Abstract

Se componentes do estroma facilitar o crescimento, invasão e disseminação de células cancerosas ou suprimir lesões neoplásicas de progressão maligno é um dilema contínuo na biologia do tumor. Conceituar uma imagem dinâmica de desenvolvimento de neoplasias é complicada pela heterogeneidade inter-individual. Na era pós genômica, desvendando tal complexidade continua sendo um desafio para o biólogo câncer. Para o estabelecimento de uma associação funcional entre crosstalk celular e agressividade do câncer diferencial, identificamos uma assinatura de resposta epitelial maligno do peito à sinalização do estroma. Proximidade de fibroblastos resultou em alterações transcrito do gene de 2 vezes para 107 sondas, coletivamente designados como de fibroblastos acionado expressão gênica em Tumor (FText). A taxa de risco previsto pelo classificador FText de recaída distante em pacientes com tumores de mama de grau intermediário e alto foi significativa em relação às variáveis ​​de rotina clínicos (conjunto de dados 1, n = 258, RH – 2,11, IC 95% 1,17-3,80, p-valor de 0,01 ; conjunto de dados 2, N = 171, HR – 3,07, IC de 95% 1,21-7,83, p-valor 0,01). Biofunctions representados por FText incluídos sinalização inflamatória, de eliminação de radicais livres, a morte celular, e a proliferação celular. Ao contrário dos genes do “aglomerado proliferação”, que são sobre-expressos em tumores primários agressivas, os genes foram reprimidos FText exclusivamente em tais casos. Como prova de conceito para os nossos resultados correlatos, que apontam crosstalk estromal-epiteliais e comportamento tumoral, vamos mostrar um diferencial distintivo impacto estromal em desfechos funcionais de definição de prognóstico da progressão do ciclo celular, e resistência a parada do crescimento induzida por terapia e apoptose em baixa contra células cancerosas de alto grau. Os nossos dados experimentais revelam assim, os aspectos de ‘cooperatividade parácrina’ que são exclusivamente condicionados à histopatologicamente grau definido de interagir epitélio do tumor, e demonstrar que a capacidade de resposta epitelial para o microambiente do tumor é um factor subjacente determinista resultado clínico. A esta luz, a atenuação precoce de crosstalk epitélio-estromal poderia melhorar a gestão dos casos propensos a ser clinicamente desafiador

Citation:. Luciani MG, Seok J, Sayeed A, Campeão S, Goodson WH, Jeffrey SS, et ai. (2011) Capacidade de resposta diferenciado para Estromal Sinalização Acompanha histológica Grade de Programação das células cancerosas. PLoS ONE 6 (5): e20016. doi: 10.1371 /journal.pone.0020016

editor: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de Câncer, o Brasil

Recebido: 09 de fevereiro de 2011; Aceito: 08 de abril de 2011; Publicado em: 19 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Luciani et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde sob R01CA109325 concessão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

acredita-se que o microambiente local do tecido hospedeiro é um participante ativo durante todo o desenvolvimento e progressão do câncer [1]. Neste ambiente, as trocas interativas entre células do estroma e tumorais pode influenciar a sobrevivência, crescimento e disseminação [2]. quimiocinas estromais autócrinos e parácrinos sinais de TGF-p são bem conhecidos mediadores pró-tumorigénicas [3] – [8]. Em tumores da mama, fibroblastos geralmente representa o tipo de célula mais abundante no estroma, muitas vezes referida como a ‘estroma reactivo “, altamente enriquecida em, tipo I e VI colagénio, laminina, entactina, proteoglicanos de heparina-sulfato e fibrina [9]. fibroblastos derivados de tumores de diferentes órgãos exibir uma considerável variabilidade em perfis transcricionais [10], e ocorrem variações significativas na expressão de genes dentro do estroma tumores do mesmo sistema de órgãos, frequentemente em associação com parâmetros clinicopatológicas. Por exemplo, a sobre-expressão de CD10 e receptor PDGFß no estroma do cancro da mama é característica de alto grau histológico [11], [12]. assinaturas associadas a fibroblastos e sua correlação clínica com o resultado em pacientes com câncer [13], [14], sugerem que um estroma tumoral alterada é o resultado de “crosstalk cooperativa” com células de carcinoma.

