobrevida global de pacientes com câncer cujos tumores porto anomalias genómicas específicas. Amplificações de

EGFR

e

ERBB2

têm sido relatados em uma variedade de malignidades, incluindo cabeça e pescoço, esôfago, estômago, mama e cancro do cólon, bem como NSCLC [23]. Segmentação destas tirosina-quinases, tais como o uso de cetuximab para direcionar

EGFR

no colo-rectal e cancro da cabeça e pescoço [24], [25] e o uso de trastuzumab para direcionar

ERBB2 em cancro da mama [26], resultou em melhoria significativa os resultados dos pacientes em cada uma dessas doenças, embora nem todos os pacientes com estas amplificações responder a agentes direcionados [27], [28], provavelmente devido a alterações genômicas adicionais dentro do tumor que resultam na resistência primária a agentes específicos [29], [30].

O gene de crescimento do fibroblasto tipo receptor do factor 1 (

FGFR1

) é um dos genes mais comumente amplificada no cancro humano [16 ]. O receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR) a família de tirosina-quinase é composta de quatro cinases, FGFR1, 2, 3, e 4, que desempenham papel crucial no desenvolvimento, e foram mostrados para ser alvos de desregulamentação por amplificação, mutação pontual, ou translocação (revisto em [31]). Translocações envolvendo

FGFR3

, bem como mutações ativadoras somáticas no

FGFR3

foram identificados em mieloma múltiplo e câncer de bexiga [32], [33], [34]. Nós e outros identificaram mutações ativadoras no

FGFR2

no câncer de endométrio [35], [36]. A amplificação ou activação de

FGFR1

foi reportado no carcinoma epidermóide oral [37], carcinomas de células escamosas esofágicas [38], do cancro do ovário [39], o cancro da bexiga [40], o cancro da próstata [41], [rhabodomyosarcoma ,,,0],42], e cancro do pulmão [16], [43], [44], [45], [46]. Consistente com isto, um FGFR-pan inibidor de tirosina-quinase tem sido mostrado para bloquear a proliferação de um tumor num subconjunto de linhas celulares de NSCLC com a sinalização de FGRF-activados, mas não tem nenhum efeito sobre as células que não activam a via de [47].

FGFR1

foi identificado como o evento condutor em carcinomas da mama e, especialmente NSCLC Carcinomas de células escamosas do pulmão, abrigando amplificações semelhantes do segmento cromossómico 8p11 [22], [48]

Baseado no SNP matriz de análise do número de cópias de 732 amostras, informamos que

FGFR1

é somaticamente amplificado em 21% dos carcinomas de células escamosas do pulmão, em comparação com 3,4% dos adenocarcinomas do pulmão. Nós FGFR1 validar como um alvo terapêutico potencial, mostrando que pelo menos uma

FGFR1

linha celular de tumor de NSCLC -amplified é sensível à inibição enzimática e FGFR dependente

expressão FGFR1

para a viabilidade celular como evidenciado pela tratamento shRNA. Juntamente com os relatórios anteriores analisados ​​acima, estes resultados sugerem que FGFR1 pode ser um alvo terapêutico atraente em NSCLC.

Materiais e Métodos

amostras primárias NSCLC e linhas celulares

NSCLC de células linhas, NCI-H1703 (epidermóide), NCI-H2444 (pulmonar), NCI-H520 (epidermóide), HCC95 (epidermóide), NCI-1581 (carcinoma de células grandes), Calu3 (não especificados), NCI-H1734 (não de outra maneira especificado), Colo699 (adenocarcinoma), NCI-H2170 (epidermóide), NCI-H226 (escamoso), A427 (adenocarcinoma), NCI-H1563 (adenocarcinoma), NCI-H1781 (adenocarcinoma) e HCC15 (escamoso) foram obtidas a partir da colecção de FA Gazdar, J. Minna, e colaboradores [49], [50], [51], a partir de ATCC (Manassas, Virginia, Estados Unidos) e /ou DSMZ (Braunschweig, Alemanha). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 completo suplementado com 10% de soro de vitela (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos da América) e penicilina /estreptomicina (Gibco /Invitrogen). Os tumores NSCLC /pares normais analisados ​​neste estudo foram descritos anteriormente [16], [20], [45], [50], [52].

dados de matriz SNP análise

experiências de matriz de SNP foram realizados em 732 amostras de dados e de linhas celulares tumorais e NSCLC analisados ​​como descrito anteriormente [16], [20], [45], [50], [52]. Foram identificados os limites do fragmento amplificado 8p11 definido por análise GISTIC [53], como relatado [52] (https://www.broadinstitute.org/tumorscape/pages/portalHome.jsf). exibição de dados foi realizada utilizando o Integrative Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv).

