Abstract

Uma série de novos compostos antraceno L-rhamnopyranosides foram concebidos e sintetizados e suas atividades anti-proliferativa em células de câncer linhas foram investigados. Descobrimos que um derivado de S-8 (EM-d-Rha) proliferação de células fortemente inibida de um painel de diferentes linhas de células de cancro humanas, incluindo A549, HepG2, OVCAR-3, células HeLa e K562 e as linhas celulares SGC-790, e exibida IC50 valores em baixa micro-molar faixas, que são dez dobras mais eficaz do que a emodina. Além disso, encontramos EM-d-Rha (3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-

O

-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin) induzida apoptose celular substancialmente de HepG2 e células OVCAR-3 na fase de crescimento inicial. Além disso, o EM-d-Rha levou a uma diminuição do potencial transmembrana mitocondrial, e supra-regulados a express de factores de apoptose das células de uma forma dependente da sua concentração e do tempo. Os resultados indicaram o EM-d-Rha pode inibir o crescimento e proliferação de células HepG2 através da via de indução de apoptose, e o mecanismo molecular possível pode ser devido à activação da via de sinal apoptótico intrínseca

citação:. Xing Jy, Song Gp, Deng Jp, Jiang Lz, Xiong P, Yang Bj, et al. (2015) efeitos antitumorais e Mecanismo de Derivados Novel Emodin ramnosídeo contra células cancerosas humanas

In Vitro

. PLoS ONE 10 (12): e0144781. doi: 10.1371 /journal.pone.0144781

editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Recebido: 30 de julho de 2015; Aceito: 22 de novembro de 2015; Publicação: 18 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Xing et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa principal do Programa de Ciência e Tecnologia de Cantão (PX, 11C32100704), China, Projeto Reserch de Medicina chinesa Administração da província de Guangdong (px, 2.010.276), China e da Fundação de Ciência Natural de Jovens (GPS pX, B020602), China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

emodina (3-metil-1, 6, 8-trihydroxyanthraquinone) (Figura 1), uma antraquinona amplamente distribuída, é derivada a partir de raízes e rizomas de

Rheum palmatum

L., e outra plantas, tais como

polygonum

,

Rhamnaceae

,

Leguminosae

, e

Liliaceae

. Emodina é um componente importante de ervas chinesas e estruturalmente semelhante à antraciclina. Tem o mesmo cromóforo tricíclico esqueleto plana como determinados antibióticos anti-tumorais, tais como daunorrubicina e mitoxantrona, que pode intercalar de ADN das células cancerosas. A actividade antitumoral de emodina tem sido bem documentada. Foi demonstrado que possuem emodina antiproliferação, prevenir a metástase do cancro [1-3], sensibilização de células cancerosas a agentes quimioterapêuticos e radioterapia [4-6], anti-angiogénicos [7, 8] e invertendo resistente a múltiplos fármacos (MDR) de células cancerosas [ ,,,0],9]. Foi confirmado que a emodina é um agente inibidor de largo espectro de células de cancro, incluindo leucemia [10, 11], o cancro do pulmão [12-14], cancro escamoso da língua humana [15, 16], o cancro do cólon [17, 18] , câncer de vesícula biliar [19-21], câncer pancreático [22-24], o cancro da mama [25-27], o cancro do colo do útero humano [28] e células de carcinoma hepático [29-31]. Os mecanismos de emodina anticancro foram envolvidos em muitos processos biológicos [32-34], tais como a caseína cinase Ⅱand ERK1 /2. No entanto, emodina é um agente quimioterápico insatisfatória para o câncer, devido à sua deficiência em bioatividade, relativamente pobre biodisponibilidade e toxicidade in vivo. Apesar disso, emodina, como um composto natural, proporcionam uma excelente base para desenvolver romance quimioprevenção e agentes quimioterápicos contra o câncer (Fig 1). Desde potenciais candidatos de produtos naturais foram consideradas como uma das estratégias mais produtivas na descoberta de medicamentos atual e desenvolvimento [35].