Um esforço abrangente para revelar as bases de crosstalk estromal-epitelial dentro de tumores sólidos podem contribuir para a identificação de um espectro mais amplo de determinantes moleculares segmentáveis ​​de resultado para o paciente. É concebível que os fenótipos agressivas de células de tumor muitas vezes representam uma resposta localizada a sinais do microambiente [15]. No entanto, apesar transitória

in vitro

indução, crosstalk estromal-epitelial tem longa duração efeitos funcionais sobre tumorigenicidade e potencial metastático de células inoculadas em animais experimentais [16]. Na busca de efeitos fenotípicos específicos,

in vitro

interações entre fibroblastos e células epiteliais de mama anteriormente tentativas foram limitadas a imortalizada espontaneamente linhas celulares de cancro da mama uniformemente derivadas de tumores de alto grau agressivos e derrames metastáticos [17] – [19 ], ou a partir de tecido não maligno da mama humano [20]. Interpretação de tais dados é impedida pela falta de um amplo espectro, baseada em modelos de doença substitutos de cancro humano. conclusões Assim inequívocas sobre uma associação entre heterogeneidade clínica e a sinalização do estroma-epitélio subjacente biologia funcional são ainda imperceptíveis. Um pré-requisito fundamental para a análise da interacção entre vários subconjuntos celulares dentro de tecido do tumor é a disponibilidade de componentes interativos ao vivo fracionado a partir de tecido de descarte cirúrgica fresca em quantidade suficiente para a coleta de dados robusta e geração de hipóteses. Da mesma forma, para atingir percepções de translação através de simulação experimental, é extremamente importante incorporar um repertório celular, o que reflete a amplitude da variabilidade clínica contribuído por elementos epiteliais e estromais no tecido tumoral. Ao facilitar crosstalk direta entre linhas de células tumor primário novos de clinicopathology ampla [21] e várias amostras independentes de fibroblastos derivados de tecido não-malignas ou tumorais, nosso estudo tem apontado para uma melhor compreensão da biologia do câncer e sua aplicação nas seguintes maneiras. Em primeiro lugar, um conjunto de genes é identificado, cuja expressão é constantemente alterada através de interacções parácrinos. Em seguida, o papel de uma resposta de células de tumor induzida estroma tal na promoção da gravidade da doença é ilustrado através da sua correlação com os resultados clínicos. Finalmente, uma base funcional directa para variar o resultado clínico relacionado com a capacidade de resposta do tumor a sinalização do estroma é demonstrada por mudanças na cinética do ciclo celular apoptótica, a evasão, a redução de ROS, e neutralização dos efeitos inibidores do crescimento de cancro terapia hormonal. A nossa demonstração de variabilidade associada-grade na reprogramação dinâmica do epitélio cancerígeno pela microambiente estromal aumenta o alcance da pathobiology câncer clássica, e sugere novos alvos para tumores refractários aos tratamentos atuais. Além disso, a detecção de padrões de resposta parácrina em estágios iniciais pode revelar a propensão para a progressão de lesões pré-malignas e doença pré-invasiva de lesões avançadas

Resultados

Identificação de FText -. Um perfil de expressão gênica que descreve maligno a resposta de células do estroma de sinalização

