Abstract

terapia antiangiogênica é importante para o tratamento de câncer ginecológico. No entanto, o benefício terapêutico obtido a partir destes tratamentos é transiente, predominantemente devido à activação selectiva de vias pró-angiogénico compensatórias que conduzem a um rápido desenvolvimento de resistência. Nós teve como objetivo identificar e alvo potencial alternativa sinalização à terapia anti-vascular fator de crescimento endotelial (VEGF), com vistas ao desenvolvimento de uma combinação de agentes anti-angiogénicos para proporcionar benefícios terapêuticos ampliados. Desenvolvemos um

in vivo

modelo de resistência fenotípica pré-clínico de câncer de ovário resistentes à terapia antiangiogênica. Medimos as alterações dinâmicas quimiocinas secretadas e sinalização angiogénica em tumores e no plasma em resposta a um tratamento anti-VEGF, tal como tumores avançados a partir da fase inicial responsivo a doença progressiva. Em tumores que progrediram seguinte níveis de tratamento sorafenib, expressão gênica e protéica de quimiocinas CXC pró-angiogénico e seus receptores foram significativamente elevados, em comparação com tumores responsivos. A quimiocina (C-X-C motivo) ligando 8 (CXCL8), também conhecida como interleucina-8 (IL-8) aumento era dependente do tempo e coincidiram com a dinâmica de progressão tumoral. Usamos SB225002, um inibidor farmacológico da quimiocina (motivo CXC) receptor 2 (CXCR2), para interromper as funções mediadas por quimiocinas CXC de células de cancro do ovário em

in vitro

ensaios de inibição do crescimento celular, formação esferóide, e migração celular. A combinação de inibidor de CXCR2 com sorafenib levou a uma inibição sinérgica do crescimento das células

in vitro

e progressão tumoral ainda mais estabilizada seguinte sorafenib

in vivo

. Os nossos resultados sugerem que as quimiocinas mediada por CXCR2 podem representar uma via compensatória importante que promove a resistência à terapia anti-angiogénico no cancro do ovário. Assim, o bloqueio simultâneo desta via de citocinas pró-angiogénico uso de inibidores de CXCR2 e o receptor de VEGF (VEGFR) via poderia melhorar os resultados da terapia antiangiogênica

Citation:. Devapatla B, Sharma A, Woo S (2015) CXCR2 Inibição Combinada com sorafenib antitumoral melhorada e resposta antiangiogênico em modelos pré-clínicos de cancro do ovário. PLoS ONE 10 (9): e0139237. doi: 10.1371 /journal.pone.0139237

editor: Domenico Ribatti, Universidade de Bari Medical School, ITALY

Recebido: 10 de junho de 2015; Aceito: 10 de setembro de 2015; Publicação: 28 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Devapatla et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Research informou nesta publicação foi apoiada pelos Institutos Nacionais de Ciências Médicas gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número P20GM103639. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a principal causa de morte por câncer ginecológico em os EUA Quando tratados com quimioterapia padrão atual de atendimento, a taxa de sobrevivência de cinco anos de doença avançada permanece baixa. tumores ovarianos são ricamente vascularizada; existe uma correlação entre a contagem microvascular e agressividade biológica [1, 2]. A angiogénese desempenha um papel central na tanto a função normal do ovário e para o desenvolvimento e progressão do cancro do ovário [3]. Tumor angiogénese é crítica para o desenvolvimento de ascites e metástases do cancro do ovário na cavidade peritoneal [4]. Como a angiogénese é um passo crítico na propagação do crescimento do tumor maligno e metástase [5], a angiogénese é um alvo válido no tratamento do cancro [6] ovário. Múltiplos factores pró-angiogénico promover o processo de formação de vasos com o VEGF como um actor central em tumor angiogénese mediada [5]. Um certo número de agentes anti-angiogénicos, incluindo o anticorpo terapêutico contra VEGF bevacizumab e inibidores de quinase multi-alvo de receptores de VEGF (VEGFR), têm sido activamente investigado ou estão em desenvolvimento como tratamentos para a doença avançada. O tratamento com bevacizumab, permite um benefício de sobrevivência livre de progressão (SLP) no cancro avançado do ovário, quando administrado em combinação com quimioterapia [7, 8]. Vários inibidores de VEGFR-segmentação multi-cinase, tais como nintedanib, trebananib, pazopanib, sunitinib, sorafenib, cediranib foram testados em várias fases de ensaios clínicos de cancro do ovário [9]. Alguns destes agentes, incluindo pazopanib, nintedanib, cediranib e trebananib, foram avaliadas na Fase III de ensaios clínicos randomizados, e todos têm demonstrado uma sobrevida livre de progressão (PFS) benefício [10]. No entanto, o benefício terapêutico da terapia anti-VEGF é de curta duração. a progressão do tumor é eventualmente restaurada após uma resposta inicial, indicando resistência emergente. Compreender os mecanismos de escape do tumor da terapia anti-VEGF é crucial para encontrar estratégias para contornar a resistência. Vários mecanismos estão envolvidos na resistência adquirida à terapia anti-VEGF, incluindo a activação de vias alternativas para contornar a inibição do VEGF, retomando assim a angiogénese de tumores e o crescimento de tumores [11]. Assim, combinando as terapias anti-angiogénicos diferentes pode ser uma estratégia para fornecer benefícios terapêuticos duradoura.

