Sumário

Atualmente não há abordagens direcionados moleculares para tratar o cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) semelhantes aos utilizados com sucesso contra o câncer de pulmão de células não-pequenas. Esta falha é atribuível a nossa incapacidade de identificar subtipos clinicamente relevantes desta doença. Assim, é necessária uma abordagem mais sistemática para a descoberta de medicamentos para a SCLC. A este respeito, dois estudos abrangentes recentemente publicado no

Nature,

linha celular de cancro Enciclopédia e do Projeto Genoma do Câncer, fornecer uma riqueza de dados sobre a sensibilidade de drogas e perfis genômicos de muitos tipos diferentes de células cancerosas. No presente estudo, minaram esses dois estudos para novos agentes terapêuticos para SCLC e proteínas de choque térmico identificados, quinases dependentes da ciclina e cinases polo-like (PLK) como alvos moleculares atraentes com pouca atividade ensaio clínico atual em SCLC. Notavelmente, as nossas análises demonstraram que a maioria das linhas de células SCLC agrupadas em um único subgrupo, predominante por qualquer expressão de genes ou análises CNV, levando-nos a ter uma abordagem farmacogenômica para identificar subgrupos de células SCLC sensíveis à droga. Utilizando inibidores de PLK como exemplo, foram identificados e validados uma assinatura gene para a sensibilidade ao fármaco em linhas de células SCLC. Esta assinatura gene podia distinguir subpopulações entre os tumores SCLC humanos, sugerindo sua utilidade clínica potencial. Finalmente, parcelas Circos foram construídos para dar uma visão abrangente de como transcrição, número de cópias e elementos de mutação afeta a sensibilidade PLK em linhas de células SCLC. Tomados em conjunto, este estudo apresenta uma abordagem para prever a sensibilidade de drogas em SCLC para novas terapias direcionadas

Citation:. Wildey G, Chen Y, Quaresma I, Stetson L, Rosa J, Barnholtz-Sloan JS, et al. (2014) Abordagem farmacogenómicas identificar sensibilidade aos medicamentos em Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (9): e106784. doi: 10.1371 /journal.pone.0106784

editor: Gagan funda, Universidade do Colorado Denver, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de maio de 2014; Aceito: 31 de julho de 2014; Publicação: 08 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wildey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Suportado por concessões do University Hospitals Seidman Cancer Center e National Cancer Institute U01 CA062502 (GW, AD), o Mecanismo de Pesquisa Translacional do núcleo (IL , JP) e a Biostatistics Bioinformática núcleo Facility (YC, JSB-S) do Processo Comprehensive Cancer Center (Instituto Nacional do Câncer P30 CA043703), e Pós-Graduação Programa Nacional Science Foundation Research Fellowship (LS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) representa 15% de todos os carcinomas pulmonares, sendo geralmente diagnosticado quando a doença tem metástase [1], [2]. Infelizmente houve apenas pequenas melhorias no padrão de cuidado para SCLC ao longo das últimas três décadas [3] – [5]. Actualmente, não existem abordagens moleculares orientadas para tratar SCLC semelhante às utilizadas com sucesso contra o cancro do pulmão de células não pequenas, (NSCLC), tais como erlotinib segmentação de EGFR mutante ou Crizotinibe direccionamento de proteínas de fusão EML4-ALK [6], [7] . A cirurgia é raramente realizada nesta doença (apenas 1% dos casos), o que limita a disponibilidade de tecido de tumor para análises genómicas completas. Além disso, os dois estudos de genômica seminais recentemente publicados na SCLC têm rendido pouco de visão terapêutica para esta doença e que, principalmente, analisou a forma rara de receptivo SCLC a cirurgia, o que não representa o clássico, SCLC amplamente metastático visto na prática clínica diária [8] [9].

é necessária uma abordagem diferente para a descoberta de medicamentos para SCLC e pode estar na mineração de bancos de dados disponíveis no sensibilidades de drogas de linhas de células SCLC. Isto é, como a maioria das células SCLC são derivadas de metástases ou de derrames pleurais, podem ser representativos de uma extensa SCLC doença e suas vulnerabilidades drogas associadas. A este respeito, dois estudos abrangentes de despistagem de drogas recentemente publicado no

Nature,

linha celular de cancro Encyclopedia (LECC) [10] e do Projeto do Genoma do Câncer (CGP) [11], analisou a sensibilidade às drogas de cancro linhas celulares, incluindo pulmão, e tentou ligá-los aos perfis genômicos. Os perfis genômicos incluídos estado mutacional de DNA, expressão gênica e copiar número variação (CNV) dados

.