Até agora, a modificação estrutural da emodina, principalmente envolvidos na transformação da cadeia lateral , incluindo metilo, hidroxilo e porção de anel arilo. De facto, foi mostrado que a introdução de cadeias laterais, tais como polymethyleneamine, açúcar ou heterociclo de emodina podem reforçada a actividade anti-tumor [36-38]. Além disso, os outros derivados alcançado através da introdução grupos amino e ligações glicosídicas também apresentaram maior actividade anticancerígena [39-41]. Emodina derivado glicosídeo foram isolados de

R

.

nepalensis

,

Rhamnaceae

plantas [42],

Rhamnus frangula L

. [43] e

Rumex japonicus Houtt

. [44]. Alguns derivados de glicosídeos emodina naturais, tais como

frangulin B Comprar e

2

,

3-di-O-acetylfrangulin A

[45-47], mostrou aumento significativo da actividade antitumoral de emodina. Estes estudos demonstraram que a adição de cadeias de açúcar no local de C3-OH na molécula emodina, não só aumentou a sua solubilidade, mas também melhorou significativamente a sua actividade anti-tumor [46]. Até agora, contudo, a investigação sobre a emodina derivados de modificações de glicosilação é raramente relatada. Recentemente, sintetizaram uma série de novos antraceno L-rhamnopyranosides derivados de emodina ligando L-rhamnopyranosides a uma molécula aromática planar (Figura 2) [48]. Neste estudo, foram rastreados e analisados ​​os efeitos anti-tumorais de todos os derivados. Descobrimos um composto, EM-d-Rha, inibir fortemente o crescimento e proliferação de células cancerosas, que foram quase dez pregas mais forte do que a emodina. Neste estudo, demonstrámos ainda a actividade antiproliferativa do EM-d-Rha em células de cancro, e exploramos a acção mecanismo de EM-d-Rha inibir o crescimento e proliferação de células HepG2.

Materiais e Métodos

emodina derivados sintetizados

A síntese dos compostos alvo S-2, S-3, 4-S, S-5, S-6, 7-S, S-8, S-9 foi o mesmo descrito anteriormente (Figura 2) [48].

linhas de células e reagentes químicos

Humano A549 do cancro do pulmão, carcinoma hepático humano HepG2, cancro da mama humano MCF-7 , câncer de próstata humano PC-3, o cancro cervical humano HeLa, Human crónica K562 leucemia mielóide, Human câncer gástrico SCG-7901, células de rim de Madin-Darby Canine (MDCK), células do fígado normal humana L02 e Humanas OVCAR-3 células de câncer de ovário foram obtida a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). Todas, excepto células K562 de leucemia foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de humidade controlada, contendo 5% de CO2 em Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com bicarbonato de sódio (2,2%, w /v), L-glutamina (0,03%, w /v), penicilina (100 ug /mL), estreptomicina (100 ug /mL), e soro fetal de bovino (FBS, 10%). células de leucemia K562 foram cultivadas em meio RPMI-1640 completo suplementado com 10% FBS.

A cisplatina (

Tokyo Chemical Industry Co

.

LTD

), HCPT (

SHAANXI Sciphar Natural Products Co

.

Ltd en), sulfóxido de dimetilo (DMSO,

MP Biomedicals

LLC), soro Fetal de bovino (FBS, Hyclone, EUA), de Dulbecco Modified Eagle Médium ( DMEM,

Hyclone

,

EUA

), RPMI mídia 1640 (

Hyclone

,

EUA

), penicilina estreptomicina Duplo antibiótico (

SIGMA -ALDRICH

), 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT,

Sigma-Aldrich

), 0,25% de tripsina-EDTA (

Gibco

,

EUA

), Trypan Blue Stain (

Sigma-Aldrich

), Hoechst 33342 coloração Solution (

dias Pik Instituto de Biotecnologia

,

JiangSu

), apoptose-DNA kit escada Extraction (

dias Pik Instituto de Biotecnologia

,

Jiangsu

), anexina Detecção de apoptose kit V-F1IC /7-AAD (

BD Pharmagen

empresa,

EUA

), PI /RNase coloração Solution (

BD Pharmagen empresa

,

EUA

), EZNA

TM total RNA Kit II (

OMEGA

), M-MLV Reverase Transcriptase (

Promega

), dNTP (

Promega

), Oligo (

Promega

), Mix master GoTaq®qPCR (

Promega

).