um perfil de expressão diferencial entre linhas celulares de tumor da mama primário sozinho (t nenhum) e aqueles propagado na presença de fibroblastos tumorais da mama (T + FT) foi definida por uma lista de genes significativa composto de 482 conjuntos de sondas com um valor de p 0,05 ajustado, onde 7 linhas de célula de tumor primária independentes foram denotado como T, e fibroblastos derivados de tumores primários como TF. perfis de expressão para 3/7 linhas celulares foram adquiridas com 2 amostras de fibroblastos independentes. Um mapa de calor, o que reflecte, em grande parte pela repressão da transcrição do tumor-co-cultura de fibroblastos (Figura 1A) inclui 107 conjuntos de sondas, com 2 vezes a mudança na expressão do gene (Tabela S1). Este grupo de genes, que exibiu significativa fold-variação negativa nas células tumorais, e designada de fibroblastos acionado expressão gênica em Tumor (FText), foi investigada. conjuntos de sondas regulada dentro da lista gene significativa não preenchem os nossos critérios de selecção para a mudança vezes, e não foram considerados para estudo posterior. Categorias enriquecidas de funções biológicas associadas com genes FText foram determinados por Engenho Pathway Analysis, e primariamente envolvidas da resposta inflamatória, proliferação celular, morte celular e eliminação de radicais livres (Figura 1B, e a Figura S1).

. agrupamento hierárquico de linhas celulares de cancro da mama primário como monocultura de controle e, em co-cultura com fibroblastos derivados de tumores. Nota clusters independentes retratando padrões de expressão distintos induzidas estroma em células tumorais refletidos por 482 conjuntos de sondas significativas. Categorias B. enriquecida de bio-funções representados por 107 conjuntos de sondas, com 2 mudança vezes na expressão do gene, designado como FText. As barras são agrupadas e coloridas de acordo com as categorias de função bio. Cada barra representa um teste de p-valor de enriquecimento de uma função biológica. C. Análise de 482 conjuntos de sondas significativas em média ao longo de várias culturas de células epiteliais derivadas de maligna (vermelho) e tecido não maligno da mama (verde) na presença (eixo y) ou ausência (eixo x) co-cultura de estroma. A linha pontilhada preta representa x = y. As células tumorais exibir maior desvio desta linha, ou seja, entre controle e co-cultura passo que os padrões de células epiteliais não-malignas co-cultivadas expressão mostra desvio mínimo de controle. D. Gráfico de dispersão dos níveis de transcritos de genes relativas de 11 FText medido por qPCR em um conjunto independente de 6 linhas de células de tumor de mama primários co-cultivadas com um total de 4 amostras de fibroblastos (TF) derivadas de tumores. Os dados representam

ACTB

expressão normalizada de gene de teste em células tumorais co-cultivadas relativamente ao controlo. . Faixa de notas de expressão para cada gene teste

abordagens adicionais para avaliar a diversidade de influência do estroma, incluíram: (1) análise comparativa da lista gene significativo derivado de tumor (482 conjuntos de sondas) com dados de matriz a partir de co-culturas do estroma-epitelial isolado a partir de 8 amostras de tecidos não malignos da mama independentes. padrões de expressão gênica foram diferenciado entre as células co-cultivadas malignas vs. não-malignas epiteliais da mama (Figura 1C). Considerando que as células epiteliais não malignas co-cultivadas com correspondentes fibroblastos não malignas exibida relativa uniformidade na capacidade de resposta, ampla heterogeneidade foi observada em co-culturas de estroma-epiteliais derivadas de tumores (2) análise de QPCR de 11 genes FText em um conjunto independente de 6 linhas de células epiteliais derivadas de tumores primários co-cultivadas com 4 fibroblastos derivados de tumores previamente não testados. Similar aos dados de matriz acima mencionados, uma análise quantitativa do gene-por-gene confirmada indução de alterações na expressão do gene de teste em relação ao gene de manutenção,

ACTB

, no interior das células tumorais co-cultivadas (a partir de 4 correspondente, e dois co-culturas ímpares) (Figura 1D).