No presente estudo, temos especificamente extraiu os dados sobre linhas de células SCLC destes dois estudos e delinear uma abordagem bioinformática para identificar novas terapias para SCLC usando quinase polo-like (PLK) inibidores como um exemplo.

resultados

Inicialmente buscamos uma visão global do CPPC sensibilidade droga no LECC [10] e [11 CGP ] estudos. Houve 53 e 31 linhas de células SCLC testados para a inibição do crescimento de 24 e 92 medicamentos nestes estudos, respectivamente. Os resultados são mostrados nas Figuras 1 (CGP) e S1 (LECC) como boxplots. Uma tabela dos dados numéricos para a eficácia da droga, bem como as linhas celulares outlier, também é dado nas Tabelas S1 (CGP) e S2 (LECC). Esta análise gráfica permitiu identificar drogas que eram amplamente eficaz contra a maioria das células SCLC. Definimos drogas “eficazes” como aqueles que induzem a inibição do crescimento na maioria das células em doses baixas (mediana IC

50≤1 ^ M), representado por paclitaxel. drogas “ineficaz”, representada por erlotinib e sunitinib, não produziu nenhuma inibição de crescimento na maioria das células SCLC (IC

50≥8 uM), embora valores aberrantes ” podem estar presentes. drogas «selectivo», representada por rapamicina, demonstrou um longo boxplot e pode ser considerado eficaz para apenas um subconjunto de linhas de células SCLC.

Há 31 linhas de células de câncer de pulmão de pequenas células. Os boxplots mostram drogas listados no eixo dos X e os correspondentes sub IC

50 valores (em uM) listados no eixo dos y. O “teto” para a eficácia da droga foi fixado em 8 mM; Se o IC

50 de todas as células testadas foi acima desta concentração de uma única linha que aparecem na parte superior do gráfico. Isto representa uma droga ineficaz. Por outro lado, se todas as células testadas eram sensíveis a uma dada droga, e uma caixa suiça lote estreito iria aparecer na parte inferior do gráfico. A linha de dentro de caixas individuais representa o IC mediana

50 o valor de todas as células testadas e os círculos representam as células ‘outliers’ cuja IC

50 valores não são abrangidas pelo quantil 25-75% de todos os IC

50 os valores medidos para que a droga (representada pela caixa)

como mostrado na Tabela 1, as drogas classificadas como “eficaz” para a maioria das células SCLC incluem CGP-60474, um inibidor de CDK.; BI-2536 e GW-843682X, ambos inibidores PLK; bortezomib, um inibidor de proteassoma; e elesclomol, um inibidor de HSP70. Além disso, várias drogas que alvejam o caminho queda PI3K-AKT-MTOR dentro desta categoria, incluindo A-443654, temsirolímus e NVP-BEZ235. Duas drogas com uma mediana IC

50 apenas fora 1 PM incluem AZD-7762, um inibidor de CHK; e JW-7-52-1, um inibidor de mTOR. inibidores de HSP90 (17-AAG) e HDAC (panobinostat) pode também representar drogas “eficazes”, embora a sua eficácia variou entre os dois estudos. drogas “eficaz” provável realizar o melhor potencial translacional.