A transfecção e infecção

linha celular de empacotamento Phoenix 293T (Orbigen, San Diego, Califórnia, Estados Unidos da América) foram transfectadas com vectores de gateway baseados no pBabe-Puro usando FuGENE® 6 Transfection Reagent (Roche, Indianapolis, Estados Unidos da América) para gerar retrovírus de replicação incompetente. As células alvo foram infectadas com essas retroviroses em presença de 8 ug /ml de polibreno. Dois dias após a infecção, as células foram tratadas com 2 ug /ml de puromicina (Sigma, St. Louis, Missouri, Estados Unidos da América) durante dois dias. As linhas de células estáveis ​​resultantes foram utilizados para estudos experimentais.

shRNA mediada

FGFR1

knockdown

vetores shRNA foram obtidos a partir TRC (O Consórcio RNAi). As sequências alvo das construções shRNA são:

FGFR1

# 1 (TRCN 0000121307):. 5′- AGTGGCTTATTAATTCCGATA-3 ‘

FGFR1

# 2 (TRCN 0000121308): 5’GCTTGCCAATGGCGGACTCAA-3 ‘

FGFR1

# 3 (TRCN 0000121309):. 5′- CTTGTATGTCATCGTGGAGTA-3′.

FGFR1

# 4 (TRCN 0000121310): 5’CAAGATGAAGAGTGGTACCAA-3 ‘

FGFR1

# 5 (TRCN 0000121311):. 5′- GAATGAGTACGGCAGCATCAA-3′.

LETM2

# 1 (TRCN 0000040243): 5’CGCACCTTCTACCTGATAGAT-3 ‘

LETM2

# 2 (TRCN 0000040244):. 5′- CCCAGCACAAAGGAGATAGTT-3 ‘

LETM2

# 3 (TRCN 0000040245):. 5′- CCAGTTACATCATCACCCATA-3′.

LETM2

# 4 (TRCN 0000040246): 5’CCAGGAACTAGACTAATACAA-3 ‘

LETM2

# 4 (TRCN 0000040247):. 5′- GCATTGAGTGTATCAGAACTA-3′.

WHSC1L1

# 1 (TRCN 0000015613): 5’CGAGAGTATAAAGGTCATAAA-3 ‘

WHSC1L1

# 2 (TRCN 0000015614):. 5′- CCATCATCAATCAGTGTGTAT-3′.

WHSC1L1 # 3 (TRCN 0000015615): 5’CGAGAATATCATGTCCAGTTT-3 ‘

WHSC1L1

# 4 (TRCN 0000015616):. 5′- GCTTCCATTACGATGCACAAA-3′ .

WHSC1L1

# 5 (TRCN 0000015617):. 5′- GCAGGGAATTGTTTGAGTCTT-3 ‘

a sequência alvo do

GFP

shRNA é 5 ‘-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT-3’. Os lentivírus foram feitos por transfecção de células de empacotamento 293T com estas construções, utilizando um sistema de três plasmídeo como anteriormente descrito [54]. As células alvo foram incubadas com lentivírus durante 6 horas na presença de 8 ug /ml de polibreno e deixado em meios frescos. As células foram cultivadas durante dois dias. Cinquenta microgramas de lisados ​​totais de células preparadas a partir das linhas de células infectadas foi analisado por transferência de Western. Ensaios

crescimento e proliferação

Para os ensaios de sobrevivência, 2 × 10

6 células para cada célula tumoral linha de expressar shRNAs construções de direccionamento

FGFR1

,

WHSC1L1

,

LETM2

ou

GFP

juntamente com células não infectadas foram semeadas em 3 replica em uma placa de 6 poços . A viabilidade celular foi determinada em 24 pontos de tempo de horas durante 4 dias consecutivos por contagem das células, utilizando Beckman Coulter Vi-celular de células automatizado Analisador Viabilidade após coloração do corante azul de tripano. A percentagem de viabilidade celular foi representada graficamente para cada linha de células de leituras obtidas no dia 4 em relação ao dia 1.