FText variação e associação com a evolução clínica do cancro da mama primário

Para determinar a relevância clínica das alterações fenotípicas directamente induzidas por crosstalk estromal, o poder de classificação de FText (107 conjuntos de sondas) foi testada em conjunto com os dados de matriz de conjuntos de dados de 2 cancro da mama independentes. Distante sobrevida livre de metástases (CPOS) foi utilizada como um ponto final para o resultado do paciente. No conjunto de dados GSE6532 [22], tumores com prognóstico reservado exibido significativamente maior repressão gene FText em comparação com aqueles com bom prognóstico (n = 401; p = 0,031, Figura 2A – à esquerda do painel). O poder estratificação da FText abrangeu tumores de todos os graus. Além disso, o classificador melhorou ainda mais a subclassificação do subconjunto composto apenas de tumores intermediário e alto grau (n = 258; p = 0,011, Figura 2A – painel da direita). Em outras palavras, FText identificados de forma confiável pacientes que fizeram mal em situações em que o prognóstico baseado histopatologia tradicional foi limitado em termos de fornecer uma previsão precisa. A reprodutibilidade do desempenho classificador FText foi ainda demonstrada num conjunto de dados independente [23] – GSE11121 através de todos os tipos (n = 200; p = 0,013, Figura 2B – painel da esquerda), bem como em uma análise separada de cancro da mama de grau intermediário e de alto (n = 171; p = 0,013, figura 2B – painel da direita). Nomeadamente em todas as análises, FText foi um melhor preditor independente do resultado dos casos de grau intermediário e alto em comparação com parâmetros prognósticos convencionais, tais como, o grau do tumor, estado ER, positividade do linfonodo, e o tamanho do tumor (Tabela 1).

A.

Conjunto de Dados 1 (GSE6532) –

FText classificador prediz bem contra o mau resultado para o ponto final da sobrevida livre de metástases à distância (CPOS) (n = 401,

esquerdo do painel

). FText estratificação com base de pacientes diagnosticados com tumores de grau 2 (intermediário) e 3 (alto) (n = 258,

direito painel

). B.

Conjunto de dados 2 (GSE11121) Restaurant – FText previsão de CPOS em um conjunto de dados independente (n = 200,

esquerdo do painel

). Confirmação de FText estratificação com base dos pacientes diagnosticados com grau 2 e 3 tumores (n = 171,

painel direito

).

Os nossos dados de expressão de genes co-cultura combinados e análise FText do tumor primário conjuntos de dados demonstrou que este perfil induzida estroma se manifestou como um continuum. Em um extremo eram padrões relativamente inalteradas dos característica de co-culturas não-malignas expressão do gene, deslocando à repressão mínima de genes FText dentro de tumores primários associados com boa evolução clínica, enquanto que no outro extremo foram altamente reprimida perfis de expressão nos tumores que conferem pior prognóstico do paciente.

a indução de um amplo espectro de alterações funcionais em células malignas por estromal fibroblastos crosstalk

em um esforço para revelar o significado biológico de fenótipos induzidas estroma como determinante da evolução clínica, foram empregados romance tumor primário de mama linhas celulares de diferentes grau histológico [21], em uma variedade de ensaios funcionais. Reflectindo a análise biofunction enriquecido de genes FText, ensaios robustos foi dada prioridade, onde podem ser empregues pontos finais quantificáveis, e que pode ser prontamente realizada em vista das limitações na disponibilidade de culturas estromais de vida finito. Especificamente, as mudanças nos terminais funcionais dos principais programas de celulares, tais como a cinética de proliferação hyperactivated; neutralização estresse oxidativo; e evasão apoptótica da morte celular foi investigada em células tumorais co-cultivadas com fibroblastos derivados de tecido mamário humano maligna ou não maligna:.

(1) de distribuição do ciclo celular de células cancerosas reprogramadas

Dez cancro da mama primário independente linhas de células sob condições de controlo e de TF-co-cultura foram marcadas com BrdU e analisadas por FACS. alterações do ciclo celular induzida por co-cultura encontram-se resumidos na Tabela 2. Os gráficos de pontos de linhas de células representativas estão ilustrados na Figura 3A. Os dados demonstraram perfis do ciclo celular dependente de grau distintivas. Em resposta a sinalização celular estromal, grau 1 (CCdl22, CCdl68) e grau 2 (CCdl1570) derivada de tumor de linhas de células exibido ou (a) não houve alteração significativa na distribuição de ciclo celular em comparação com os controlos não co-cultivados, ou (b) a indução do ciclo celular prisão no /M-fase G2, indicando ativação de um ponto de verificação de reparação pós-replicativo /DNA. Em contraste, as células tumorais grau 3 (CCdl54, CCdl257, CCdl675), incluindo um carcinoma ductal alto grau