dados de matriz Gene tem sido amplamente utilizado na pesquisa do câncer para identificar expressão “assinaturas” que podem ser tanto de prognóstico ou previsão do comportamento do tumor. Por isso, nós examinamos se a expressão do gene cluster pode ser utilizado para identificar subgrupos de linhas de células SCLC sensíveis a fármacos, em particular para drogas que demonstraram uma ampla gama de eficácia contra células SCLC na Figura 1. Utilizou-se os dados do estudo CGP por conter a maior quantidade de dados de sensibilidade às drogas. Não supervisionada consenso agrupamento de dados de expressão de genes demonstraram que três grupos de células SCLC foram óptimo (Figura 2). Havia 1006 genes importantes que definiram os subtipos de expressão gênica (Kruskal-Wallis valor-p . 0,05, listadas na Tabela S3 Nós então visualizadas o efeito do agrupamento expressão do gene na eficácia da droga usando uma trama em mosaico (Figura 3). este lote foi utilizada uma escala de cores que divide a sensibilidade ao fármaco em seis grupos. Drugs, listados no eixo-y, foram agrupados em conjunto de acordo com a moléculas alvo. as células, listados no eixo-x, foram agrupadas utilizando a mesma ordem que a obtidos por agrupamento sem supervisão da sua expressão genética. não parece haver qualquer correlação entre a sensibilidade ao fármaco de agrupamento a expressão do gene, contudo, como a sensibilidade droga pareceu ser distribuídos aleatoriamente através de todas as linhas de células para qualquer determinado fármaco. Esta análise gráfica fizeram realçar vários targeted agentes com eficácia de base ampla excepcional contra linhas de células SCLC. Estas drogas incluídas bortezomib, BI-2536 e GW-843682X, bem como o inibidor de HSP elesclomol e o inibidor de CDK CGP-60474, embora com menor eficácia. Estas drogas são idênticas àquelas em destaque na Tabela 1.

agrupamento consenso não supervisionada foi realizada utilizando todas as linhas 31 celulares (apenas 27 tinham dados de expressão de genes disponíveis; 3 deles são duplicados e os valores médios foram obtidos para posterior análise ) e mostrou que 3 clusters era ideal para este conjunto de dados. Com esta atribuição, não paramétrico ANOVA de uma via (teste de Kruskal-Wallis p-valor 0,05) foram obtidos foi realizada nestas 3 clusters e 1006 genes significativos. O mapa de calor foi gerado com esses genes significativos.

sensibilidade droga foi codificados por cores de acordo com a legenda na parte inferior. As drogas são agrupados ao longo do eixo y de acordo com a sua molécula alvo. As células são dispostas ao longo do eixo x idêntico ao seu agrupamento expressão do gene identificado na Figura 2.

próxima determinado se CNV agrupamento podia ser usada para identificar subgrupos de linhas de células SCLC sensíveis a fármacos. Três grupos foram novamente identificados utilizando todos os 426 genes interrogados (Figura 4); no entanto, há não parece haver qualquer correlação entre a expressão do gene e CNV clustering. Rearranjo da trama mosaico na Figura 3 por CNV agrupamento também não revelou quaisquer correlações aparentes (Figura S2). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que as células SCLC sensíveis a fármacos não aglomeram em subgrupos por quer a expressão do gene ou CNV. Por isso, decidiu usar uma abordagem farmacogenômica para caracterizar subgrupos de células SCLC.

agrupamento consenso não supervisionada foi realizada utilizando todas as 30 linhas de células com número de cópias do gene 426 e 3 clusters foram mostrados para ser o ideal para este conjunto de dados. Todos estes 426 genes foram utilizadas para gerar o mapa de calor. dados CNV foi re-codificada de acordo com a seguinte regra: perda 0-complete; perda de 1-parcial; 2 nenhuma mudança; ganho 3~7-parcial; maior ou igual ao ganho de 8 completa.

Nossas análises identificaram inibição PLK ter prometendo eficácia e pouca atividade ensaio clínico em SCLC. Portanto, utilizou-se a inibição de PLK como um exemplo de como utilizar os conjuntos de dados CGP para desenvolver um perfil genómico de SCLC sensibilidade ao fármaco. Em primeiro lugar, procurou para validar a eficácia de inibidores de PLK em CPPC. Nestas experiências utilizou-se as linhas de validação SCLC celular, bem como inibidores, que eram diferentes das utilizadas nos estudos originais para realçar a eficácia destes novos agentes terapêuticos. As linhas de células SCLC utilizados foram H1048, H1688, SW1271 e DMS454. inibidores PLK incluídos BI-6727 (volasertib) e ON-01910 (rigosertib). Nestas experiências irinotecano serviu como um controlo positivo enquanto erlotinib serviu como um controlo negativo. Os resultados são mostrados na Figura 5. É evidente que o IC

50 valores para os inibidores de PLK na maioria das linhas de células situa-se entre 10-100 nM, suportando a hipótese de que as células SCLC são largamente sensível a inibidores de PLK.

as células aderentes foram incubadas com as concentrações indicadas de drogas durante 24 h. O meio de cultura celular foi substituído e a viabilidade celular foi medida por um ensaio de ADN após 48 h de incubação. Cada concentração de droga foi testada utilizando cinco repetições. Os resultados são representativos de pelo menos 2 experimentos.