Muitos factores de crescimento que estão envolvidas na invasão do cancro do ovário também são importantes na sua angiogénese [4]. quimioquinas inflamatórias desempenham um papel importante na angiogénese e a progressão de cancro do ovário. As interacções entre as quimiocinas produzidas pelas células de cancro do ovário e receptores de quimiocina expressas por células endoteliais e o microambiente do tumor promover o crescimento do tumor, estimulando a angiogénese e o aumento da migração, invasão e proliferação celular [12-14]. Entre os sub-grupos de quimioquinas, as quimioquinas CXC com o ácido 3-amino (Glu-Leu-Arg /ELR) motivo (ELR

+), incluindo CXCL1, 2, e 3 (GRO-α, β e γ), CXCL5 , CXCL6, CXCL7, e CXCL8 (IL-8), são reguladores potentes da angiogese e medeiam a sua actividade angiogénica através do receptor de quimiocina CXCR2 [14]. Superexpressão das quimiocinas pró-angiogénico e CXCR2 foi correlacionada com mau prognóstico em pacientes com câncer de ovário [12, 15-17]. Assim, ELR

+ CXC vias de quimiocinas pró-angiogénico são uma alternativa potencial para promover a angiogênese em tumores ovarianos.

Para identificar estratégias eficazes para contornar o mecanismo pelo qual o câncer de ovário ignora a terapia anti-VEGF, geramos um xenoenxerto modelo de resistência terapia antiangiogênica que imita resistência clínica ao câncer de ovário. Foram identificadas alterações na citoquina e vias angiogénicos em tumores resistentes a terapias anti-angiogénicas, como tumores progrediu desde a fase inicial responde à fase refractário. Nosso

in vitro

e

In vivo

resultados indicaram que a co-alvo o eixo de citocinas pró-angiogénico CXCR2 com a inibição anti-VEGF é uma estratégia eficaz para proporcionar benefícios terapêuticos ampliados em modelos pré-clínicos de ovário câncer.

Materiais e Métodos

células e reagentes

a linha de células de cancro do ovário SKOV-3 foi obtida a partir da American Type Culture Collection. A2780 e OVCAR429 células de câncer de ovário foram gentilmente cedidas pelo Dr. Danny Dhanasekharan (Cancer Center Stephenson, OUHSC). A linha celular de cancro do ovário A2780 foi inicialmente obtida a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). OVCAR429 são células de cancro do ovário que foram anteriormente publicados [18, 19]. A2780 e OVCAR429 células foram mantidas em meio RPMI (Invitrogen). As células SKOV-3 foram mantidas em meio de McCoy 5A (Invitrogen). Os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen), 100 UI /mL de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen) a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO

2. As células humanas umbilical veia endoteliais (HUVECs) e meios de células endoteliais foram adquiridos a partir de aplicativos celulares (San Diego, CA). Sorafenib foi obtido a partir de laboratórios LC (Woburn, MA). SB225002 (

N

– (2-hidroxi-4-nitrofenil) –

N

‘- (2-bromofenil) ureia) é um inibidor não-peptídico potente e selectivo de CXCR2 (IL 8R) do receptor de quimiocina. SB225002 foi obtido a partir de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). preparações medicamentosas para sorafenib e SB225002 foram realizadas de acordo com os métodos descritos em outros lugares [20, 21].