A proliferação celular e viabilidade celular ensaio

A viabilidade das células cancerosas foi avaliada por ensaio MTT. Resumidamente, as células foram inoculadas em placas de cultura de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 /cavidade com meio completo contendo 10% de soro fetal de vitelo, num volume final de 0,2 mL. As células foram incubadas a 37 ° C durante pelo menos 24 horas para permitir a ligação óptima. Quando as células atingiram 60% de confluência, foram tratados com cisplatina, e HCPT emodina rhamnopyranosides derivados em várias concentrações, e incubadas numa atmosfera de 5% de CO com humidade controlada

2 incubadora a 37 ° C durante 72 horas. Médio foram trocados a cada 24 horas. grupo de controle celular e de grupo em branco foram criadas da mesma forma, com cada grupo que tem seis poços paralelos. A sobrevivência celular foi avaliada através da adição de 22 uL directamente de 5 mg /ml de MTT a 0,2 mL de meio. Depois de três horas, o precipitado de formazano foi dissolvido em 200? L de isopropanol por poço, e completamente misturados sob temperatura ambiente. Em seguida, a densidade óptica de cada poço foi detectado a 570 nm de comprimento de onda pelo leitor de microplacas iMark (

Bio-Rad

,

EUA

). Esta experiência foi repetida pelo menos três vezes.

A análise morfológica

Para observação morfológica, as células HepG2 em fase de crescimento logarítmico foram semeadas numa placa de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 /cavidade com 0,2 ml de meio completo contendo 10% de soro fetal de vitelo. As células foram deixadas ligar-se a 37 ° C durante 24 horas. Em seguida, as células foram tratadas com o EM-d-Rha e HCPT numa concentração específica. Cada grupo tem seis poços paralelos. As células foram incubadas numa atmosfera humidificada de 5% incubadora de CO2 a 37 ° C durante 72 horas. Médio foram trocados a cada 24 horas. Após 48 horas, os estados de crescimento e alterações morfológicas de células HepG2 foram observados com um microscópio invertido (

Nikon

,

Japão

).

ensaio de microscopia de fluorescência

HepG 2 foram inoculados em duplicado a 3 × 10

5 densidade /alvéolo em placa de 6 poços, e deixadas a ligar a 37 ° C durante 24 horas. Em seguida, as células foram tratadas com HCPT 10 uM, 25 uM e emodina concentração específica EM-d-Rha (0,1 uM, 0,5 uM, 2.5μM), respectivamente. grupo de controlo de células foi ajustado da mesma maneira. Em seguida, as células foram incubadas numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C durante 72 horas. Médio foram trocadas como descrito anteriormente. No final, todas as médias foram rejeitados e as células foram digeridos com 2 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,25% a 37 ° C durante 5 min. Depois as células foram recolhidas, as células foram lavadas duas vezes com PBS seguido de centrifugação a 300 x g durante 5 minutos. Finalmente, as células foram re-suspensas em 100 uL de PBS frio, depois o sobrenadante foi descartado. As células foram cultivadas no escuro durante 10 minutos à temperatura ambiente após a adição ml Hoechst 33342 solução de 100 uL de 1 mg /coloração. As células foram recolhidas outra vez, como descrito anteriormente para descartar a solução de coloração. Lavam-se as células colhidas duas vezes com PBS antes de se aplicar às lâminas de vidro limpas. As alterações morfológicas de células núcleos foram observadas e fotografadas ao microscópio de fluorescência (

Olympus

,

Japão

) a 350 nm de comprimento de onda de excitação. O experimento foi repetido três vezes.

escada de DNA ensaio

formação de escada de DNA é um critério importante para determinar as células da apoptose. Para confirmar o efeito de indução da apoptose, foi realizada a análise da fragmentação do ADN. As células HepG2 em fase de crescimento logarítmico foram inoculadas em placas de cultura de 10 cm de diâmetro a uma densidade de 5 x 10

5 células com 12 ml de meio completo contendo 10% de soro fetal de vitelo, e deixadas a ligar a 37 ° C durante 24 horas. Em seguida, as células foram tratadas com o EM-d-Rha e cisplatina numa concentração específica. As células foram cultivadas e colhidas como descrito anteriormente. Finalmente, o ADN de todas as amostras foi extraído utilizando o kit de detecção de apoptose escada de DNA seguindo as instruções do fabricante. A fragmentação do ADN foi analisada por electroforese num gel de agarose a 1,5% contendo 0,5 mg /ml de brometo de etídio (EtBr) a 5V /cm durante 2,5 horas e fotografado sob luz ultravioleta. O tamanho da fragmentação de ADN foi comparado com o marcador (padrão de peso molecular).

análise de citometria de fluxo

análise de citometria de fluxo foi determinada utilizando Anexina V-APC /7-AAD Apoptosis Detection Kit (

BD Parmagen

,

U

.