Inicialmente, buscou-se identificar uma assinatura gene que pode prever a sensibilidade aos inibidores da PLK em coortes de pacientes, já que nem todas as células SCLC demonstrou sensibilidade igual. Foram comparados os dados de expressão gênica para os cinco células SCLC mais sensíveis (H82, H446, H526, COR L88, IST SL1) com que, para as cinco linhas de células SCLC menos sensíveis (DMS114, H64, DMS79, H2171, IST SL2); tal como definido na CGP pelos seus BI-2536 CI

50 valores. Foram identificadas uma lista de 185 genes que foram diferencialmente expressos de forma significativa entre estes dois grupos (listados na Tabela S4). Estes genes foram utilizados 185 para executar o agrupamento sem vigilância de todas as linhas de células de SCLC, resultando no mapa de calor mostrado na Figura 6. Nomeadamente, cinco menos (top box verde) e a maior parte (caixa de topo vermelho) linhas de células sensíveis agrupados em extremidades opostas de o mapa de calor, enquanto todas as outras células (caixas amarelas indicando sensibilidade intermediária e caixas cinzentas indicando sensibilidade desconhecido) agrupados no meio. A seguir, realizada a análise leave-one-out do gene assinatura PLK com as 26 linhas celulares disponíveis. A partir desta análise que geramos 26 heatmaps, onde em cada heatmap as células sensíveis e resistentes permaneceram agrupados, exceto em três heatmaps; em que uma ou duas linhas de células sensíveis foram classificados erroneamente. células resistentes sempre agrupados. Por isso, acreditamos que este gene assinatura PLK é robusto na categorização de linhas de células SCLC sensíveis e resistentes.

As cinco linhas de células SCLC demonstrando a maioria (H2171, H64, IST-SL2, DMS-114, DMS-79 ) e menos (IST-SL1, resistência ao inibidor de PLK BI-2536 no estudo CGP CR-L88, H526, H446, H82) foram utilizadas como padrões para identificar um gene assinatura para a sensibilidade de PLK. Todas as linhas de células SCLC no estudo CGP que continham os dados de expressão de genes foram, em seguida, submetido a agrupamento sem supervisão. O mapa de calor mostra o resultado desta análise. As caixas coloridas na parte superior do heatmap indicam a sensibilidade CGP BI-2536. Verde = células resistentes, vermelho = célula sensível, amarelo = células de intermediário, mas conhecido, sensibilidade, cinza = células de sensibilidade não foi testado, mas com dados de expressão de genes.

Para validar que a assinatura gene PLK faz com efeito, prever a sensibilidade aos inibidores de PLK, determinou-se a eficácia do inibidor de PLK BI-6727 numa linha celular, H1092, que tinha os dados de expressão de gene, mas não há dados de sensibilidade PLK no estudo CGP, representada por uma caixa cinzenta no superior da Figura 6. Como controles, usamos uma linha resistente celular, DMS79 (caixa verde), e duas linhas de células sensíveis, H82 e H526 (caixas vermelhas). Estas células foram escolhidos porque todos eles cresceram em suspensão e pode ser submetido a protocolos de tratamento de drogas idênticas. Os resultados, mostrados na Figura 7, demonstram que as células H82 e H526 foram sensíveis ao inibidor de PLK BI-6727 enquanto que as células não foram DMS79, semelhante aos resultados relatados para BI-2536. Além disso, foi demonstrado que as células H1092, com sensibilidade PLK desconhecido, eram na sua maioria resistentes a BI-6727 como células DMS79, como previsto pelo mapa de calor.

As células em suspensão foram incubadas continuamente com as concentrações indicadas de medicamentos para o 72 h, quando a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTS. Cada concentração de droga foi testada utilizando cinco repetições. Os resultados são representativos de 2 experiências.