in situ

(DCIS) linha de celulares derivados (CCdl1797) e linhas adicionais de tumores de grau 2 (CCdl66, CCdl329, CCdl1599) apresentaram um aumento significativo na população em fase S, indicativo de (a) a síntese de ADN defeitos /replicação devido ao bloqueamento dos garfos de replicação, ou (b) uma taxa de proliferação mais rápida da célula. Notavelmente, a especificidade da resposta das células do tumor era comum entre as amostras de fibroblastos independentes.

. análise do ciclo celular de linhas celulares de tumor de mama primários em co-cultura com fibroblastos de 2 amostras independentes, TF1, TF2 e. Os gráficos de pizza resumir dados de FACS. Os números indicam as células por cento em fase S do ciclo celular. Cada valor é a média de pontos de dados em triplicado. FACS representativos dot parcelas são mostrados para o controle (à esquerda do gráfico de pizza correspondente) e de células TF2-co-cultivadas (direito de gráfico de pizza correspondente). Nota efeitos variados de co-cultura de estroma no ciclo celular do tumor. B. Medição da cinética em fase S, ao longo do tempo em linhagens celulares representativas de grau 1 e grau 3 na presença de células TF1 e TF2. Nota efeitos contrastantes de células estromais sobre a taxa de replicação de linhas celulares mostrado. As barras de erro representam o desvio padrão da média dos valores em triplicado. diminuição induzida por fibroblastos em células marcadas com BrdU em células de tumor de grau 1, e um aumento correspondente no grau 3 células tumorais foi significativa em todos os pontos de tempo (p 0,005 e p 0,001, respectivamente)

(2) as alterações dramáticas na velocidade de proliferação de células tumorais.

para confirmar que um aumento da fracção da fase S em resposta a sinalização estromais no grau 3 células de tumor, de facto representada uma taxa de proliferação mais rápida em comparação com linhas 1 celulares grau, os representantes de cada grupo em co-cultura com 2 amostras TF independentes foram pulsadas com BrdU em vários pontos de tempo ao longo de um período de tempo de 1 hora. medições de FACS da fracção de células que incorpora-BrdU ao longo do tempo fornecida uma estimativa fiável da taxa de síntese de ADN em células tumorais com e sem exposição a sinalização de fibroblastos. cinética de proliferação de 1 (CCdl22) coculturas grau confirmou ainda a G2 /M detenção induzida por fibroblastos previamente observado. a paragem do ciclo celular foi mantido durante todo o curso do tempo experimental, levando a uma descida acentuada (até 70%) na percentagem de células BrdU-incorporando (Figura 3B). Em flagrante contraste, no grau 3 co-culturas (CCdl675), um aumento dramático de pelo menos 47% e até 60% ocorreram na taxa de replicação com base nas inclinações das curvas de crescimento em comparação com células de controlo. Indução de uma taxa de proliferação mais lento ou mais rápido nas células tumorais de grau 1 e grau 3, respectivamente, foi consistente entre as amostras de fibroblastos independentes.

(3) proteção contra a morte celular por apoptose assistida por Stroma.