agar mole independente de ancoragem ensaio de crescimento

Para os ensaios de agar mole, 2 × 10

4 células NSCLC expressam SH

FGFR1

e SH

GFP foram suspensos numa camada superior de RPMI1640 contendo 10% de soro de vitelo e 0,4% de agar Select (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos da América) e plaqueadas sobre uma camada inferior de RPMI1640 contendo 10% de soro de vitelo e 0,5% de agar em Selecionar uma placa de 6 poços. PD173074 ou FIIN-1 [55] foi adicionada como descrito para o ágar de topo. Após 3-5 semanas de incubação colónias foram contadas em triplicado. IC50 foram determinados por regressão não linear usando Prism 5 software (GraphPad Software).

Os ensaios de citotoxicidade

Dependendo das curvas de crescimento para cada linha de células, entre 800 e 2000 células NSCLC foram semeadas em 6 réplicas 96- em placa bem. Um dia após o plaqueamento, o aumento das doses de inibidores de FGFR PD173074 ou FIIN-1 foram adicionados e a proliferação de células foi determinada 4 dias mais tarde utilizando o ensaio de WST-1 (Roche Applied Science). Cada ponto de dados representa a média de seis poços em replicado para cada linha celular tumoral e a concentração de inibidor. IC50 foram determinados por regressão não linear utilizando o software Graphpad Prism.

Western Blots

A proteína total foi extraído e separado por electroforese em gel de células por lise num tampão contendo Tris-HCl 50 (pH 7,4 ), NaCl 150 mM, EDTA 2,5 mM, 1% de Triton X-100, e 0,25% de IGEPAL. Os inibidores de protease (Roche Applied Science) e inibidores de fosfatase (Calbiochem) foram adicionados antes da utilização. Antes de carregar no gel, as amostras foram normalizadas para o teor total de proteína. Os lisados ​​de proteína total foram fervidas em tampão de amostra, separadas por SDS-PAGE em géis de poliacrilamida a 8%, transferidas para membrana de PVDF e sondadas durante a noite com os anticorpos primários apropriados. Os anticorpos utilizados para immunoblotting foram: anticorpo FGFR1 anti- (# 3472, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, Estados Unidos), fosfo anti- FRS2 Y436 (# 3861, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, Estados Unidos), anti-fosfo -FRS2 Y196 (# 3864, Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, Estados Unidos), anti-FRS2 (# sc-17841, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Estados Unidos). anticorpo monoclonal anti-WHSC1L1 (# SC-130009, Santa Cruz Biotechnology), anticorpo monoclonal anti-LETM2 (# ab84626, Abcam), e anticorpo monoclonal anti-actina (# sc-1615, Santa Cruz Biotechnology).

Análise estatística

As comparações entre dados de números de SNP cópia matriz para adenocarcinoma pulmonar (AC) e carcinoma de células escamosas (SCC) tumores foram realizadas utilizando o teste T exato de Fisher para calcular bicaudal valores de p entre as amostras que abrigam alto nível amplificação, definida como proporção log2 0,7 ou 3,25 de cópias de ADN normalizados. Os valores de P 0,05. Foram considerados significativos

Para determinar o IC50 para os inibidores de FGFR, as medições de viabilidade celular de seis repetições em diferentes concentrações dos inibidores foram normalizados para células de controlo não tratadas. As curvas de resposta a dose sigmoidal foram ajustadas aos dados por regressão não linear utilizando o software GraphPad Prism. desvios-padrão foram determinados para a média de cada valor usando um módulo embutido do software.