S

.

A

). HepG

2 células foram inoculadas a uma densidade de 3 x 10

5 /poço em placas de 6 poços, e deixadas a ligar a 37 ° C durante 24 horas. Em seguida, as células foram tratadas com a concentração específica EM-d-Rha, e cultivadas e colhidas como descrito anteriormente. As células de cada amostra foram ressuspensas em 300 ul de tampão de ligação frio antes de adicionar 2.5μL Anexina V-APC conjugado e solução 5 � 7-AAD. Em seguida, as células foram incubadas durante 15 min em gelo no escuro. A suspensão de células foi diluída até um volume final de 250 � com gelada, 1 × Anexina V Binding Buffer. O ensaio foi conduzido por citometria de fluxo (

BD FACSCalibur

,

EUA

). gráficos de dispersão foram gerados usando celular Quest Software pro (

BD Biosciences

,

San Jose

,

Ca

). A experiência foi repetida três vezes.

Análise do potencial de membrana mitocondrial

HepG

2 células foram inoculadas em placas de cultura de 10 cm de diâmetro a uma densidade de 5 x 10 5>

2 a 37 ° C durante 72 horas. Médio foram trocados a cada 24 horas. As células colhidas de cada amostra foram suspensos em 500 ul de PBS antes da adição de 5 ul rodamina123. Em seguida, as amostras foram incubadas a 37 ° C no escuro durante 15 min. As células foram novamente colhidas por centrifugação a 300 x g durante 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. Os sedimentos celulares foram lavados duas vezes com PBS a 4 ° C. Finalmente as células de todas as amostras foram ressuspensas em 500 ul de PBS. Antes de executar ensaio, ajustar o comprimento de onda de excitação e comprimento de onda de emissão de 480 nm, 520 nm, respectivamente, as mudanças ΔΨm de HepG2 mitocondrial foram medidos com um citômetro de fluxo (

BD FACSCalibur

,

BD Biosciences

,

US

). O experimento foi repetido pelo menos três vezes.

análise do ciclo celular (coloração PI)

células HepG2 em fase logarítmica de crescimento foram inoculadas em placas de cultura de 10 cm a uma densidade de 5 x 10

5 células e incubou-se durante a noite e deixadas a ligar. Depois de ter sido exposto a EM-d-Rha em concentrações específicas de 48h, as células foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS frio. Em seguida, as células recolhidas foram fixadas com 1 mL de PBS e 3 mL de etanol frio a 100% a 4 ° C durante a noite. Depois disso, as células foram novamente colhidas por centrifugação a 300 x g durante 10 min. As células foram lavadas com PBS frio e ressuspensas em 450 ul de PBS, e depois tratou-se com 50 uL de ribonuclease (RNase, 10 mg /mL) a 37 ° C durante 15min. 500 ul de iodeto de propídio (PI, 50 ug /ml) foi adicionada às amostras. Depois as células foram incubadas durante 30 min a 4 ° C no escuro, a distribuição do ciclo celular foi medida utilizando um fluxo FACSCalibur (BD citómetro

BD Biosciences

,

EUA

), e 10,000cells foram contados para cada uma das amostras. A percentagem de células em diferentes fases do ciclo celular foi analisada por Jo fluxo (

BD Biosciences

,

EUA

). A experiência foi repetida três vezes.

Gene análise por RT-qPCR

HepG

2 células foram inoculadas em placas de cultura de 6 poços a uma densidade de 3 x 10

5 células /cavidade, e deixadas a ligar a 37 ° C durante 24 horas. Em seguida, as células foram tratadas com concentrações específicas de EM-d-Rha e incubadas numa incubadora humidificada fornecido com 5% de CO

2 a 37 ° C durante 48 horas. Médio foram alteradas uma vez a cada 24 horas. Em seguida, o mRNA foi extraído de cada grupo utilizando E.Z.N.A.

