Sumário

A interleucina-23 (IL-23) é uma citocina pró-inflamatória convencional que desempenha um papel na progressão tumoral através da indução de inflamação no microambiente tumoral. No entanto, o papel da IL-23 na migração e invasão do cancro da tiróide permanece obscura. No presente estudo, observou-se que o tratamento com IL-23, a migração induzida e invasão em células de cancro da tiróide humanos. Dados adicionais demonstram que o

SOCS4

regula negativamente a migração IL-23 mediada e invasão. Ao investigar os mecanismos envolvidos na IL-23 migração mediada e invasão, observou-se que miR-25 promove a migração e invasão das células cancerosas da tireóide pela directamente aplicáveis ​​nos 3′-UTR de

SOCS4

que leva à inibição da

SOCS4

. Além disso, também foi demonstrado que a IL-23 aumenta o miR-25 os níveis de expressão, e sobre-expressa o miR-25 está envolvida na IL-23 associada a

SOCS4

e inibição da migração celular e invasão. Juntos, nossos dados sugerem que a IL-23 induz a migração e invasão em células de câncer de tireóide por mediar a miR-25 /

SOCS4

via de sinalização

Citation:. Mei Z, Chen S, Chen C , Xiao B, Li F, Y Wang, et al. Migração (2015) Interleukin-23 Facilita o cancro de tiróide e invasão celular através da inibição

SOCS4

Expressão via MicroRNA-25. PLoS ONE 10 (10): e0139456. doi: 10.1371 /journal.pone.0139456

editor: Zhiqian Zhang, Pequim Hospital Institute, CHINA

Recebido: 19 de junho, 2015; Aceito: 12 de setembro de 2015; Publicação: 05 de outubro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Mei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelas concessões do National Natural Science Foundation da China (No.81372880); o projeto independente de pesquisa da Universidade de Wuhan (No. 2042014kf0184; NO 2042014kf0119.); o programa de doutorado de Fundo de Investigação do Ensino Superior (nº 20130141120093; No. 20110141110062); Natural Science Foundation da província de Hubei (No.2012FFA045). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de tireóide é um tipo comum de malignidade endócrino que tem mostrado um rápido aumento na incidência mundial durante as últimas décadas [1]. Apesar da melhoria das estratégias terapêuticas, alguns pacientes são difíceis de tratar e desenvolver invasão e metástase [2]. Portanto, é essencial identificar os mecanismos moleculares subjacentes invasão e metástase de câncer de tireóide. Relatórios recentes demonstraram que a inflamação é um forte promotor da carcinogênese e malignidade em muitas formas de cancro [3,4]. Inflamação parece ser um mediador importante para o desenvolvimento de cancro e fornece as células cancerosas um microambiente hospitaleiro [5]. A interleucina-23 (IL-23), uma citocina heterodimérica um tipo composto por a subunidade de IL-12 /p40 e a subunidade p19 específico, pertence à superfamília de interleucina-6 [6]. Estudos anteriores têm demonstrado que a IL-23 está associado com a carcinogénese, bem como a inflamação. Níveis elevados de IL-23 foram encontrados no carcinoma hepatocelular humano, carcinoma colorrectal, carcinoma escamoso, carcinoma esofágico e [7-10]. Evidências sugerem que a IL-23 sobre-expressão pode induzir metástase em colorretal, pulmão e câncer oral [7-10].

Os supressores de sinalização de citocinas (SOCS) são importantes reguladores de feedback negativo de citocina sinalização [11]. As proteínas SOCS são uma família de proteínas (8 SOCS1-7 e um SH2 contendo proteína citocina indutível ou cis). Cada proteína SOCS contém um domínio SH2 central que interage com tirosinas fosforiladas [12]. proteínas SOCS foram recentemente investigada para o seu papel no desenvolvimento de cancros diferentes [13-18]. No entanto, pouco se sabe sobre o papel da SOCS4 em carcinoma, e sua possível influência no crescimento do tumor e malignidade.