Para experiências shRNA, realizados em três repetições, o número de células foi contado e a média eo desvio-padrão foram determinados utilizando funções na Microsoft Excel.

resultados

FGFR1

é amplificado no cancro do pulmão de células não pequenas

Foi examinada a região 8p11-12 genómico utilizando matriz Affymetrix 250K SNP dados de número de cópias em um relatado anteriormente conjunto de 732 amostras de NSCLC, (628 tumores primários e 104 linhas de células) (Tabela S1) [16], [20], [45], [50], [52] de dados. Observou-se a amplificação de alto nível, definida como proporção log2 0,7 ou 3,25 de cópias de ADN normalizados, do segmento cromossómico 8p11-12 englobando o

FGFR1

locus 44 (6%) amostras de NSCLC (Figura 1A; Tabela S2). A maioria (93%; 41/44) destas amplificações foram eventos relativamente focais ( 50% do comprimento do cromossoma 8p) indicando selecção preferencial dos genes-alvo específicos dentro da região de amplificação [52]. O número de cópias inferida das amplificações, normalizada para um número de cópias de 2 para cada amostra, variando de 3,25 a 25 cópias (mediana = 2,8 cópias). A extensão estimada da região de amplificações focais variaram de 0,47 a 112,7 Mb (mediana = 2,74 Mb)

(A) Copiar número estima em cromossomo 8p11-12q braço por 44 amostras de NSCLC (colunas;. Ordenados por amplificação de 8p11) tendo amplificação maior do que 3,25 de cópias (razão de 0,7 log2) a partir de um conjunto de 732 amostras primários e linhas celulares de NSCLC. A linha horizontal indica a região contendo

FGFR1,

LETM2

e

WHSC1L1

genes. A escala de cores varia de azul (supressão) ao vermelho (amplificação) com números de cópias estimados mostrados. regiões cinzentas representam ausência de dados no número de cópias do SNP. (B) Gráfico de barras que descreve percentagens de amostras abrigando 8p11-12 amplificação em adenocarcinomas do pulmão (AC) e carcinoma de células escamosas (SCC) demonstra que

FGFR1

amplificação é observada em SCC em muito maior frequência do que AC. (C) a expressão de FGFR1 (painel superior) mostra na dez células NSCLC; oito linhas de células portadores

FGFR1

amplificação de HCC1734, HCC95, NCI-H2444, Calu3, NCI-H2077, NCI-H1703, NCI-H1581 e NCI-H520 (indicado pela barra horizontal vermelha abaixo) -ona células NSCLC linha de abrigar supressão do HCC15 região (indicado pela barra azul horizontal abaixo) – e três células NSCLC sem amplificação-A427, NCI-H226, NCI-H2170 (indicado pela barra horizontal preta abaixo) – utilizando actina como um controlo de carga (mostrado no painel inferior).

FGFR1

status de número de cópias e 8p11-12 comprimento amplicon determinada pela matriz SNP é indicado abaixo células portadoras de amplificação. De nota, NCI-H2077 e NCI-1581 foram encontrados para ser genotipicamente idênticos por fingerprinting análise.

Para identificar regiões de significativa copy-número de alteração, foi aplicado GISTIC (Genomic identificação de alvos significativos no cancro ) [53], e identificou uma região de 170 Kb em 8p11 (38,28-38,45 Mb) como significativamente amplificado. Embora o padrão geral de 8p11 amplificação foi consistente com a literatura sobre o cancro do pulmão como relatado, o nosso tamanho e resolução de exemplo fornecido mais poder para identificar e localizar tanto em grande escala e alterações cromossômicas focais com precisão em comparação com relatórios anteriores [45], [52 ]. Os únicos genes dentro da região de amplificação identificados em nossa análise em todas as amostras foram

FGFR1

e

LETM2

. Em nossos dados de número de cópias,

WHSC1L1

foi geralmente amplificado com

FGFR1

e

LETM2

(41/44 amostras), mas o todo

WHSC1L1

gene fez não se inserem no pico GISTIC (CHR8: 38,284,229-38,451,475). Especificamente, três amostras de tumores primários com amplificada

FGFR1

e

LETM2

genes tinham pontos de interrupção amplicon dentro

WHSC1L1

, explicando a exclusão de

WHSC1L1

do GISTIC pico de amplificação (Figura S1; Figura S2). Os pontos de interrupção dentro amplicon

WHSC1L1

são consistentes com a falta de amplificação do domínio funcional SET (CHR8: 38,265,630-38,255,125) associada com a actividade enzimática da histona metiltransferase do produto do gene [56]. Estes resultados não excluem

WHSC1L1

como alvo de amplificação em 8p11 juntamente com

FGFR1

mas sugerem que a sua actividade histona metiltransferase não é susceptível de ser especificamente orientadas para a amplificação.