TM RNA total kit II de acordo com as instruções do fabricante. O ARNm extraído foi dissolvido em 20 mL DDH

2O (

Qiagen) contendo pirocarbonato de dietilo (DEPC). A concentração do ARNm foi quantificada com um dispositivo NanoDrop ND-100 (Thermo Fisher Scientific). cDNA foi sintetizado usando 3 ug do mRNA extraído de cada amostra com o sistema de PCR (

Bio-Rad

,

EUA

). A reacção de síntese de ADNc foi preparado de acordo com as instruções do fabricante, misturando 3 ug de ARNm, 4.0μL 5 × tampão de MMLV, 3 uL oligodT18, 0,5 � solução de dNTP a 10 mM, inibidor de RNase 0.8μL, 3.7μL MMLV RTase e 6.0μL DEPC DDH

2O em tubos PCR. A condição de reacção foi 5 min a 70 ° C, 60 min a 42 ° C e 10 min a 4 ° C. Os produtos foram usados ​​para análise RT-qPCR subsequente. O nível de expressão de mRNA foi medido por RT-qPCR utilizando um CFX96

TM C1000 Real-Time PCR System (

Bio-Rad

,

EUA

) .Os primers foram projetados usando idt sistema de software .dna (http //www.idtdna.com). Os iniciadores específicos foram: Cyto C: 5′-AGATGGTGAGCACAAGGTAAG-3 ‘(para a frente), 5′-CTCACTGTCCCACAAAGATACA -3’ (inverso); Caspase 3: 5’CCTACAGCCCATTTC TCCATAC-3 ‘(para a frente), 5’-GCCTCACCACCTTTAGAACAT-‘ (reverso); β-actina: 5’-GGACCTGACTGACTACCTCAT-3 ‘(para a frente), 5′-CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT-3’ (inverso). Os formatos de produtos de Cyto C, caspase 3 e β-actina foram 91bp, 125bp e 107bp, respectivamente. A reacção de PCR foi realizada num volume final de 20 uL utilizando uma placa de 96 poços óptico. A mistura de reacção consistiu em 10 � de SYBR I verde Mix /GoTaq®qPCR

Mestre Mix (

Promega

), 0.3μL de cada iniciador (10 �), e 1,0 modelo de cDNA mL. PCR condição ciclismo era um ciclo de 5 minutos a 95 ° C, 39 ciclos e cada um dos quais foi constituído por 15 segundos a 95 ° C, 15 segundos a 62 ° C e 30 segundos a 72 ° C, com extensão final a 60 ° C por 5 segundos. O parâmetro de fusão térmica foi investigada para avaliar a homogeneidade da PCR. Cada amostra foi analisada em quadruplicado e significativo foi usado para posterior análise. Os níveis de expressão de ARNm de cada amostra foram quantificadas através da medição dos valores do ciclo limiar (CT) de genes. Os valores relativos da expressão do gene alvo foram calculados de acordo com os valores de TC de genes-alvo e o gene de referência (β-actina) por aplicao do modo de Livak e Schmittgen. Ou seja, ele é igual a 2

-Δ ΔCT, ΔCT é igual à média de Ct para o gene alvo menos a média de Ct para o gene β-actina e ΔΔCT igual ΔCT do ΔCT grupo menos tratada do grupo de controlo.

análise de Western blot

HepG

2 células foram inoculadas, cultivadas e colhidas como descrito anteriormente. Em seguida, a experiência foi realizada em gelo. O sedimento de células recolhido foi lavado com PBS frio, antes de serem ressuspensas em 300 ul de tampão de lise citosol através de vórtice. Em seguida, as células de todas as amostras foram submetidas a lise por sonicação método no gelo usando o disruptor de célula ultra-sons (100 W durante 30 s x 4 vezes). A proteína total de cada amostra foi medida por ensaio de Bradford utilizando reagentes de quantificação de proteína de Bio-Rad. Todas as amostras foram adicionados 2 × tampão de carga antes de analisar em 12% de gel de SDS-PAGE. Em seguida, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose por electro-mancha. As membranas foram bloqueadas em 1% de albumina de soro bovino (BSA) ou solução de leite a 5% à temperatura ambiente durante 30 min, seguido de incubação com o anticorpo primário contra o coelho (