Os microRNAs (miRNAs) são uma espécie de pequenos RNAs não-codificantes de cadeia simples que desempenham um papel importante no desenvolvimento de diferentes tipos de cancro, através da ligação da região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) de genes alvo [19]. expressão miRNA aberrante também tem sido frequentemente relatados em numerosos tumores [20]. Nos últimos anos, vários pontos evidência para um papel para miARNs em processos biológicos de células tumorais, incluindo a proliferação celular, diferenciação, migração e invasão [21]. MicroRNA-25 pertence ao grupo de miR-106b-25 que inclui o miR-106b, miR-93, e miR-25. MicroRNA-25 tem sido relatada a ser sobre-expressa de forma aberrante em vários tumores, tais como o cancro do ovário, cancro do pulmão, cancro gástrico e cancro colo-rectal [22-26]. Embora a expressão de miR-25 em diferentes tumores foi descrita, um papel claro para miR-25 em carcinomas de tiróide permanece obscura.

Neste estudo, foi demonstrado que a IL-23 promove a migração de células de cancro da tiróide e invasão . Demonstramos ainda que IL-23 regula a migração e invasão das células cancerosas da tiróide através de uma via de sinalização de miR-25 /SOCS4.

declaração Materiais e Métodos

Ética

Todos participantes assinaram termo de consentimento para participar do estudo. O estudo foi realizado de acordo com os princípios da Declaração de Helsinki e aprovado pelo Institutional Review Board do Hospital Remin da Universidade de Wuhan, em conformidade com as suas orientações para a protecção dos seres humanos.

Amostras e casos

tecidos de tireóide foram coletadas no Hospital Remin da Universidade de Wuhan a partir de fevereiro de 2010 a fevereiro de 2014. as amostras de tecido foram cortadas em duas partes, uma foi avaliada por dois patologistas experientes para verificar o diagnóstico histológico, o outro snap-congelados imediatamente em azoto líquido, e armazenado em azoto líquido até à extracção do ARN. Nenhum dos pacientes tinha recebido qualquer tratamento pré-operatório. Os tumores foram encenadas de acordo com a Comissão Americana conjunta sobre Câncer (AJCC) patológica do tumor-nódulo-metástase (TNM) classiication. As características dos pacientes estão descritos nas Tabelas S1 e S2.

cultura celular

linhas celulares de cancro da tiróide humana K1 (papilar) e WRO (folicular) foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gibco BRL), 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina. As células foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora. Todas estas linhas celulares foram adquiridos original do banco de células da Academia Chinesa de Ciências, Xangai

Reagentes

humano recombinante IL-23 (rhIL-23) foi adquirido de R . D Systems ( Minneapolis, MN). Os anticorpos monoclonais (ABS) contra SOCS4 humana e GAPDH foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). Sintetizada quimicamente imita miARN e inibidores de miARN foram adquiridos da Ambion (Austin, TX, EUA). TRIzol, Lipfectamine-2000, Enzyme MIX foram adquiridos a partir de Invitrogen (Basileia, Suíça).

quantitativa PCR em tempo real

análise de PCR quantitativo em tempo real foi realizado para determinar os níveis de miARN e mRNA maduro. Para a detecção quantitativa microARNs maduros, Total de miARNs foram isolados usando um kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion), de acordo com as instruções do fabricante. RNA total (2 mg) foi reversetranscribed com primers Bulge-Loop madura miRNA específicos de transcrição reversa (Ambion) e Moloney vírus da leucemia murina transcriptase reversa (Promega). quantificação baseado em PCR quantitativo em tempo real de miARNs foi realizado utilizando os kits de análise de miARN (Ambion), de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de miARN foram normalizados para os da snRNA U6 controlo interno. Para detectar ARNm celulares, o ARN total foi isolado utilizando TRIzol (Invitrogen, Basel, Suíça). As amostras de ARN celulares foram sujeitos a transcrição reversa utilizando iniciadores aleatórios. PCR em tempo real foi realizado utilizando um LightCycler 480 (Roche) e o sistema de SYBR Green (Applied Biosystems). GAPDH foi amplificada como um controlo interno. Os iniciadores utilizados neste estudo estão listados na Tabela S3 e os produtos SYBR Green verificada por sequenciação.