na comparação subtipos de tumores NSCLC primárias e linhas celulares, 3,4% (20/588) de adenocarcinomas e 21% (12/57) dos carcinomas de células escamosas abrigavam 8p11 amplificações, indicando que, enquanto 8p11 é amplificado em frequências apreciáveis ​​em ambos grande NSCLC subtipos, é preferencialmente amplificado em CCEs (

p Art 0,001, teste exato de Fisher) (Figura 1b). Não foram observadas correlações significativas entre a presença de 8p11 amplificações e parâmetros clínicos disponíveis, incluindo histologia, grau de diferenciação histológica, palco do ressecção cirúrgica dos tumores e da idade, sexo ou etnia relatou dos pacientes (Tabela S3). Além disso, a sequenciação dirigida do domínio quinase de

FGFR1 em 52 linhas de células NSCLC e de toda a

FGFR1

sequência codificadora em três linhas celulares (NCI-H1581, NCI-H1703, NCI-H2170 ) não revelou nenhuma evidência de mutações no domínio quinase (dados não mostrados).

Os dados da matriz SNP revelou um elevado

FGFR1

número de cópias do gene em 11 linhas de células NSCLC de 104 linhagens de células NSCLC analisados ​​(Figura S3) com amplificações observadas em 36% (4/11) de linhas de células escamosas NSCLC ensaiadas. Nós examinamos a expressão da proteína FGFR1 por análise de imunotransferência em 8 linhas primárias de células NSCLC que abrigam focal ou ampla 8p11 amplificação acima de um rácio de log2 de 1,6 ou 6,0 cópias de DNA normalizadas (NCI-H1703, NCI-H2444, NCI-H520, NCI-1581, NCH -H2077, Calu3, NCI-H1734, e HCC 95), 3, que tem aproximadamente neutro

FGFR1

número de cópia (NCI-2170, NCI-H226 e A427) e 3 que abrigam

FGFR1

deleção (NCI-H1781, NCI-H1563 e HCC15) por análise de imunotransferência. Encontramos 6 de 8

FGFR1

amplificados linhas de células NSCLC superexpressarem FGFR1, em comparação com linhagens de células que não abrigam amplificação, com as exceções das células Calu3 NCI-H1703 e (Figura S4; Figura 1c). Consistente com este achado, NCI-H1703, que abriga uma amplificação 8p11, demonstrou não ser dependente de

FGFR1

[44], mas em amplificado

PDGFRA

[19], [20] . Além disso, observou-se um elevado nível de fosforilação da FRS2 substrato FGFR1 em NCI-H1581 células grande carcinoma de células que transportam amplificação focal de

FGFR1

, mas não em células contendo níveis relativamente mais amplas de

FGFR1

amplificação (Figura S4).

FGFR1

é necessário para a sobrevivência de uma linha de células NSCLC abrigar amplificação focal

com base em nossa análise do número de cópias,

FGFR1

e

LETM2

caiu dentro da região definida pelo GISTIC da amplificação estatisticamente significativa com a

WHSC11

imediatamente adjacente. Para determinar a exigência de celular para genes da região-alvo da amplificação, avaliou-se a exigência de

WHSC1L1

,

LETM2

e

expressão FGFR1 Compra de manutenção do tumor, esgotando-los individualmente usando shRNA. A transfecção com construções de direccionamento cinco shRNA quer

WHSC1L1

ou

LETM2

não teve nenhum efeito diferencial sobre a sobrevivência de células que abrigam focal ou 8p11-12 ampla amplificação em comparação com células de controlo sem a amplificação (dados não mostrado).

em contraste, três dos cinco shRNA construções de direccionamento

FGFR1

, todos os quais levaram a uma diminuição de 3 a 5 vezes nos níveis de proteína em relação aos controlos FGFR1 shRNA (Figura 2a), sobrevivência celular significativamente inibida em uma linha de células NSCLC transportando um focal

FGFR1

amplificação (NCI-H1581; Figura 2B). shRNA constrói # 3 e # 4, que não levam a knockdown significativa dos níveis de proteína FGFR1, não afecta a sobrevivência de células que abrigam 8p11 amplificação (Figura 2b). Não houve efeitos de sobrevivência observada de

FGFR1

shRNA em linhas de células portadores relativamente mais amplo

FGFR1

amplificação (NCI-H1703, HCC95, HCC1734, Calu3; não mostrado) ou sem

FGFR1

a amplificação (NCI-H2170;. A figura 2c HCC15, NCI-H1563 e NCI-H1781; não mostrado). No geral, estes resultados argumentam que

FGFR1

expressão é necessária para a viabilidade da linha de células de pelo menos um NSCLC transportando um

FGFR1

amplificação.