Animais e tratamento da toxicodependência

Seis semanas de idade do sexo feminino atímicos

nu /nu

ratinhos nus foram adquiridos a Charles River Laboratories, Inc., através de NCI (Frederick, MD). Todos os procedimentos envolvendo ratos foram realizadas de acordo com as orientações do Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC), eo protocolo foi aprovado pela Universidade de Oklahoma Centro de Ciências da Saúde (OUHSC) Institutional Animal Care e Use Committee (número de protocolo: 12-154-H). Os ratinhos receberam injecções subcutâneas de 5 × 10

6 células SKOV-3 no flanco direito. O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana utilizando calibradores digitais (Mitutoyo), com uma precisão de ± 0,02 milímetro. O volume do tumor foi calculado como 4/3 π comprimento x largura x altura. Os ratinhos foram tratados com solução salina ou sorafenib quando os tumores atingiram cerca de 80 milímetros

3 em volume de, 32 dias após a implantação de células de tumor. Sorafenib foi administrado diariamente por sonda oral a uma dose de 30 mg /kg. O tratamento foi continuado até que os tumores cresceram a 20 mm (o máximo permitido por crescimento IACUC), altura em que os ratinhos foram sacrificados. tumores de xenoenxerto que aumentou menos do que 50% do volume inicial do tumor no início do tratamento foram considerados tratamento responsivo, como esta mostrou uma tendência a longo prazo para a estase do tumor [22]. Os tumores que progrediram com uma tendência de longo prazo para o crescimento continuado após uma resposta inicial ao tratamento foram consideradas para exibir fenotípica emergente a resistência ao tratamento. Em vários pontos de tempo, foi utilizado punção retro-orbital para recolher cerca de 30 ul de sangue em tubos contendo EDTA para determinar os perfis de tempo de circulação de citocinas e factores angiogénicos. Os animais foram anestesiados antes da recolha de sangue retro-orbital usando 2% de isoflurano em uma câmara de inalação regulada com um vaporizador calibrado. Os ratinhos foram monitorizados diariamente e sacrificados logo que havia alguma evidência de que o rato estava na dor do tumor ou fármacos ou se o peso do tumor atingiu 20 mm. Os pontos finais de eutanásia precoce incluem toxicidade moderada ou grave, incluindo a rápida perda de peso superior a 10% do peso corporal, perda de peso gradual de mais do que 15%, fraqueza, não responsividade, dificuldades respiratórias, sinais neurológicos anormais graves, hemorragia, trauma ou a incapacidade de comer ou beber. Após as oito semanas de tratamento com drogas, todos os ratinhos foram sacrificados utilizando CO

2 asfixia e autopsiados. tecidos do sangue e do tumor foram recolhidas para as análises abaixo descritas. O plasma foi isolado e armazenado a -80 ° C até à análise.

Para o

In vivo

combinação estudo, SKOV-3 xenoenxertos foram tratados com 30 mg /kg /dia até sorafenib o surgimento de resistência fenotípica como definido acima. animais Sorafenib-resistentes foram distribuídos aleatoriamente em três grupos para receber sorafenib, SB225002, ou a combinação dos sorafenib e SB225002. SB225002 foi administrado uma vez por dia por injecção intraperitoneal (IP), a uma dose de 10 mg /kg. grupo de tratamento combinação diária recebeu uma dose oral de 30 mg /kg sorafenib mais 10 mg /kg de SB225002 (IP) até ao final do estudo.

citocinas e factor de crescimento angiogénico ensaio multiplex

realizado um ensaio multiplex para identificar as mudanças nos níveis de fatores de crescimento angiogênicos circulantes em animais sensíveis ao tratamento e resistente. As concentrações plasmáticas de proteínas de crescimento tumor-estroma e /-emanando hospedeiras angiogénicos foram determinados separadamente usando (Millipore, cat # MAGPMAG-24K) angiogênese /fator de crescimento painéis grânulo magnético humana (Millipore, cat # HAGP1MAG-12K) e rato, respectivamente. Um total de factores angiogénicos solúveis humanos 17 e 24 de ratinho foram quantificados. Uma lista de analitos quantificados é fornecido nos métodos de apoio (S1 Arquivo). Os níveis solúveis de CXC quimiocinas CXCL1, 2, 5 e 6 em amostras de plasma de rato foram determinados por meio de um ensaio multiplex (Bio-Rad, cat # 171- AK99MR2).