Transwell ensaio

A migração celular e ensaio de invasão foram realizados como descrito anteriormente [27]. Resumidamente, as células foram tratadas com 50 ng mL rhIL-23 ou tampão BSA /controle de tempo e doses descritas e observadas em conformidade. O número médio de migrar e invadir células foi expresso como uma percentagem em relação ao controlo, o qual foi designado como 100%.

fechamento da ferida ensaio

Uma ferida foi introduzido nas células em monocamada confluente através uma ponta de micropipeta. As fotografias foram tiradas em 40 X ampliação usando microscopia de contraste de fase imediatamente após a incisão da ferida e em pontos de tempo seleccionados. fechamento da ferida foi medido através do cálculo densidades de pixel na área da ferida por software Cella (Olympus Biosystem Gmb, Hamburgo, Alemanha) e expressa em percentagem do fechamento da ferida de áreas triplicados ± SD.

MTT

o (-2-ilo 4,5-dimetiltiazol) -2,5-ensaio de 3- (MTT) foi usada na avaliação da proliferação de células. As células foram semeadas em placas de 96 poços a 5 x 10

3 células /poço. Vinte e quatro horas mais tarde, foi realizado um ensaio MTT. Finalmente, a densidade óptica foi determinada a 570 nm utilizando o leitor ELISA de placa (modelo 550; da Bio-Rad). Pelo menos três experiências independentes foram asseguradas.

A transfecção e ensaio de repórter de luciferase

As células foram semeadas em 24 cavidades ou 6-pratos bem, dependendo da experiência, e foram cultivadas até à confluência atingindo cerca de 80-90% no momento da transfecção. As células foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Um vector repórter de luciferase de Renilla pRL-TK foi usado como controlo interno. Os ensaios de luciferase foram realizadas com um kit de ensaio de especificidade dupla luciferse (Promega, Madison, WI). Firefly actividades da luciferase foram normalizados com base na actividade de luciferase Renilla. Todos os ensaios de repórter foram repetidas pelo menos três vezes. Os dados apresentados foram valores médios ± DP de uma experiência representativa.

RNA de interferência

SOCS4 shRNA e controle shRNA irrelevante (shRNA-controle) foram adquiridos de GenePharma (GenePharma, Shanghai) e preparado por ligadura dos pares correspondentes de oligonucleótidos para PGPU6 /GFP /Neo. A sequência alvo pode ser encontrada na Tabela S4.

análise Western blot

lisados ​​celulares totais foram preparado por lise de células com PBS pH 7,4 contendo 0,01% de Triton X-100, 0,01% de EDTA, e cocktail 10% inibidor de protease (Roche, Applied Science). A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad). Os polipéptidos a partir de lisados ​​de células foram separados em SDS 12% de gel de poliacrilamida reticulada com N, N -methylenebisacylamide, e transferidos electricamente para membranas de nitrocelulose (Millipore, Billerica, MA). A ligação não específica foi bloqueada com 5% de leite em PBST antes da adição de anticorpos primários utilizados neste estudo. anticorpos de rábano ligada a peroxidase anti-coelho e anti-rato (Sigma, St Louis, MO) foram utilizados como anticorpos secundários. Os níveis de proteína foram quantificados através da digitalização borrões em um imager Gel Doc EZ (Bio-Rad) e análise com Quantidade Uma 1D software de análise de imagem 4.4.0 (Bio-Rad)

A análise estatística

Estatística as análises foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 5 (GraphPad software, La Jolla, CA, EUA). dados paramétricos e não paramétricos foram analisados ​​utilizando um teste t de duas caudas e o teste de Mann-Whitney, respectivamente. Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados são apresentados como média ± D.P.. ou média ± SEM