para avaliar se a sinalização do estroma aumenta a sobrevivência e a propagação de células tumorais co-cultivadas, o antagonista de ESR1, 4-hidroxi tamoxifeno (OHT), conhecido por exercer os seus efeitos anti-tumorais por indução de stress oxidativo e apoptose subsequente, foi usada para iniciar a morte celular em linhas celulares , que exibiu um aumento em percentagem da fase S em resposta a co-cultura. As linhas celulares derivadas a partir de ambos grau 2 (CCdl329 e CCdl1599) e grau 3 foram avaliadas (CCdl675) tumores. Um índice apoptótico experimentalmente derivado comparando uma única concentração de 10 uM OHT sem controlo OHT permitiu um ensaio padronizado, em que os efeitos protectores da co-cultura relativos do estroma poderia ser medido por coloração com anexina-V. Em primeiro lugar, uma comparação entre apoptose basal em linhas celulares tumorais (CCdl675, CCdl329 e CCdl1599) cultivadas isoladamente ou como co-culturas com 3 fontes de fibroblastos independentes (uma redução mamoplastia-derivada, designado como EF, e 2 tumor derivado ou TF) demonstraram uma induzida estroma efeito protector (Figura 4A). A fracção foi reduzida apoptótica por 30-60% em linhas celulares de grau 2 (CCdl1599 – p 0,002; CCdl329 – p 0,001), e em 85% no grau 3 células (CCdl675 – p 0,005). Mais significativamente, o aumento dramático na morte celular induzida por OHT também foi suprimida pela exposição prévia de todas as linhas de células de tumor de 3 a co-cultura de fibroblastos. fibroblastos de estroma de ambos derivação maligno e não maligno foram igualmente eficazes na eliciação de inibição da apoptose em células de tumor (p 0,001) (Figura 4B). Embora seja possível que a variabilidade na resposta celular ao OHT evidente em co-cultura é em grande parte um reflexo da actividade ESR1 diferencial, os nossos dados sugerem fortemente que o crescimento induzir sinalização parácrina em células tumorais poderia potencialmente alterar a sensibilidade à terapia hormonal e desempenhar um papel no aquisição de um fenótipo de resistência.

a. Redução da fração de apoptótica da linha de base medida como células positivas anexina-V por análise FACS. Três linhas de células de tumor independentes foram co-cultivadas com não maligna (EF), e (TF1) derivadas de tumor e fibroblastos (TF2), e em comparação com sozinho tumorais culturas de controlo para alterações no índice apoptótico. FACS representativos perfis subjacentes às resumos gráficos e células positivas por cento anexina-V são mostrados. Nota diminuição significativa na fracção apoptótica de todas as 3 linhas tumorais (* P 0,005). B. Resistência à morte por apoptose induzida por OHT em células tumorais co-cultivadas com amostras EF e TF em comparação com tumor tratados com drogas de controle sozinho. Nota notável repressão da morte celular induzida por OHT por co-cultura. C. Neutralização dos níveis de ROS celulares C400, medida como fluorescência média de intensidade (IFM) por análise de FACS. Os resultados são expressos como percentagem de redução de fluorescência ao longo da linha de base das culturas de controlo de tumor versus co-culturas. FACS representativos perfis que representam os resumos gráficos e valores das IFM são apresentados. declínio na Nota-OHT induzida C400 MFI de todas as linhas tumorais (* P 0,005). D. Coculture induzida substituição da prisão G1 OHT mediada em células tumorais. Nota redução no aumento induzido por OHT por cento da população G1 em linhas de células tumorais co-cultivadas (* P 0,005). Cada ponto de dados representa uma média dos valores em triplicado, em todos os painéis da figura. As barras são codificados por cores nos painéis B e D para representar o seguinte: Controle -untreated cinza, preto – de controlo tratado com OHT, branco – tratamento OHT da EF co-cultura, azul – tratamento OHT da TF1 co-cultura, vermelho – tratamento OHT de TF2 co-cultura.

(4) A redução do stress oxidativo nas células tumorais.

A intensidade média de fluorescência de coloração C400 servido bem como um indicador dos níveis endógenos de ROS, ainda que eles são geralmente baixos em tumoral linhas de células, em comparação com tipos de células inflamatórias. Um declínio acentuado na acumulação de ROS induzida OHT foi observada em linhas de células de tumor (CCdl1599, CCdl329, e co-cultivadas CCdl675) antes do tratamento com fármaco (Figura 4C). A redução média da ROS com co-cultura foi de 34% (p 0,0001). Todas as três linhas celulares foram consistentes no seu grau de resposta a fibroblastos derivadas de tecido maligno e não-malignas.