ensaio de inibição de crescimento

In vitro

inibição do crescimento celular foi medida através de ensaio de MTS (Promega). Resumidamente, 5 x 10

3 HUVEC ou células SKOV-3 foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas durante a noite. Adicionamos várias concentrações compreendidas entre 0,01 e 100 uM de sorafenib ou SB225002 de 100 ul de meio fresco e incubaram-se as células durante o tempo indicado. Nós adicionado 20 ul de CellTiter 96 Aqueous One reagente solução e incubou-se as células durante 1 hora. A absorvância foi medida a 450 nm. A viabilidade celular foi calculada em relação aos controlos (células tratadas com o veículo sozinho). Médias de três réplicas por amostra foram utilizados para análise.

Os efeitos combinados de sorafenib e SB225002 foram determinados utilizando várias células de cancro do ovário e HUVECs. IC

50 valores foram determinados para ambas as drogas com cada linha de células. A concentração de topo da combinação foi preparada por mistura do sorafenib e SB225002 em 1: 2 proporção da sua IC

50 para as células de cancro do ovário e 1: 1 razão de HUVEC com base na sua IC

50 valores. Diluição em Série (3x) foi levada a cabo a partir da concentração de topo para obter um total de 5 diluições (

N

= 3 repetições). As células (5000 células /poço) foram então incubados a 37 ° C durante 48 horas. A sobrevivência celular foi estudada utilizando um ensaio de MTS como descrito acima. A natureza dos efeitos combinatórios das duas drogas foi determinada pelo cálculo do índice de combinação (IC) de valores, que se caracteriza por sinergia (CI 1), aditividade (IC = 1), ou antagonismo (CI 1), usando CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK).

tubo de ensaio de formação de Angiogenesis

Crescimento reduzido fator matriz Matrigel (Corning) foi descongelado a 4 ° C durante a noite e, em seguida, fundo revestido em uma de 96 poços placa (50 uL por poço), a 37 ° C durante 30 minutos. Em seguida, 100 ul de meio contendo células HUVEC (10.000 células), com ou sem sorafenib, SB225002 e foi adicionado a cada cavidade na parte superior da matriz Matrigel solidificou e incubou-se a 37 ° C durante 16 horas. Os poços foram fixados em paraformaldeído a 4% e redes foram fotografadas usando um microscópio de contraste de fase. Para a quantificação de redes, o software utilizado foi WimTube (Wimasis).

Transwell ensaio de migração

Os ensaios de migração de células foram realizados utilizando inserções de 8 mícrons de poros Transwell (Corning) como previamente descrito [23 ]. Para as câmaras inferiores, foram adicionados 500 ul de meio de crescimento endotelial. Alíquotas de 2 x 10

4 HUVEC em 200 ul de meio basal endotelial foram semeadas em câmaras superiores. Ambas as câmaras superiores e inferiores contido sorafenib ou SB225002 nas concentrações indicadas. Após o ensaio decorreu durante 24 horas a 37 ° C, as células que não migraram foram removidos a partir da superfície superior do filtro, utilizando compressas de algodão. As células na superfície inferior da membrana foram fixadas com metanol gelado e coradas com violeta de cristal. As células foram contadas sob um microscópio óptico (× 40).

Spheroid ensaio

SKOV-3 esferóides de células foram cultivadas pelo método de sobreposição de líquido [24]. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com agarose contendo 200 ul de meio (2000 células /poço). As células foram incubadas durante 72 horas, até os esferóides formado. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de sorafenib ou SB225002. A cada dois dias, substituímos 100 mL de meio de idade com meio fresco e drogas. Os esferóides foram monitorizados durante até 10 dias. Os tamanhos de esferóides foram medidas utilizando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).

A imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica (IHC) quantificação dos dados é descrito nos métodos de apoio ( ficheiro S1). Utilizou-se anticorpos específicos para CD-31 (Abcam, cat # ab28364) e Ki-67 (Abcam, gato ab16667 #) para determinar a densidade microvascular e proliferação de células tumorais, respectivamente. A expressão total de CXCR2 em células tumorais e estroma foi determinada em tumores de xenoenxerto de ratinho com o anticorpo anti-CXCR2 (Abcam, cat # ab14935).

expressão gênica de ELR

+ CXC quimiocinas

sequenciamento do transcriptoma foi realizada utilizando o sequenciador Illumina MiSeq e kit e protocolos (Illumina, Inc.) a preparação da amostra Illumina TruSeq RNA v2. preparação de amostras e construção da biblioteca é descrita nos métodos de apoio (S1 Arquivo).

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas com média ± desvio padrão (SD) valores usando o teste t de Student, a menos de outra forma constatado. A significância estatística foi fixado em

P Art 0,05. dados combinação da droga foi analisado por software CalcuSyn utilizando o método do efeito mediano de Chou e Talalay [25]. dados de imunohistoquímica foi analisada utilizando software ImageJ. Breves metodologias são dadas nos dados de apoio. Usamos software GeneSifter (Geospiza, Inc.) para analisar os dados de nossos estudos de expressão gênica em tumores de xenoenxerto.

Resultados

In vivo

resistência tumor fenotípica ao tratamento antiangiogênico

observada inibição do crescimento tumoral até três semanas de tratamento com sorafenib (Fig 1A). Após este período inicial responsivo, alguns tumores começaram a progredir, como evidenciado pelo aumento do tamanho do tumor, apesar do tratamento continuado. Durante o período de tratamento de dois meses, 10 dos 19 (53%) de xenoenxerto de murganhos mostraram a progressão do tumor e recrescimento. Nenhum dos ratinhos ficou doente ou morto antes do ponto final experimental. Os dados da coloração IHC revelou o assinatura resistente a antiangiogénico típica nos tecidos de tumor (Figura 1B). densidade dos vasos do tumor (CD-31), e a proliferação celular (Ki-67) foram significativamente maiores (2-4 vezes,

P

0,05) em tumores que progrediram a partir do tratamento do que em tumores sensíveis (Fig 1C), o que sugere que os tumores progressivos foram capazes de retomar a angiogénese e assim recrescimento do tumor.

a) SKOV-3 xenoenxertos foram tratadas durante oito semanas com 30 mg /kg sorafenib através de sonda oral diariamente. Os controlos foram tratados com o veículo de tratamento sozinho. Os volumes dos tumores foram medidos duas vezes por semana e são representados como mm

3 ± SEM. Dos 19 ratos, 10 desenvolveram resistência ao tratamento sorafenib. linhas pretas, vermelhas e verdes indicam as médias progressões volume do tumor de controle, SR e ratos SS, respectivamente. Uma diferença significativa no volume do tumor (*

P

0,05) foi observada entre os grupos sensíveis e resistentes-tratamento, a partir de cinco semanas de tratamento. SS = sensível ao sorafenib; e SR = sorafenib-resistente. B) imunocoloração Representante para CD-31 (linha superior) e Ki-67 (linha de fundo) no controle, (SS) sensível ao sorafenib, e tumores de sorafenib resistente (RS). C) densidade de vasos (CD-31) e índice de proliferação (Ki-67) foram significativamente aumentados em tumores de sorafenib resistente em comparação com os tumores sensíveis ao sorafenib.

As mudanças dinâmicas circulantes de fatores angiogênicos em resposta a anti-VEGF tratamento

para identificar as alterações na sinalização angiogênico e citocina secretada, foram comparadas as concentrações circulantes de fator angiogênico em amostras de plasma obtidas de camundongos sensíveis ao tratamento e resistente. As amostras foram obtidas durante os respondedores (2-3 semanas após o tratamento) e as fases refractários (6-8 semanas após o tratamento). Uma vez que a vasculatura tumoral em xenoenxertos é formado por células progenitoras endoteliais de ratinho, utilizou-se painéis angiogénicos multiplex para ambos os ratos e os seres humanos, para distinguir a origem.