Resultados

IL-23 promove a migração e invasão das células cancerosas da tiróide

Queríamos testar o efeito da IL-23 sobre a proliferação de células de células de câncer de tireóide, a fim de observar se a proliferação celular perturba a capacidade de migração e invasão das células. O ensaio de MTT mostraram que a proliferação de células K1 e células WRO foram dificilmente afectado por qualquer dose de IL-23 (Fig S1). A seguir, investigou se IL-23 poderia afetar a migração ea invasão das células cancerosas da tiróide. circulação reforçada e invasão de células K1 foram detectadas na presença de 50 e 100 ng /ml de IL-23 (Figura 1A e 1B). Do mesmo modo, o aumento da migração e invasão também foram detectadas tão cedo quanto 48 horas (h) após o tratamento com 50 ng /ml de IL-23 de proteína (Fig 1C e 1D). Também demonstramos que IL-23 aumentou a migração e a invasão de células WRO numa dose e dependente do tempo forma (Fig S2). Além disso, a cura de feridas ensaio mostram também que a IL-23 aumentou a migração de células K1 (Fig 1E e 1F). Em conjunto, estes resultados confirmam a dose e efeito proinvasive promigratory e de IL-23.

(A) K1 foram tratadas com rhIL-23 durante 48 h nas concentrações indicadas, dependente do tempo, seguido por cultura em um sistema Transwell durante 24 horas. (B) experiências de ensaio de invasão celular foram realizados com células K1 que foram tratadas como em (A). (C) K1 foram tratados com uma concentração de 50 ng /ml de rhIL-23 para os pontos de tempo indicados, seguido por cultura em um sistema Transwell, durante 24 h. (D) As experiências foram realizadas tal como em (C) para o ensaio de invasão celular. K1 (e) foram tratadas com rhIL-23 durante 48 h nas concentrações indicadas, seguindo-se a introdução de uma ferida. A migração celular na ferida foi monitorizada a 24 horas. (F) K1 foram tratados com uma concentração de 50 ng /ml de rhIL-23 para os pontos de tempo indicado, seguido pela introdução de uma ferida. A migração celular na ferida foi monitorizada a 24 horas. o fechamento da ferida foi medida por cálculo densidades de pixel na área da ferida e expressa como percentagem do fecho da ferida de áreas em triplicado ± desvio padrão na migração Transwell, invasão e ferir ensaio de cura, os dados são expressos como uma percentagem do controlo. Os dados representam a média ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).

IL-23 induz a migração e invasão das células cancerosas da tiróide através de

SOCS4

para identificar o papel da IL-23 na expressão de SOCS4, K1 foram estimuladas com proteína IL-23 durante 24 h, na concentração de 50 ng /ml. Os supressores de sinalização de citocinas (

SOCS4

) mRNA e proteínas foram detectadas por PCR em tempo real e western blot, respectivamente. Os resultados mostraram que a IL-23 suprimida

SOCS4

expressão de ARNm e proteína em células K1 (Figura 2A). Resultados semelhantes também foram obtidos na linha de células WRO (Fig 2B). Para determinar se SOCS4 participa na migração IL-23 mediada e invasão de células cancerosas da tiróide, construímos 4 humana RNA curto hairpin específicos de SOCS4 (shRNA). Real-time PCR resultados mostraram que os plasmídeos # 2 shRNA marcadamente poderia inibir a expressão de SOCS4 em K1, enquanto que os outros plasmídeos shRNA teve pouco efeito sobre a expressão de SOCS4 (Fig 2C). Os níveis de proteína SOCS4 mostrou uma tendência semelhante, conforme determinado por transferência de Western (Figura 2D). Em experiências de migração celular, a sobre-expressão de

SOCS4

inibiu a migração induzida por IL-23 em células K1 (Figura 2E). Por outro lado, o knockdown de

SOCS4

expressão aumentada de migração induzida por IL-23 em células K1 (Figura 2F). Os graus de indução foram correlacionados com as eficiências de

SOCS4

knockdown por cada plasmídeo shRNA (Fig 2F). Resultados semelhantes foram obtidos com as experiências de invasão Transwell (Figura 2G e 2H). Desde SOCS4 regula negativamente a migração, o próximo analisaram o papel do SOCS4 na proliferação celular das células cancerosas da tiróide. Os resultados do ensaio de MTT indicaram que a proliferação de células K1 foram dificilmente afectada pela expressão de SOCS4. Além disso, a superexpressão ou Knockdown de SOCS4 e tratamento com IL-23 não poderia afetar a proliferação celular das células cancerosas da tiróide (S3 FIG). Estes resultados sugerem que a activação da migração de IL-23 regulada e invasão pode exigir SOCS4. K1

(A) foram tratados com 50 ng /ml de rhIL-23 durante 48 h.