(A) Efeitos de cinco

FGFR1

shRNA constrói sobre a expressão da proteína de FGFR1 em células NCI-H1581, tal como testado por imunotransf erência. shRNAs # 1, # 2 e # 5 eficientemente derrubar expressão FGFR1 endógena em células NCI-H1581 infectadas com shRNA expressando lentivírus enquanto shRNAs # 3 e # 4 não. A actina é mostrado como um controlo de carga (painel inferior).

(B Comprar e

C)

, a infecção com três grampos independentes de supressão FGFR1 (# 1, # 2 e # 5) inibe a sobrevivência das células NCI-H1581 sobre expressando

FGFR1

(B), mas não inibiu a sobrevivência de células não abrigando

FGFR1

amplificação, NCI-H2170 (C) tal como avaliado por ensaio de WST. NI, nenhuma infecção. shGFP, controlar específica hairpin para a proteína verde fluorescente utilizado como controle negativo. Todos os resultados normalizados para a sobrevivência de células infectadas com shGFP.

Para validar adicionalmente a especificidade de mudanças de viabilidade celular associada a induzida por shRNA FGFR1-esgotamento, examinamos a capacidade de expressão ectópica de

FGFR1

cDNA para resgatar os efeitos do FGFR1 derrubar. De tipo selvagem

FGFR1

ADNc, sem a região 3 ‘não traduzida (UTR) do ARNm de FGFR1 endógeno alvo de FGFR1 shRNA # 1, foi sobre-expresso em células NCI-H1581 transfectadas com esta construção shRNA. níveis reconstituídos de proteína FGFR1 tipo selvagem resultou no resgate significativa do fenótipo inibição da sobrevivência (Figura 3a, c), mas não teve impacto sobre o

FGFR1

células NCI-H2170 independentes (Figura 3b). Coletivamente, estas experiências implicam

FGFR1

como um alvo oncogênico crítica de 8p11-12 amplificação.

(A) Gráfico de barras para ensaio de resgate. Letalidade devido aos níveis esgotados no nível FGFR1 endógeno em NCI-H1581 é resgatado por mais de expressão do tipo selvagem (WT) comprimento total

FGFR1

sequência de codificação. (B) Sem efeito sobre a sobrevivência das células NCI-H2170 foi observada devido ao excesso de expressão de forma tipo selvagem do FGFR1. NCI-H2170 não é dependente da actividade de FGFR1. NI, nenhuma infecção. shGFP, controlar específica hairpin para a proteína verde fluorescente utilizado como controle negativo. Todos os resultados são normalizados para a sobrevivência de células infectadas com shGFP. Os dados mostrados são como média de três réplicas. (C) Validação de resgate FGFR1 por immunoblotting. níveis esgotados de nível FGFR1 endógena em células NCI-H1581 infectadas com o

FGFR1

shRNA expressando lentivírus visando o FGFR1 3’UTR (pista 1) é resgatado por superexpressão de forma tipo selvagem do cDNA FGFR1 falta 3’UTR (pista 2) com resgate modesto concomitante na fosforilação de resíduos tirosina níveis de substrato FGFR1 FRS2 (painel do meio) a. A actina é mostrado como um controlo de carga (painel inferior).

Interessantemente, uma linha de células NSCLC transportando um focal

FGFR1

amplificação, NCI-H2444 (Figura S3), não era sensível para knockdown de FGFR1 (dados não mostrados). Esta linha celular alberga também um activador

KRAS

mutação G12V [57], [58], a qual está associada com a resistência dos cancros colo-rectais para a terapia dirigida cetuximab-EGFR [25]. O NCI-H2444 não mostram fosforilação FRS2 (Figura S4). Esta observação sugere que a co-ocorrência de outros oncogenes activação pode aliviar

FGFR1

dependência e, especificamente, que a resistência primária à inibição FGFR1 podem ser regidos por

KRAS

estado de mutação.