Durante as três primeiras semanas de tratamento, não houve diferenças significativas entre o As concentrações de proteínas angiogénicos em quaisquer grupos (Fig 2A). Quando a resistência fenotípica surgiu 6-8 semanas após o tratamento, as diferenças fator angiogênico foram evidentes entre os grupos. Vários factores angiogénicos originou-rato, incluindo o factor de crescimento de fibroblastos (FGF-2), factor de crescimento de hepatócitos (HGF), KC, e a prolactina, foram regulados positivamente no grupo sorafenib-resistentes, mas não no grupo sensível ao sorafenib (Fig 2A) . Durante a fase de refractário, CXCL8 secretado por tumores (IL-8) os níveis de aumento de 4 dobras (

P Art 0,05). Nos tumores de sorafenib resistente

A) Dobre mudanças na circulação de fatores angiogênicos entre grupos resistente ao tratamento e sensíveis durante o sensível (2-3 semanas) e as fases resistentes (6-8 semanas) em ratinhos tratados com sorafenib. Ambos rato (estroma) e (células tumorais) humana fatores angiogênicos solúveis foram quantificados por ensaio multiplex. fatores só angiogénicos que foram detectados tanto do mouse e matrizes humanos são representados como Log

2 mudanças vezes de resistente ao tratamento contra xenotransplantes sensível ao tratamento. Significativa (

P Art 0,05) alterações entre as fases sensíveis e resistentes são indicadas por um asterisco (*). B) Comparação dependente do tempo de plasma de concentração de IL-8 (pg /ml ± DP) entre resistente ao tratamento (SR) e sensível grupos (SS) de ratinhos tratados com sorafenib. perfis de tempo de IL-8 no plasma estavam de acordo com a progressão do tumor de tumores sensíveis e resistentes-fenotípicas. Durante o tratamento, foi recolhido plasma semanalmente pelo método de amostragem escalonada, e IL-8 foram medidos por ensaio multiplex. C) Análise Illumina seqüenciamento do ELR humana e mouse

+

CXC

expressão de genes de quimiocinas. ELR humana

+

CXC

análise de expressão gênica de quimiocinas mostraram que

CXCL6

expressão foi significativamente maior no grupo resistente (2,5 vezes superior,

P Art 0,05) do que no grupo sensível. Não foi observada diferença significativa entre os grupos sorafenib-sensíveis e resistentes para CXCL1, 2, 3, 4, 5, e 7 níveis de expressão. Rato ELR

+

CXC

análise de expressão gênica de quimiocinas mostraram que todas as citocinas indicadas, exceto

CXCL2

, foram significativamente maiores nos grupos resistentes ( 2 dobras,

P

0,05) do que os grupos sensíveis. SS = sensível ao sorafenib; e SR = sorafenib-resistente. concentrações D) CXC quimiocinas plasma (pg /ml) em SKOV-3 ratos de xenotransplante. CXCL1, CXCL2 e CXCL6 níveis foram significativamente (P

Art 0,05). Maiores nos grupos de sorafenib-resistentes do que em grupos sensíveis ao sorafenib

Nós também quantificados os níveis de IL-8 semanal para até oito semanas de tratamento sorafenib. Para até 4 semanas de administração sorafenib, não foram encontradas diferenças significativas em IL-8 nível entre os grupos sensíveis ao tratamento e resistentes (Fig 2B). Começando na semana cinco, significativamente elevados (

P

0,05) nos níveis de IL-8 foram observadas em tumores de sorafenib-resistente. Estes resultados indicam que a IL-8 níveis alterados dinamicamente ao longo do tempo, coincidente com o perfil do tempo de progressão tumoral. Em adição à IL-8, os dados do nosso estudo expressão do gene (Figura 2C) e ensaio multiplex citocina (Figura 2D) mostraram que a expressão de outro ELR

+ quimiocinas CXC (por exemplo, CXCL1, -2, -5, e – 6) foi elevada em tumores resistentes ao tratamento, em comparação com os seus homólogos.

expressão CXCR2 em tumores ovarianos

Nós realizadas coloração CXCR2 em tumores de xenoenxerto de tratamentos de sorafenib para comparar a sua expressão (Fig 3A) em grupos sensíveis e resistentes. expressão CXCR2 foi elevada em tumores resistentes em comparação com tumores sensíveis e de controlo. Observamos um aumento de três vezes em tumores resistentes em comparação com tumores sensíveis (