SOCS4

níveis de ARN foram quantificados por qRT-PCR (painel da esquerda) e os níveis de proteína de SOCS4 foram detectadas por Western blot (painel da direita). (B) Experiências com células WRO foram realizados como em A. (C, D) K1 foram transfectadas com diferentes

SOCS4

shRNA (shRNA # 1, # 2 shRNA, shRNA # 3 e # 4 shRNA) ou shCtrl como falsa. Após 48 h,

SOCS4

níveis de mRNA foram medidos por qRT-PCR (C) e Western blot (D). K1 (E) foram transfectadas com o plasmídeo indicado, em seguida, tratada com rhIL-23 (50 ng /ml) durante 48 h e deixada a migrar para soro durante 24 h (painel superior). Os níveis de proteína de SOCS4 foram detectadas por Western blot (painel inferior). (F) As células foram transfectadas com o indicado shRNA-SOCS4 e as experiências foram realizadas tal como em (E). (G, H) As experiências de ensaio de invasão de células foram realizadas em condições semelhantes às descritas no (E) e (F). No tempo real experiências de RT-PCR, o controlo foi designada como 1. Todas as experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes, com resultados semelhantes. Os gráficos de barras representam a média ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).

MicroRNA-25 regula negativamente

SOCS4

expressão, visando directamente o seu 3′-UTR

para analisar os miRNAs que podem direcionar o 3′-UTR de

SOCS4

, usamos 3 bases de dados on-line, TargetScanHuman, miRDB e miRWalk2.0, para procurar potencial candidatos. Catorze dos miARNs potenciais comuns foram encontradas nas bases de dados 3. Para determinar o efeito dos miARNs previstos sobre a expressão de

SOCS4

,

SOCS4

3′-UTR foi clonado num plasmídeo repórter de luciferase de pirilampo. Os ensaios de actividade da luciferase indicaram que 6 miARNs inibiu a actividade da luciferase SOCS4 abaixo de 50% em comparação com o miR-Ctrl (Fig S4A). A seguir, investigou quais miRNAs foram ativados pela migração induzida por IL-23 e invasão. K1 foram tratados com a proteína IL-23 a 50 ng /ml durante 48 h. Os resultados de PCR em tempo real demonstraram que entre os miRNAs que poderia atenuar

SOCS4

atividade luciferase, a expressão de miR-25 foi significativamente induzida (S4B Fig).

A partir de nossos dados a hipótese de que miR-25 pode desempenhar um papel na via da IL-23 /SOCS4 sinalização. Em seguida, investigou se miR-25 regula

SOCS4

expressão de segmentação pós-transcricional da sua 3′-UTR. Uma mutação distinta foi gerado na 3’UTR do

SOCS4

em locais de correspondência de sementes previstas para testar a interação entre miR-25 e

SOCS4

3′-UTR (Fig 3A). transfecção transiente de células K1 com o tipo selvagem (WT)

SOCS4

3′-UTR, e o miR-25 mímico, leva a uma diminuição significativa na actividade repórter em comparação com a do miR-controlo (Figura 3B ). Este fenómeno foi interrompido quando as mesmas linhas celulares foram transfectadas com

SOCS4

3′-UTR mutantes (Fig 3B). O inibidor de miR-25 (miR-25-INH) estimulou significativamente a actividade da luciferase do WT

SOCS4

3′-UTR, sem qualquer efeito sobre Mut

SOCS4

3′-UTR em K1 células (Fig 3C). MicroRNA-25 sobre-expressão em células K1 suprimiu significativamente tanto o ARNm e os níveis proteicos de SOCS4 (Fig 3D). knockdown Por outro lado, miR-25 inibidor mediada por endógena miR-25 aumentou

SOCS4

expressão de mRNA e proteína em células K1 (Fig 3E). Para determinar se a regulação negativa miR-25 mediada por de

SOCS4

expressão é uma característica comum em células de cancro da tiróide, foram realizadas experiências semelhantes em células WRO (Fig 3F e 3G). Juntos, estes resultados sugerem que SOCS4 é alvo de miR-25 em K1 e células WRO.