análise do ciclo celular demonstrou uma prisão-OHT induzida fase G1 em todas as linhas celulares tumorais testadas, que variavam de 35% para aumento de 73% nesta fracção (p 0,001). Além disso, uma ligeira acumulação da fracção G2 /M foi também evidente em 2/3 linhas celulares de tumores (p 0,02) na presença do antagonista da hormona terapêutica. Em co-culturas de 2/3 linhas celulares de tumores (CCdl1599, CCdl675), a fracção preso-G1 diminuiu significativamente, apesar da exposição OHT (p 0,001) (Figura 4D). O efeito protector do co-cultura de fibroblastos não foi tão aparente na linha CCdl329 uma vez que exibida resistência relativa ao tratamento OHT como indicado pelo menor aumento na fracção G1 – sugerindo que a G1 /S do ponto de verificação pode estar com defeito nestas células. Curiosamente, apesar da indução de apenas uma ligeira paragem em G1, células CCdl329 foram responsivos à apoptose induzida por OHT (Figura 4B). Tais respostas diferenciais aos OHT sugerir outras fontes de variabilidade nos tumores de mama, o que modificar ainda mais o resultado de interações tumor-estroma, e refletem fontes adicionais de heterogeneidade.

Em conjunto, nossos dados demonstram que fibroblastos co-cultura facilitou um paralelo redução de 3 parâmetros independentes, mas estreitamente ligados, do dano induzido OHT: acumulação de ROS, a paragem em G1 e morte celular por apoptose dentro de um subconjunto agressivo de linhas celulares derivadas de tumores de mama primário. No entanto, apesar do tumor promover a resposta exibida por estas linhas de células, a variação marcada foi evidente. células CCdl329 eficazmente evitada a apoptose induzida por OHT mesmo que a paragem em G1 na presença da droga foi apenas parcialmente superada por co-cultura. Em contraste, as células CCdl675 eram relativamente deficiente em superar o fardo apoptótica apesar da redução ROS observado e um declínio marcante no G1 e G2 /M preso fração, consistente com nossas observações de reparação deficiente que culminam em aumento da instabilidade genômica (dados a serem publicados em outros lugares ).

estromal fibroblastos induzida impacto funcional é reversível

Finalmente, para avaliar a reversibilidade dos terminais distintos e deterministas de agressividade crescimento induzido estroma, as células tumorais foram analisados ​​ao longo de um período de recuperação de curto prazo para reversão de alterações do ciclo celular e a indução de morte celular, após as condições de co-cultura foram interrompidas (Figura 5A). A remoção do estroma influência a partir do grau 3 (co-culturas CCdl675) inverteu o aumento da fase S marcante sobre o controlo durante o período de teste de 48 horas. No entanto, o aumento na morte celular por apoptose não foi detectado durante este período (dados não mostrados), confirmando que o aumento induzido por co-cultura na fracção marcada com BrdU de células tumorais representada uma população maior de bicicleta, em vez de acumulação na fase S devido à replication- prender e estagnação garfo. No caso de a última possibilidade, a cessação de co-cultura teria levado para a célula a progressão do ciclo nas células tumorais abrigar um conjunto unreplicated de cromossomos, que culminou em catástrofe mitótico e morte celular. No grau 1, as células de tumor (CCdl22), que responderam a co-cultura, exibindo um aumento médio de 64% na fase G2 /M preso população em relação ao controlo (p 0,001), do ciclo celular foi observada re-entrada após a remoção de fibroblastos. No entanto, como a cultura atingiu confluência dentro do prazo experimental, uma subsequente detenção G0 /G1 foi evidente em ambas as células de controlo e co-cultivadas grau 1, sugerindo fortemente que (a) as células tumorais foram reparação do ADN provável proficiente, como a remoção de efectores estromais encimada a barreira G2, e que o potencial de (b) o crescimento estava intacto, mas sensível a regulação negativa por sinalização parácrina. Tinha a G2 /M do ponto de verificação não foi reversível, mas em vez disso, devido ao aparecimento de paragem da mitose em co-culturas, que teria resultado na morte celular apoptótica, como detectável um aumento significativo na população subG1 dentro do período de teste.