FGFR quinase Inibidores inibe o crescimento de

FGFR1

células NSCLC amplificados

Para avaliar a possibilidade de que a segmentação

FGFR1

em 8p11 CCEs amplificados poderia representar uma nova estratégia terapêutica em CCEs, estudamos a PD173074 efeitos do inibidor da pan-FGFR em linhas celulares de NSCLC. O

FGFR1

células NCI-H1581 -amplified eram sensíveis ao tratamento com PD173074, tal como testado pela formação de colónias em agar mole com IC

50s no intervalo de 10-20 nM (Figura 4A e Figura S5). Em contraste, as células NCI-H2170 com tipo selvagem

FGFR1

número de cópias eram insensíveis à PD173074 (Figura 4a). Nós também realizada curvas de dose resposta PD173074 sobre a sobrevivência das células em cultura líquida para comparar a sensibilidade das células que albergam

FGFR1

amplificação e aqueles sem novamente e descobriram que as células NCI-H1581 foram sacrificados aos valores de IC50 de 14 nM, enquanto que aqueles sem amplificação necessário mais do que 100 vezes superior doses mais elevadas de PD173074 para inibir a proliferação (Figura 4b). De acordo com estes resultados, observamos também que uma segunda FGFR inibidor irreversível, FIIN-1, inibe a proliferação de células NCI-H1581 com focal

FGFR1

amplificação, em comparação com NCI-H2170 sem

FGFR1

amplificação, com valores de IC50 de 2,5 nM em comparação com maior do que 10 micromolar, respectivamente (Figura S6).

(a) o tratamento com as concentrações indicadas de inibidor PD173074 pan FGFR inibiram a formação de colónias em agar mole por NCI-H1581 linhas celulares de NSCLC ancorando

FGFR1

amplificação, em comparação com a linha NCI-H2170, que não abriga

FGFR1

amplificação. As colónias foram fotografadas e quantificadas após 4 semanas. (B) Tratamento com as concentrações indicadas de inibido PD173074 sobrevivência de células NCI-H1581, mas não de células NCI-H2170, como determinado por ensaio de WST realizada após 4 dias de tratamento. IC50 são indicados.

Discussão

Aqui nós mostramos que

FGFR1

é frequentemente amplificados em carcinomas pulmonares e que essa amplificação é enriquecido em CCEs pulmonares. linha celular de, pelo menos, um NSCLC com focalmente amplificados

FGFR1

requer o gene como demonstrado pela depleção shRNA, e também é sensível à inibição com os inibidores da quinase de FGFR.

outros genes de

FGFR1

têm sido propostos para ser o alvo funcional da amplificação sobre segmento de cromossomo 8p11-8p12, mais notavelmente

WHSC1L1

[44] e

BRF2

[21]. No entanto, acreditamos que a evidência apresentada aqui, assim como em um relatório recente [22] defende

FGFR1

como o alvo funcional de amplificação em pelo menos uma linha de células NSCLC. Além disso, em definir os nossos dados

WHSC1L1

não é amplificado em todos os

FGFR1

amostras amplificadas, argumentando que é pouco provável que seja o único gene amplificado relevante no 8p11-12 amplicon. A linha de células que foi mostrado para exigir

WHSC1L1

para a sua sobrevivência, NCI-H1703 [44], não sobre-expresso FGFR1 (Figura 1c), não mostra fosforilação FRS2 (Figura S4) e é dependente outro oncogene tirosina quinase amplificada,

PDGFRA

[19], [20]. Em contraste, o knockdown de

WHSC1L1

não teve impacto sobre

FGFR1

,

FGFR1

-expressing células NCI-H1581 -amplified, sugerindo que a amplificação de qualquer gene pode contribuir para celular transformação no contexto celular apropriada.

um estudo recente caracterizar a amplificação de ADN em NSCLC sugeriu que

BRF2

, que codifica um complexo de iniciação da transcrição da subunidade da polimerase III de ARN, o alvo é de amplificação na 8p11 amplicão [21]. Nós comparamos

FGFR1

amplificação para

BRF2

amplificação à luz deste relatório e descobriu que de 12 amostras com a maior amplificação do

FGFR1

em nosso conjunto de dados (razão log2