Foi interessante determinar se o gene assinatura PLK estava presente em tumores de doentes e poderia potencialmente ser usada para prever a sensibilidade do tumor para os inibidores da PLK. O maior estudo da expressão do gene do tumor SCLC é a de Rudin et ai. [8], que analisou 30 tumores primários de RNA-Seq. Por isso, extraiu os dados de contagem para os 185 sondas presentes em nossa assinatura PLK (representando 173 genes, apenas 169 genes foram encontrados e usado a partir do conjunto de dados Rudin) e padrão normalizado para criar matrizes de expressão gênica PLK substitutos para estes tumores. Estes dados normalizados foi então sujeita a agrupamento não supervisionada para gerar o mapa de calor mostrado na Figura 8. Também incluídos nesta análise a linha de células SCLC H82 que tinha RNA-Seq dados do estudo Rudin e também foi validado por nós na Figura 7 como sendo sensível a o inibidor de PLK BI-6727. Os resultados demonstram dois pontos importantes: primeiro, os subtipos de tumores SCLC podem ser identificados utilizando o gene assinatura PLK, e em segundo lugar, os dados da linha celular H82 agrupado entre um subconjunto de oito tumores primários. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que o gene assinatura PLK gerado utilizando os dados da linha de células SCLC pode ser útil em prever a sensibilidade de tumores específicos de inibidores de PLK.

RNA-Seq dados de Rudin et ai. [8] foi transformada com dados de contagem. Os dados para os genes que compunham o assinatura de expressão do gene de PLK foram extraídos e utilizados no agrupamento de consenso sem vigilância de tumores SCLC e a linha de células H82. A caixa de cor vermelha no topo do mapa de calor indica a localização da linha celular H82, que era uma linha de células de CGP validado como PLK sensível.

Finalmente, utilizou-se parcelas Circos [12], mostrado condensado na Figura 9 e full-view na Figura S3, para visualizar as diferenças genômicas entre linhas de células SCLC sensíveis e resistentes ao inibidor de PLK BI-2536. Notavelmente, as parcelas Circos demonstrar que todas as células resistentes possuía sem sentido ou frameshift mutações em qualquer um

TP53

ou

RB1 ​​

, e às vezes ambos os genes, enquanto que todas as células sensíveis mutações de importância proteína desconhecida exibido (intrônica e missense), tipicamente em apenas um desses genes. Todos menos um dos mutações do gene era homozigótica, indicando que as células resistentes provavelmente não têm RB1 funcional ou proteína TP53. Todas as células sensíveis exibir

MYC

(H82, H446),

MYCN

(H526, IST SL1) ou MYCL

(CORL88) amplificação

, enquanto que apenas uma linha celular exibe resistentes

MYC

amplificação (H2171). Também parece haver pouca ou nenhuma CNV no cromossoma X em células sensíveis em relação a células resistentes, o que tipicamente mostrar alguma perda de CNV. Os genes no cromossoma 13 são geralmente sobre-regulada em células sensíveis PLK e regulados negativamente em células resistentes PLK, enquanto os genes localizados no cromossoma 19 são geralmente regulados negativamente em células sensíveis PLK e regulada positivamente em células resistentes PLK. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a expressão do gene, a CNV e estado mutacional podem todos contribuir para a sensibilidade das células SCLC para PLK inibição.

parcelas Circos são mostradas (esquerda para a direita, na ordem listada) para os cinco mais sensíveis (H82, H446, H526, COR-L88, IST-SL1) e mais resistentes (DMS-114, H64, DMS-79, H2171, IST-SL2) células SCLC à inibição BI-2536 de crescimento, tal como definido na CGP estude. O anel preto exterior designa a localização cromossomo; o próximo anel interno indica o nível de genes assinatura PLK expressão; ea mais interna do anel indica CNV. dados CNV foi re-codificada de acordo com a seguinte regra: 0 perda total; 1 perda parcial; 2 nenhuma mudança; 3~7 ganho parcial; maior ou igual a 8 ganho completa. No centro está o estado de mutação de genes (triângulo aberto: SNP intrônica, círculo preto: SNP missense, quadrado preto: SNP nonsense, triângulo vermelho: inserção frame-shift, triângulo verde: quadro-shift supressão). Todas as mutações eram homozigotos exceto para a inserção frame-turno.