P Art 0,05, Fig 3B). No grupo de tratamento sorafenib

A) imunocoloração Representante para CXCR2 no controle, sorafenib- sensíveis (SS), e tumores de sorafenib resistente (RS). B) expressão CXCR2 foi elevada em tumores de sorafenib-resistente (

P

. 0,05) em comparação com tumores sensíveis ao sorafenib

In vitro

efeitos sinérgicos de sorafenib e SB225002

com base nas conclusões acima da regulação positiva da expressão de CXCR2 e múltipla ELR

+ CXC citoquinas pró-angiogénico que medeiam os seus efeitos angiogénicos via receptor CXCR2, investigamos os efeitos das citocinas mediada por CXCR2 usando SB225002, um inibidor de molécula pequena de receptor de quimiocina CXCR2 (IL-8R), em combinação com sorafenib

in vitro

. Nós escolhemos inibidores do receptor CXCR2 mais de anticorpos anti-quimiocinas CXC para evitar a função redundante de ELR

+ CXC sinalização quimiocinas. A combinação de sorafenib e SB225002 produziu inibição do crescimento significativamente maior (

P

0,005) em células tumorais e células HUVEC que fez qualquer um dos tratamentos sozinhos (Fig 4A e 4B). Os valores de IC em diferentes rácios de concentração em SKOV-3 (0,32-0,61) e HUVECs (0,87-1,1) indicou a sinergia ou aditividade entre SB225002 e sorafenib. IC

50 valores de sorafenib e SB225002 nas linhas celulares de cancro do ovário testadas e células HUVEC são fornecidos nos dados de apoio (S1 tabela). Curvas concentração-efeito do tratamento da combinação em comparação com o sorafenib sozinho são mostrados na Fig S1.

SB225002 aumentou significativamente os efeitos de inibição do crescimento de sorafenib sobre células SKOV-3 (A) e células HUVEC (B). A) Uma combinação de 10 uM sorafenib e 4 uM SB225002 sinergicamente inibiu o crescimento de células SKOV-3, em comparação com cada fármaco isoladamente (

P

0,005). B) Uma combinação de 4 sorafenib uM e 2 uM SB225002 sinergicamente inibiu o crescimento de células HUVEC, em comparação com cada fármaco isoladamente (

P

0,01). C) Imagens representativas de ensaio de formação do tubo de HUVECs tratadas com ou sem 1 SB225002? M ou 2? M sorafenib. formação do tubo foi analisado utilizando o software de análise Wimtube e o comprimento do tubo é apresentado em pixels. A adição de SB225002 sorafenib ao tratamento induziu uma diminuição estatisticamente significativa na formação de tubo HUVEC (

P

0,005). Os dados são apresentados como média comprimento do tubo em pixels ± S.D. de três experiências independentes. D) Imagens representativas de ensaio de migração HUVECs usando transpoço câmara. Para quantificar as células migratórias, três campos independentes de células migratórias por poço foram fotografadas sob o microscópio de contraste de fase. O número de células por campo contado e foi em média. As contagens de células são expressos como o número relativo de células que migraram para o lado inferior da câmara de Transwell com os resultados a partir de células de controlo dadas como 1. O efeito inibidor de sorafenib (2 uM) sobre a migração foi significativamente aumentada por 1 uM SB225002 (

P

0,01). E) o crescimento esferoidal é prejudicada pela inibição CXCR2 em células SKOV-3. áreas esferóides foram medidos usando software ImageJ. Os valores representados no eixo Y pixels são ± S.D. de três experiências independentes.

formação do tubo endotelial e migração são características importantes da angiogênese tumoral. Foi realizada Transwell ensaios de migração de câmara e ensaios de formação de tubos à base de matrigel utilizando HUVECs para avaliar o potencial anti-angiogénico de sorafenib e SB225002 em combinação. Como mostrado na Fig 4C, o (^ M 2) e sorafenib SB225002 (1 uM) tratamento de combinação quase completamente suprimida a formação de tubos HUVEC. A combinação de sorafenib e SB225002 comprimento do tubo endotelial inibiu significativamente em comparação com sorafenib (≥ 2 vezes,