UMA. perfis comparativos do ciclo celular de células de tumor de grau 1 e grau 3 depois de 7 dias de co-cultura de fibroblastos, seguido por um período de 48 h, sem co-cultura. Nota marcada redução da população G2 da linha celular de grau 1 após o término das condições de co-cultura. Ambas as populações controle e teste exibir sinais de parada G0 /G1 devido à confluência cultura. Na linha de tumor de grau 3, ciclismo pós células co-cultura retorna para controlar perfis. Numerados segmentos gráfico de pizza indicam a porcentagem de células em G1 e fase S. SubG1: amarelo; G1: verde; S: red; G2 /M: azul. B.

O modelo FText

:

através da aplicação de co-culturas interativos ao vivo de fibroblastos do estroma e epitélio derivado do tumor primário de variar o grau histológico, FText oferece novos insights sobre a base biológica do teor- estratificação associado de câncer de mama primário. Propõe-se que as linhas celulares derivadas de tumores bem diferenciados associados com bom prognóstico clínico recapitulam as suas características funcionais, na presença de fibroblastos estromais

in vitro

. Do mesmo modo, as células de tumor derivadas de lesões malignas pouco diferenciadas conservam a capacidade contextual para responder à mesma influência parácrina de uma forma correspondente à agressividade do cancro e perda paciente. Tais sistemas de modelos autênticos são uma ferramenta essencial para o avanço dos objetivos da pesquisa na biologia do câncer.

No geral, os resultados experimentais deste estudo são consistentes e de suporte de dados sobre resultados clínicos diferenciais derivadas por meio de análise de perfil FText correlativa de câncer de mama primário. Juntos, eles fornecem um quadro romance conceitual para a associação significativa entre o padrão de expressão FText no tumor moderadamente e pouco diferenciados ou grau 2 e 3, respectivamente, e o papel do estroma na indução do crescimento rápido e prognóstico clínico. Em contraste, a indução checkpoint em células bem diferenciadas ou grau 1 tumorais mediadas por sinalização estromal corresponde ao padrão de expressão gênica observado de tumores primários, que conferem uma boa evolução clínica (Figura 5B).

Discussão

para uma visão completa de desenvolvimento e progressão do câncer, uma definição abrangente de fontes subjacentes que contribuem para a manifestação de fenótipos malignas e sua heterogeneidade, é crítica. Em estudos anteriores, temos identificada exclusivamente fenótipos intrínsecas reflectindo variabilidade de tumor histológico, mas independente de influências contextuais, tais como a indução do estroma [21]. Ao empregar co-cultura experimental em conjunto com novas linhas celulares de tumores primários, aqui a nossa abordagem identificou FText, uma resposta programada a fatores secretados estroma. Em vez de um impacto do estroma que promove ou inibe uniformemente todos os tumores, os nossos dados demonstram a importância da capacidade de resposta epitelial variável na evolução da doença. Juntamente com análises correlativas de tecido clínica, tais estratégias de investigação ainda de amplo escopo focados para definir o quadro funcional de fenótipos câncer poderia melhorar substancialmente o alcance e precisão de identificação do alvo druggable.

O perfil FText gerada através de co-cultura experimental retrata regulação do estroma dos grandes programas biológicos, sugerindo um papel fundamental para a promoção assistida por estroma das marcas iniciais de câncer abrangente evasão de circuitos reguladores, como a vigilância imunológica, estresse oxidativo, e deficiência metabólica [24], para além das características de câncer avançado [25]. Consequentemente, o perfil de expressão FText foi encontrado para ser associado com um mau resultado clínico em dois conjuntos de dados independentes, representando mais de 600 casos. Consistente com estes dados clínicos correlativas, temos ainda demonstrado, que os efeitos funcionais a jusante das mutações induzidas transcricionais estroma foram dramaticamente variável entre as células de tumor da mama primárias de derivação histopatológico divergente. Em células de câncer de mama agressivos, efeitos de promoção de tumores eram evidentes como uma maior capacidade para a neutralização estresse oxidativo, evasão de apoptose e ciclo celular rápida.