Discussão

cancro do pulmão de pequenas células é uma doença na necessidade urgente de novas drogas terapêuticas. Infelizmente, a limitada disponibilidade de tecido de tumor dificulta a aquisição de análises genómicas completas necessárias para a identificação e validação de novos alvos drugable neste cancro. Assim, estratégias alternativas de descoberta de drogas precisam ser desenvolvidos até a nossa compreensão dos genômica condução SCLC pode começar a aproximar a de NSCLC, que beneficia de análises abrangentes de grandes grupos de tumores de pacientes, como o The Cancer Genome Atlas (TCGA).

neste relatório, têm tido uma abordagem de bioinformática para a descoberta de medicamentos para SCLC a partir da mineração dois grandes estudos de rastreio de drogas em linhas de células cultivadas, o LECC [10] e CGP [11]. Como um sistema modelo, linhas de células SCLC manter perfis de mutação (cósmica) e copiar número muda [13], [14] semelhante ao SCLC humano. Portanto, temos extraídos e analisados ​​conjuntos de dados para linhas de células SCLC, a fim de identificar as sensibilidades de drogas específicas para esta doença, já que esta não era a intenção dos estudos originais, que era de reunir dados através de uma infinidade de linhas celulares a fim de identificar genômico determinantes da sensibilidade ao fármaco. Identificamos quinases polo-like como alvos moleculares atraentes com pouca experiência ensaio clínico atual em SCLC. A inibição do crescimento por inibidores PLK foi validado em nosso estudo, abordando as preocupações levantadas em um relatório recente sobre a inconsistência nos dados de resposta de drogas em grandes estudos de rastreio de drogas [15]. O potencial de translação de inibidores de PLK no tratamento de SCLC é suportada pela nossa demonstração que o perfil de sensibilidade ao fármaco das linhagens de células SCLC reflecte o que é observada clinicamente para tumores metastáticos SCLC [16]. Isto é, a maioria das células eram extremamente sensíveis a inibidores da topoisomerase e de microtúbulos, agentes quimioterapêuticos, que têm actividade contra o SCLC quimio-naïve; pelo contrário, muitos inibidores da tirosina quinase foram ineficazes.

O estudo também identificou CGP sensibilidade às drogas que tendem a agrupar-se em todas as linhas de células (ver suplemento Tabela 1 na referência 11) e do perfil de sensibilidade às drogas para células SCLC, como mostrado na Tabela 1, é muito semelhante a agrupar-4 do estudo CGP [aglomerado 4 = GW-843682X (PLK1), BI-2536 (PLK1 /2/3), a-443654 (AKT1 /2/3), a epotilona B (microtúbulos), CGP-60474 (CDK1 /2/5/7/9), o paclitaxel (microtúbulos) e EM-275 (HDAC)]. Enquanto não está claro se esses agrupamentos de drogas indicam um caminho alvo comum (s), levando à inibição do crescimento, esses agrupamentos podem fornecer um ponto de partida prático para testar drogas terapêuticas combinatórias para a atividade sinérgica no SCLC. Com efeito, nossos próprios dados preliminares revelam sinergismo entre inibidores de PLK e CDK.

Nós desenvolvemos uma análise de sensibilidade altamente integrado de PLK, em linhas de células de SCLC, graficamente representado na Figura 9 como parcelas Circos, que incorpora a expressão do gene, CNV e dados de mutação genética. Uma análise desta profundidade nunca foi previamente aplicada a SCLC, e demonstra o que pode ser conseguido interrogar uma única linhagem de células e classe de drogas no LECC e conjuntos de dados CGP. Além disso, a nossa conclusão de que o gene assinatura PLK para linhas de células SCLC foi disperso entre os perfis de expressão de espécime de tumor SCLC (Figura 8) demonstra claramente que estas células retêm fenótipos de tumor. Recursos nas parcelas Circos como a mutação dupla de ambos

TP53

e

RB1 ​​

na PLK células resistentes, bem como a expressão recíproca de genes assinatura PLK nos cromossomos 13 e 19, são facilmente aparente e deve ser examinada em coortes maiores para determinar a sua contribuição individual para sensibilidade geral inibidor de PLK. Tomados em conjunto, este tipo de análise pode ajudar a identificar eventos genómicas a montante que se correlacionam com fenótipos jusante, tais como sensibilidade PLK.