Univ bio-

,

China

) a 4 ° C durante a noite. As membranas foram então lavadas três vezes com TBST 1 ×, cada vez que a duração de 5 minutos. As membranas foram depois incubadas com os anticorpos secundários durante 3 h a 4 ° C, seguido de lavagem com 1 x TBST tal como descrito anteriormente. Finalmente, as bandas imuno-reativa foram detectadas e documentadas utilizando um sistema de transferência de Western quimioluminescente melhorado (

Thermo-científica,

EUA)

em um sistema de imagem Versa Doc.

a análise estatística

Todos os dados foram apresentados como média ± SEM O software estatístico SPSS para Windows versão 17.0 foi utilizado para one-way análise de variância, seguida pelo teste de Tukey HSD para comparações múltiplas, quando apropriado. As diferenças de variáveis ​​medidas entre dois grupos foram comparados pelo teste t de Student. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. GraphPad Prism 5 software (

GraphPad Software

,

Inc

,

San Diego

,

CA

,

EUA

) foi utilizado para a análise. Para RT-qPCR e citometria de fluxo experimentos, os dados eram representativas de pelo menos três experiências independentes.

Resultados

ensaio de viabilidade celular

Nós testamos os efeitos de várias concentrações emodina (S-1) e os seus derivados (S-2, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9) sobre as viabilidades das células de cancro humano testadas linhas (Figura 2 e Tabela 1). Assim, os valores da concentração inibitória semi-(IC

50) foram calculados a partir destes dados. Os dados indicam que os derivados de diferentes inibir o crescimento de diferentes linhas celulares com vários graus (Tabela 1).

De acordo com as normas de avaliação da eficácia de drogas anti-tumor em testes in vitro, o IC

50 valores do composto sintetizado ou extracto de planta deve ser inferior a 10 ug /mL e a eficácia deve tem uma forma dependente da dose, enquanto isso o efeito inibidor máximo deve exceder 80%. Se o composto testado todos os critérios descritos se encontram, considerou-se que possuem propriedades anti-proliferação e efeitos inibidor do crescimento sobre células de cancro in vitro.

Como se mostra na Tabela 1, entre todos os compostos sintetizados, S-8 e S-9 derivados mostraram forte efeito inibitório sobre as células cancerosas do que testados emodina pai. Na verdade, S-8 act melhor do que S-9. Quando em comparação com o IC

50 de emodina, o IC

50 valores de S-8 em A549, HepG2, OVCAR-3 e HeLa diminuiu 7,52, 19,68, 42,3 e 10,56 vezes, respectivamente. Em outras palavras, S-8 melhorada actividade anticancerosa por cerca de dez ordens de grandeza. Notavelmente, HepG2 e OVCAR-3 células foram encontrados para ser suscetível a S-8 derivado.

análise da emodina estrutura e atividade rhamnopyranosides derivados

ensaio de viabilidade celular mostrou que os derivados rhamnopyranosides funcionou melhor que a mãe emodina. Mas ainda não está claro como as estruturas químicas alterados contribuiu para o aumento da actividade. Por isso, analisaram preliminar da relação estrutura-actividade anticancerígena-(Figura 2 e Tabela 1). A partir dos dados in vitro, pode ser visto que a introdução de ramnose pode ajudar a aumentar a actividade anti-cancro (Fig 2). No entanto, a actividade aumentada é relacionado com a forma de ramnose e introduzido na posição de hidroxilo substituído ramnose por grupos acetilo. Se apenas uma ramnose foi introduzido emodina, a solubilidade do derivado foi melhorada, mas a actividade anti-cancro foi pobre (S-3). Além disso, quando o grupo hidroxilo da ramnose foram di-substituído por dois grupos acetilo. A actividade anti-cancro do derivado gerado a partir de 3, 4-hidroxilo de ramnose dissubstituído pela acetil adjacente, é superior à de 2, 3-hidroxilo ou 2, 4-hidroxilo derivado dissubstituído, isto é, o primeiro tem um efeito antiprolifertion forte (S-5). Quando derivado rhamnopyranosides emodina tinha as suas cadeias de açúcar prolongada, a actividade anticancro in vitro foi significativamente aumentada (S-8). Da mesma forma, quando os grupos hidroxilo de C-1 e C-8, a posição da emodina são metiladas, a sua actividade anti-cancro foi também melhorada (S-9).