(A) As sequências de sítios de ligação de miR-25 dentro do ser humano

SOCS4 Sims 3 ‘ UTRs e as construções repórter esquemáticos. Neste painel, WT representa as construções repórter contendo todo o sequências 3’UTR de

SOCS4

.

SOCS4

-MUT representa as construções repórter contendo nucleotídeos mutantes. (B, C) K1 foram co-transfectadas quer com WT ou MUT

SOCS4

plasmídeos repórter 3’UTR e quer o miR-25 mímico (B) ou o miR-25 inibidor (C). actividades de luciferase foram medidas após 48 h usando um kit de ensaio de luciferase dupla e normalizada para a luciferase da Renilla. (D) K1 foram transfectadas com o miR-25 mímica ou controlos durante 48 h.

SOCS4

ARNm (painel da esquerda) e de proteína (painel direito) foram detectados por qRT-PCR e western blot, respectivamente. (E) As células foram transfectadas com 25 de miR-inibidor ou controlo e as experiências foram realizadas como no D. (F, G) As células WRO foram utilizados e as experiências foram realizadas como em D e E. Todas as experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes com resultados semelhantes. Os gráficos de barras representam a média ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).

MicroRNA-25 promove a motilidade das células cancerosas da tiróide, visando

SOCS4

Uma vez que miR-25 pode suprimir

expressão SOCS4

pela ligação ao seu 3′-UTR específica da sequência, temos a hipótese de que o miR-25 pode afetar a migração e invasão de cancro da tiróide via SOCS4. Para testar a hipótese, as células foram co-K1 transfectadas com o

SOCS4

vector de expressão (ou vector vazio) e os miR-25 imita (ou miR-Ctrl). Transwell ensaios de migração demonstrar que o miR-25 promove a migração de células K1 e migração celular induzida por miR-25 é invertido pelo

SOCS4

superexpressão (Fig 4A). Além disso, observou-se que o knockdown de

SOCS4

pode aumentar significativamente o efeito de miR-25 na migração celular (Fig 4B). Resultados semelhantes foram obtidos nos ensaios de invasão e cura de feridas de ensaio (Fig 4C-4F). O efeito da /via de sinalização de miR-25 SOCS4 sobre a migração de células de cancro da tiróide foi ainda avaliada utilizando o inibidor de miR-25. Como mostrado na Fig 4G, miR-25 inibidor inibe significativamente a migração de células K1. Além disso, o inibidor de miR-25 e o

SOCS4

vector de expressão sinergicamente inibir a migração de células K1 (Figura 4G). Por outro lado, altos níveis de migração estavam presentes em K1 quando

SOCS4

foi derrubado por shRNA-SOCS4 # 2 (Fig 4H). Resultados semelhantes também foram obtidos em ensaios de invasão e cicatrização de feridas ensaio (Fig 4I-4L). Estes resultados sugerem que a inibição de

SOCS4

expressão é responsável pela capacidade de miR-25 para promover a invasão celular e migração.

(A, B) K1 foram co-transfectadas com o indicado ARN miR-mímica e plasmídeo (a) ou shRNA (B) durante 48 h e deixada a migrar para soro durante 24 h. (C, D) experiências de ensaio de invasão celular foram realizadas com as mesmas condições que em A e B. (E, F) Cicatrização de feridas experiências de ensaio foram realizadas com as mesmas condições que em A e B. (G, H) As células foram transfectadas com miR-25 inibidor ou controlo e as experiências foram realizadas como na secção a e B. (i, j) experiências de ensaio de invasão celular foram realizadas com as mesmas condições que em G e H. (k, l) a cicatrização de feridas foram realizadas experiências de ensaio com as mesmas condições que em G e H. Bar gráficos representam a média ± DP, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05).