Foi relatado recentemente que as mutações no

gene em si PLK1

foram os principais responsáveis para resistência adquirida à BI2536 em uma linha de células de cancro do cólon humano em cultura [17]. Este é improvável que seja um mecanismo de resistência em linhas de células SCLC porque as listas de LECC apenas quatro linhas de células com um único

PLK

mutação entre os quatro membros da família PLK (PLK1-4) e 53 linhas de células SCLC examinado. Nenhuma destas linhas celulares PLK mutantes foram incluídos em nosso estudo. Nossa assinatura gene PLK, no entanto, incluem genes nos cromossomos normalmente excluídos (4T, 13q) e amplificados (19p) em SCLC [9], [13], [14], apesar de nossas parcelas Circos revelar nenhuma correlação óbvia entre os dois. Curiosamente, cromossomo Xq, que normalmente não é visto como uma região importante de CNV em SCLC, foi o lar de vários dos genes mais importantes diferencialmente expressos que compõem o gene PLK signature- todos eram membros da MAGE-A, ou melanoma- associada antigénio-A, da subfamília. Esta subfamília de genes está localizado no cromossoma Xq28 e é apenas expresso em células germinais testiculares e células tumorais [18]. Embora a sua função biológica não é clara, eles representam uma classe de antigénios tumorais que estão a ser investigado activamente como um alvo para a imunoterapia [19], [20]. Os genes MAGE-A foram regulados positivamente em linhas celulares sensíveis ao PLK relativos às linhas de células PLK-insensível. Além disso, esses padrões de expressão pode se correlacionar com CNV, como células sensíveis demonstrou pouco CNV no cromossomo X, enquanto que as células mais resistentes demonstraram alguma perda CNV. No momento, estamos testando a importância desta família de genes como um biomarcador da sensibilidade PLK.

Durante nosso estudo um relatório do Sos et al. [21] foi publicado em PNAS que especificamente pesquisados ​​apenas linhas de células SCLC (total de 44) para a sensibilidade de drogas. Dos 267 compostos testados neste estudo, apenas 13 foram também examinadas no LECC e /ou estudos CGP. Curiosamente, quando Sos et ai. olhou para a sensibilidade da droga especificamente no

MYC

-amplified linhas de células, eles também descobriram o inibidor de PLK BI-2536 para ser ativo, similar aos nossos resultados, mas não persegui-lo ainda mais. Eles também demonstraram que a maioria das células sensíveis ao inibidor de Aurora cinase VX-680 demonstrou

MYC

-amplification. Curiosamente, o CGP também incluiu dois inibidores Aurora quinase (VX-680 e ZM-447439) em seu estudo; no entanto, não encontrou qualquer agregação significativa de PLK com inibidores da quinase Aurora, indicando que não há ligação entre essas duas classes de inibidores quando analisado na população em geral de linhas celulares de cancro.

No presente estudo, consistentemente identificados três subtipos de linhas de células SCLC usando agrupamento não supervisionado de qualquer expressão de genes ou conjuntos de dados CNV da CGP ou LECC (Figura S4 e Tabela S3) estudos. Notavelmente, houve pouca concordância entre as duas análises, excepto que uma grande maioria das células aglomeradas em um subtipo predominante, enquanto que as células restantes dividido desigualmente entre dois subtipos menores. expressão gênica e subtipos CNV também não alinhar com a sensibilidade de drogas em geral (ver Figuras 3 e S2) ou sensibilidade PLK, em particular. Isto sugere que uma abordagem genômica abrangente, tais como análise de trama Circos, é necessário para identificar factores determinantes da sensibilidade de drogas e outros fenótipos em SCLC. Esta abordagem integrada pode ajudar a selecionar pacientes SCLC que mais se beneficiariam da utilização como agente único de drogas como HDAC [22] e PLK [23] inibidores que são amplamente eficaz em todas as linhas de células SCLC, mas demonstram actividade limitada em ensaios clínicos.