P Art 0,005) ou SB225002 (≥ 3 vezes,

P Art 0,005) sozinho. Além disso, os resultados do ensaio de migração Transwell demonstrado que SB225002 potenciou significativamente a inibição mediada por sorafenib de migração endotelial (Figura 4D). Esta combinação causou um decréscimo aproximadamente para o dobro da migração quando comparado com HUVECs sorafenib e SB225002 tratamentos sozinhos (

P

0,01). Em conjunto, esses resultados indicam que o tratamento de combinação de sorafenib e SB225002 poderia prejudicar significativamente o potencial angiogênico do HUVECs

in vitro

.

Uma vez que IL-8 desempenha um papel na agregação de células de tumor, foi realizada uma ensaio esferóide para estudar os efeitos de sorafenib e SB225002 no crescimento de esferóides. SB225002 interrompido formação de SKOV-3 esferóides a uma concentração de 2 uM: sorafenib não o fez (Figura 4E). Uma combinação de sorafenib e SB225002 reduziu o crescimento de esferóides (Fig 4E).

SB225002 e sorafenib terapia de combinação em ratos de xenotransplante de sorafenib resistente

Nós ainda avaliados os efeitos do tratamento combinado na sorafenib- xenotransplantes tumorais resistentes

in vivo

. Foram tratados ratos com o sorafenib até que os tumores de xenoenxerto de resistência desenvolvidos. Após 46 dias de tratamento com sorafenib, ratinhos com tumores resistentes sorafenib recebeu sorafenib, SB225002, ou uma combinação das duas drogas. Os tumores tratados com sorafenib sozinho progrediu, mas fê-lo de forma mais lenta do que os tumores de controlo (Fig 5). a progressão do tumor foi significativamente suprimida quando SB225002 foi adicionado ao sorafenib (Fig 5). No final do tratamento, os tumores de murganhos que receberam o tratamento de combinação foi de 42% menor em volume do que os tumores de murganhos que receberam o sorafenib sozinho. Curiosamente, o tratamento com SB225002 por si só não inibiu o crescimento do tumor, que progrediu de tratamento sorafenib, sugerindo a necessidade de bloqueio continuado de VEGF via de sinalização. Os nossos resultados mostram que a inibição de CXCR2 combinado com sorafenib eficazmente aliviada a progressão do tumor e fornecida estendida benefício terapêutico.

SKOV-3 xenoenxertos foram tratados com uma dose diária de 30 mg /kg até sorafenib tumores desenvolveram resistência fenotípica para o tratamento (~ 46 dias). Os ratinhos com tumores resistentes foram então divididos aleatoriamente em grupos para receber uma das seguintes características: 30 mg /kg sorafenib sozinho (

N

= 6), 10 mg /kg sozinho SB225002 (

n = 6

), ou sorafenib mais SB225002 (

n

= 6). A seta indica o início do tratamento no dia 46. O volume do tumor foi medido nos tempos indicados e são apresentados como a média ± S.D. A combinação sorafenib e SB225002 levou à redução de 42% no crescimento do tumor em comparação apenas com sorafenib (

P Art 0,05).

Discussão

A angiogénese desempenha um importante papel no desenvolvimento e progressão do cancro do ovário. tumores do ovário são ricamente vascularizado, e um elevado grau de angiogénese de tumor nos tumores do ovário prevê prognóstico clínico [1, 2, 26]. tumores do ovário sobre-expressar factores pró-angiogénico, incluindo VEGF, FGF, angiopoietina, factores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs) e várias citocinas pró-angiogénicos [10]. Até à data, os resultados encorajadores obtidos com os ensaios do cancro do ovário que incorporam inibidores de VEGF-pathway, o bevacizumab anticorpo terapêutico, e inibidores do receptor tirosina cinase (TKI de moléculas pequenas) [27]. Adicionando bevacizumab à quimioterapia reduziu o risco de agravamento da doença e /ou morte em 62%, quando comparado com a quimioterapia sozinha [8, 28]. Esta constatação levou à recente aprovação da FDA do bevacizumabe em combinação com quimioterapia na doença recorrente.