IL-23 estimula miR- 25 expressão em células de cancro da tiróide

para identificar o papel da IL-23 na expressão de miR-25, as células foram estimuladas K1 com a proteína IL-23 humana a diferentes concentrações durante 48 h. MicroRNA-25 níveis foram detectadas por PCR em tempo real. Os resultados mostram que o miR-25 níveis são regulados positivamente pela proteína de IL-23 de um modo dependente da dose (Figura 5A). Consistentemente, K1 foram tratados com IL-23, proteína a diferentes pontos de tempo, a uma concentração de 50 ng /ml. Os resultados de análises em tempo real de PCR demonstrar que o miR-25 níveis aumentam à medida que o tempo aumenta (Figura 5B). O papel da IL-23 sobre a expressão de miR-25 foi confirmada pela repetição das experiências usando células WRO (Fig 5C e 5D). Estes resultados sugerem que a IL-23 activa o miR-25 de expressão.

MicroRNA-25 níveis foram quantificados por PCR em tempo real e as experiências foram realizadas tal como descrito na FIG 1. Os níveis de expressão foram normalizados para U6 snRNA. Os dados representam a média ± DP, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05)

MicroRNA-25 desempenha um papel importante da IL-23 mediada por

SOCS4.

e inibição da migração celular e invasão

Para definir o papel de miR-25 na regulação negativa de IL-23 mediada por

SOCS4

expressão, células K1 foram transfectadas com o miR-25 imita ou miR-Ctrl e tratou-se com ou sem proteína IL-23 durante 48 h. Os resultados de PCR em tempo real e análises de Western blot mostram que a transfecção com o miR-25 imita aumenta a inibição de IL-23 mediada por de

SOCS4

ARNm e a expressão de proteína (Figura 6A). Em contraste, os níveis elevados de

SOCS4

ARNm e proteínas estão presentes em células K1, quando a expressão de miR-25 é inibida pelo inibidor de miR-25 (Fig 6B). Nós também examinou se miR-25 está envolvida na IL-23 mediada por linha de células motilidade cancro da tiróide. Usando Transwell ensaios de migração e invasão, mostrámos que o miR-25 superexpressão estimula a activação de IL-mediada por 23 de migração e invasão (Figura 6C e 6D), e knockdown de miR-25 expressão inibe a activação de IL-mediada por 23 de migração e invasão (Figura 6E e 6F). Resultados semelhantes também foram obtidos no ensaio de cicatrização da ferida (Figura 6G e 6H) .Taken em conjunto, estes dados sugerem que o miR-25 é o componente fundamental envolvido na migração de células de cancro da tiróide de IL-23 mediada por invasão e através da inibição de

SOCS4

expressão.

K1 (a) foram transfectadas com o plasmídeo indicado, em seguida, tratada com rhIL-23 (50 ng /ml) durante 48 h. ARNm SOCS4 (painel da esquerda) e de proteína (painel direito) foram detectados por qRT-PCR e western blot, respectivamente. (B) As células foram transfectadas com 25 de miR-inibidor ou controlo, e as experiências foram realizadas tal como em A. (C, D) K1 foram transfectadas com o miR-25 mímico (C) ou inibidor (D) e controla, em seguida, tratada com rhIL-23 (50 ng /ml) durante 48 h e deixada a migrar para soro durante 24 h. (E, F) experiências de ensaio de invasão celular foram realizadas com as mesmas condições que no C e D. (G, H) a cicatrização de feridas experiências de ensaio foram realizadas com as mesmas condições que no C e D. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes com resultados semelhantes. Os gráficos de barras representam a média ± SD, n = 3 (** P 0,01; * P 0,05)

A expressão de IL-23, miR-25 e

SOCS4

na tireóide tecidos de câncer

Para validar o papel da IL-23, miR-25 e

SOCS4

em carcinoma da tiróide, a expressão de IL-23, miR-25 e SOCS4 foram analisados em 35 pares de PTC clínica, 26 pares de FTC clínica, e 22 amostras normais da tireóide. Como mostrado na S5A-S5C Fig, a expressão de