Outras abordagens únicas foram tomadas para identificar novas e eficazes terapias para SCLC. Jahchan et ai. identificou uma surpreendente sensibilidade de células SCLC aos antidepressivos tricíclicos no estudo um reposicionamento de drogas, que se usaram bioinformática para encontrar drogas que induziu alterações na expressão de genes em frente ao perfil de células SCLC [24] a expressão do gene. arrays de proteínas de fase reversa (RPPA) foram usadas para identificar e PARP1 EZH2 como potenciais alvos terapêuticos em CPPC [25]. Finalmente, existe uma necessidade de revelar a biologia subjacente de SCLC se esperamos fazer quaisquer melhorias no tratamento desta doença semelhante a NSCLC. Infelizmente, apenas cerca de cinquenta tumores SCLC foram submetidos a análise genômica abrangente para Date- sendo a maioria de doença em estágio primário, no início [8], [9]. Portanto, o progresso terapêutico imediato neste campo vai depender descoberta em sistemas modelo, como o descrito aqui, seguido de validação em coortes de pacientes.

Materiais e Métodos

inibição

cultura celular e crescimento estudos

Todas as células foram obtidas a partir de ATCC e cultivadas em sua forma recomendada. A proliferação celular foi determinada quantitativamente por análise de ADN fluorescente [26] por células aderentes ou o ensaio MTS utilizando CellTiter 96 Aqueous One Solution Proliferação de Células Assay Kit da Promega Corp (Fitchburg, WI) para as células em suspensão. As células foram adicionadas a uma placa de 96 poços em 100 ul de meio completo. Drogas contendo meio foram adicionados às concentrações indicadas um dia após a sementeira. O irinotecan foi obtido a partir de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), enquanto todas as outras drogas foram obtidos a partir de produtos químicos Selleck (Houston, TX). Após incubação durante três dias a 37 ° C, o ensaio foi realizado seguindo as instruções do fabricante. Para o ensaio de DNA, a fluorescência foi medida utilizando filtros de excitação /emissão de 355/460 nm enquanto que a absorvência para o ensaio MTS foi medida a 490 nm. Ambos os ensaios foram medidos com um leitor de placas de 96 poços. Cada condição experimental foi ensaiada utilizando cinco repetições. Drogas contendo o meio foi removido a partir de células aderentes após 24 h de incubação e substituído por 100 ul de meio completo, enquanto que as células em suspensão foram cultivadas na presença contínua do fármaco durante 72 h.

conjuntos de dados

o LECC disponível publicamente e sensibilidade de drogas CGP (IC

50), a expressão do gene, CNV, e mutação de dados foi baixado https://broadinstitute.org/ccle (LECC) e https://cancerrxgene.org (CGP) [10], [11]. Os dados RNA-Seq obtidos no estudo de Rudin et ai. [8] foi transferido da base de dados europeia Genoma. Todas as análises de manipulação de dados e estatísticas foram realizadas utilizando o software SAS versão 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC) ou R 2.15.3 (https://www.r-project.org/).

IC

dados de 50 sub

Para SCLC somente, 24 medicamentos e 53 linhas de células foram incluídos no LECC, enquanto que 92 medicamentos e 31 linhas de células foram incluídos na CGP. Todos IC

50 superior a 8 pM no CGP foram thresholded a 8 uM. Boxplots foram desenhadas para o IC

50 dos dois conjuntos de dados, respectivamente, usando R (https://www.r-project.org/). parcelas de mosaico foram tiradas usando proc sgrender no SAS versão 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

dados de expressão gênica análise

Normalização de dados de expressão gênica (Affymetrix U133 mais 2,0 por LECC , Affymetrix U133A para CGP) envolvidos quatro passos: 1) dados em bruto foram normalizados por meio do método robusto média multi-matriz (RMA); 2) sondas sem um nome do gene foram removidos; 3) de dados de nível do gene foi obtido fazendo a média do valor da sonda dentro de cada gene e 4) os dados de nível do gene foi então padrão normalizado pelo gene. Para os dados de expressão de genes, o LECC incluiu 51 linhas de células, enquanto que o CGP incluiu 30 linhas celulares, entre os quais três linhas celulares tinham medições em duplicado. Média das duplicatas gerado 27 linhas celulares exclusivos para o CGP. agrupamento consenso sem supervisão foi realizada nos dados de nível gene normalizados com o pacote R “Consenso Cluster Plus”;