Efeito inibitório do EM-d-Rha em células de cancro múltipla linhas

Para confirmar o efeito inibitório e actividade antiproliferativa do eM-d-Rha em células cancerosas in vitro, e entender a relação dose-resposta, foi realizada ainda mais as experiências com várias concentrações de eM-d-Rha contra várias células cancerosas. A IC

50 valores foram calculados a partir destes dados.

Como se mostra na Tabela 2 e Tabela 3, podemos ver que o EM-d-Rha tem efeitos anti-proliferativos muito significativa contra várias linhas de células de cancro em um modo dependente da concentração. No entanto, os seus valores de semi-concentração inibitória para células de tecido normal são mais elevados do que para as células cancerosas. É possível que os efeitos inibidores do crescimento de EM-d-Rha sobre as células são selectivos em certa medida.

curva de dose-resposta do EM-d-Rha contra HepG2

o eM-d-Rha exercido um efeito anti-proliferativo em células HepG2 significativo, os resultados levou-nos a investigar e comparar as curvas de dose-resposta de eM-d-Rha com a de emodina, cisplatina e HCPT. Tal como mostrado na Fig 3, o efeito inibidor do crescimento do EM-d-Rha em células HepG2 exibiu um modo dependente da dose. Com o aumento da concentração log do EM-d-Rha, a percentagem de inibição de células HepG2 aumentou significativamente (Figura 3). Além disso, a actividade do EM-d-Rha foi mais forte em comparação com a de emodina contra células HepG2. No entanto, ele é inferior quando comparada com a da cisplatina e HCPT contra células HepG2.

Quatro curvas representam a curva dose-resposta de HCPT, EM-d-Rha, Cisplatina, e emodina contra células HepG2 da esquerda para a direito, por sua vez. As barras de erro representam a média ± desvio padrão (três réplicas). O eixo horizontal representa o log da concentração do EM-d-Rha, o eixo vertical representa a percentagem de inibição.

Efeito de EM-d-Rha na morfologia das células HepG2

para ver diretamente o efeito inibidor do crescimento do eM-d-Rha em células HepG2, observamos as alterações morfológicas de células HepG2 após tratados (Fig 4). As mudanças morfológicas das células pode refletir o estado de crescimento e morte. Como resultado, as células não tratadas HepG2 de grupo controle apresentou uma alta confluência de células em monocamada e floresceu na fase de crescimento logarítmica, que tinha características morfológicas evidentes de células eugênicas como conexões intercelulares apertados, membrana transparente, citoplasma cheio e bom desempenho de refração ( Figura 4A). Em contraste, as células-d-Rha-tratados EM mostrou claramente que as alterações morfológicas de apoptose, tais como redução no volume da célula e a perda de contactos célula-célula de uma forma dependente da dose (Fig 4D-4H). Quando tratados com 12.5μM EM-d-Rha, as modificações morfológicas das células HepG2 mostraram características semelhantes às que 2.5μM de HPLC-tratados (figura 4C).

de campo brilhante imagens de microscopia após incubação durante 48 h com HCPT a 0,5 uM; 2.5μM e com o EM-d-Rha durante 48 h a várias concentrações: 0μM (controlo); 0,1 uM; 0,5 uM; 2.5μM; 12.5μM; 62.5μM (ampliação original de 100 ×).

Para investigar se a diminuição viabilidade de células HepG2 tratadas com EM-d-Rha é devido à indução de apoptose, realizou-se a observação morfológica com microscopia de fluorescência que tem maior sensibilidade e contraste. As células HepG2 foram marcadas com um corante de ADN fluorescente Hoechst 33342, que tem alta sensibilidade e baixa citotoxicidade. Ele pode penetrar membrana das células cancerosas, e se ligam DNA e emitem uma forte fluorescência índigo. Hoechst liga DNA nas regiões do sulco que contêm generosa AT sequência base. Tem boa solúvel em água e a estabilidade. Por isso, combina microscopia de fluorescência mais alta sensibilidade com especificidade molecular e o contraste da imagem excepcional. A fim de verificar se o teste for bem sucedido ou não, nós estabelecemos composto HCPT como controlo positivo.