SOCS4

foi menor eo nível de IL-23 e miR-25 expressão foi maior em PTC e FTC espécimes do que amostras normais da tireóide. Além disso, níveis elevados de IL-23 estavam correlacionados com elevados níveis de miR-25 (Fig S5D). Curiosamente, os baixos níveis de

SOCS4

expressão foram correlacionados com altos níveis de IL-23 e miR-25 expressão em amostras PTC e FTC (s5e e S5F FIG). Estas observações sugerem fortemente que as alterações de IL-23, miR-25 e expressão SOCS4 poderiam estar envolvidos na progressão do cancro da tiróide.

Discussão

Neste estudo, definiu-se uma via de sinalização romance implicados em o controle da migração de células de câncer da tireóide e invasão. Em primeiro lugar, nós demonstramos que IL-23 regulada miR-25 expressão, bem como subregulado

expressão SOCS4

na migração de células do cancro da tiróide e invasão. Além disso, nós também mostraram que miR-25 promove a migração de células de cancro da tiróide e invasão, visando SOCS4. Por fim, os nossos dados sugerem que o miR-25 está envolvida na IL-23 associada

SOCS4

expressão e a migração celular e invasão.

migração celular e invasão do tumor é um processo muito complicado, no qual o cancro células de propagação do tumor primário, sobreviver na circulação, e crescem em locais distantes no corpo [28]. Cada processo é determinado pela capacidade de migração e invasão das células tumorais e o microambiente tumoral local, que fornecem um ambiente favorável para as células tumorais para sobreviver e metástase [29]. Investigações recentes demonstraram que a elevada expressão de níveis de IL-23, que podem ser detectados no microambiente, poderia ajudar a facilitar a metástase tumoral. Por exemplo, a IL-23 promove a metástase de carcinoma hepatocelular, por expressão de MMP9 NF-kB-upregulated [9]. IL-23 é altamente expresso em astrócitos metástases-associados, e IL-23 induz a progressão de metástases de melanoma do cérebro [8]. A IL-23 desempenha um papel fulcral no desenvolvimento do cancro do esófago através de uma transição epitelial-mesenquimal [7]. IL-23 pode aumentar a proliferação e invasão de células de carcinoma colorrectal [10]. No entanto, o papel da IL-23 na migração das células do cancro da tiróide e invasão ainda é desconhecido. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar os efeitos diretos da IL-23 sobre a migração e invasão das células cancerosas da tiróide. Curiosamente, um estudo recente demonstrou que a IL-23 regula a proliferação de células de cancro do pulmão [30]. No entanto, ao contrário das células de câncer de pulmão, não encontramos evidência para suportar que a IL-23 induz a proliferação de células cancerosas da tiróide (S1 FIG). Nós especulamos que pode haver algumas diferenças intrínsecas entre o câncer de tireóide e câncer de pulmão. Por outro lado, IL-23 promove a migração e invasão das células cancerosas da tiróide.

Atualmente, dois relatórios têm implicado o papel potencial da SOCS4 no câncer. Um estudo utilizou uma dupla análise matriz combinação para provar que SOCS4 é um novo gene supressor de cancro gástrico [31]. O outro estudo comparou as diferenças de expressão de

SOCS1-7

entre tecido de cancro da mama e tecido mamário fundo [32]. Alta expressão de

SOCS4

está significativamente associado com um estágio de tumor mais cedo e uma melhor evolução clínica em câncer de mama humana [32]. Neste estudo, observou-se que os níveis de SOCS4 são diminuídos na migração induzida por IL-23 e invasão das células cancerosas da tiróide (Fig 2). O tratamento com IL-23 resultou em níveis de expressão reduzidos de

SOCS4

em células de câncer de tireóide (figura 2). Através de experiências e a sobre-expressão de knockdown, que demonstram que o

SOCS4

regula negativamente a migração induzida por IL-23 e invasão (Figura 2). Recentemente, vários estudos têm mostrado evidências de que a família SOCS tem uma forte supressores de tumor papel em diversos tipos de tumores sólidos e hematológicos [32,33].