Como mostrado na Figura 5, as células HepG2 mostraram a morfologia nuclear apoptótica típica após a exposição ao 2.5μM HCPT por 48h, e apresentaram perda de célula-a-célula contacto, encolhimento nuclear, blobbing membrana, e fragmentação de ADN de condensação (Fig 5C). Do mesmo modo, quando as células HepG2 foram tratadas com concentrações variáveis ​​de EM-d-Rha, durante 48 h, que mostrava claramente as características de encolhimento nuclear e condensação de ADN, e apresentou um dano agravado dependente da dose (Figura 5D-5F) .Alguns de células HepG2 separado da monocamada e flutuou no meio de cultura, no entanto, o aparecimento nuclear apoptótica não foi observado nos controlos não tratados, as células HepG2 do grupo de controlo apareceu fluorescência azul uniforme (figura 5A). As células HepG2 tratadas com 25 uM emodina também demonstraram alterações morfológicas de apoptose (Fig 5B).

As alterações morfológicas de núcleos das células HepG2 foram observados com microscopia de fluorescência depois incubadas com 25.0μM emodina, 2.5μM HCPT durante 48 h e com o EM -d-Rha durante 48 h a várias concentrações: 0μM (controlo); 0,1 uM; 0,5 uM; 2.5μM (ampliação de 400 × original). Os núcleos fluorescentes condensados ​​e fragmentados (setas brancas) de células apoptóticas são visíveis nas células tratadas, mas não nas células de controlo.

Efeitos de EM-d-Rha sobre a fragmentação de ADN de células HepG2

para investigar se o eM-d-Rha levou a fragmentação de ADN de células HepG2, o que é uma característica importante da apoptose celular. O ADN nuclear foi detectada com o método de electroforese em gel de agarose. Também descobrimos que o EM-d-Rha podem exercer os seus efeitos de indução de apoptose, quando células HepG2 foram tratados com EM-d-Rha, o ADN extraído de células HepG2 apareceu escada típico ou forma fragmentação (Fig 6), foi semelhante ao que o DNA de células HepG2 tratadas com cisplatina apresentaram, no entanto, era diferente com a forma de ADN de células HepG2 não tratadas (Figura 6). O resultado sugeriu que o EM-d-Rha causou a ruptura de cadeia dupla de DNA de células HepG2 e induziu apoptose em células HepG2

Pista M:. Escada de ADN; Pista 6: Controlo; Lanes1, e 2: As células tratadas com 3.0μM e 6.0μM cisplatina; As colunas 3, 4 e 5: As células tratadas com 2.5μM, 5.0μM e 10.0μM EM-d-Rha, respectivamente

Efeitos de indução de apoptose de EM-d-Rha em HepG2 e OVCAR-3. células

Para demonstrar ainda que o eM-d-Rha pode inibir o crescimento e proliferação de células HepG2 e células OVCAR-3 através do mecanismo de indução da apoptose, também aplicada a análise de citometria de fluxo com o método de coloração de anexina duplo V-APC e 7-AAD (7-amino-actinomicina D). A actividade de induo de apoptose de S-8 foi detectado pela ligação entre Anexina V e fosfatidilserina (PS), que distribua principalmente no lado citoplasmático de células vivas, no entanto, durante a fase inicial da apoptose celular, PS emigrar do lado citoplasmático ao lado da parede celular, de modo que este pode gerar vínculo específico entre anexina V e PS. 7-AAD é uma mancha de ácido nucleico, que pode permear as membranas celulares, na fase tardia de apoptose de células e as células mortas e mais tingem o núcleo vermelho. Assim, o uso combinado de anexina V-APC e 7-AAD pode distinguir células apoptóticas tarde a partir de células em apoptose precoce. As células HepG2 e células OVCAR-3 foram submetidos a apoptose após a exposição ao EM-d-Rha em 2.5μM, 5 uM e 10 uM, durante 48 h (Figura 7 e Figura 8). A percentagem de células apoptóticas é mostrada na Tabela 4 e na Tabela 5.

células HepG2 foram incubadas durante 72 h com o EM-d-Rha a 0, 2.5μM, 5um, 10 uM, respectivamente. E as células foram coradas com FITC conjugado com Anexina V e 7-AAD. A: gráficos de pontos representativos de coloração de anexina V-FITC /7-AAD. um: controle, 72h; b: 2.5μM EM-d-Rha, 72h; C: 5 uM EM-d-Rha, 72h; d: 10 uM EM-d-Rha, 72h. 3-(2”,3”-Di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-2’,3’-di-O-acetyl-α-L-rhamnopyranosyl)-emodin