Abstract
High nível de expressão MYC está associada com quase todos os cânceres humanos. linfoma de JQ1, um composto químico que inibe a expressão MYC é terapeuticamente eficaz em modelos animais pré-clínicos em carcinoma de linha média, e Burkitt (LB). Aqui mostramos que JQ1 não inibe a expressão MYC numa extensão semelhante em todas as células tumorais. As células BL mostrou uma diminuição ~ 90% na transcrição MYC após tratamento com JQ1, no entanto, nenhuma redução correspondente foi observada em várias células não-BL. Molecularmente, essas diferenças aparecem devido a requisitos de Brd4, a versão mais ativa da transcrição positiva Alongamento Fator B (P-TEFb) dentro do Super Alongamento Complex (SEC), e fatores de transcrição como Gdown1 e MED26 e também outra célula desconhecido fatores específicos. Nosso estudo demonstra que o regulamento de níveis elevados de expressão MYC em células cancerosas diferentes é impulsionado por mecanismos reguladores únicos e que tais assinaturas regulamentares exclusivos em cada células cancerosas poderia ser empregado para a terapêutica alvo
Citation:. Fowler T, Ghatak P, Preço DH, Conaway R, Conaway J, Chiang CM, et al. (2014) Regulamento do
MYC
Expressão e Diferencial JQ1 Sensibilidade em células cancerosas. PLoS ONE 9 (1): e87003. doi: 10.1371 /journal.pone.0087003
editor: Arun Rishi, Wayne State University, Estados Unidos da América
Recebido: 23 Setembro, 2013; Aceito: 16 de dezembro de 2013; Publicação: 23 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Fowler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte por fundos de CM. C (NIH CA103867, CPRIT RP110471, e Welch Foundation I-1805), e A.L.R (American Heart Association, 12GRNT12180023). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. J.E.B. tem uma alocação de capital minoritária na Tensha Therapeutics. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de partilha
Introdução
Os linfomas são classificados em duas categorias:. Hodgkin e linfoma não-Hodgkin (NHL) [1]. As duas formas mais comuns de LNH agressivo são o linfoma de células B grandes difusas (DLBCL) e o linfoma de Burkitt (LB) [1], [2], [3]. Translocação do proto-oncogene
MYC
em um dos loci de genes de imunoglobulina [
IG-MYC
translocação; na maior parte do t (8; 14) q24; q32 tipo] resultando em aberrante
MYC
expressão é considerado como o evento genético dominante na gênese da BL e cerca de 10% do DLBCL [4]. Além translocação,
myc
pode sofrer desregulação oncogénica através de amplificação de genes de alto nível bem como as mutações em elementos cis-reguladores, em vários tipos de cancro (por exemplo, mieloma múltiplo, carcinoma de cólon e de neuroblastoma) [5], [6] . Além disso, enquanto a maioria dos BLs ter desregulado c-
MYC
(doravante referida como
MYC
) expressão como consequência de um
IG-MYC
translocação, a maioria dos não -BLs não possuem
IG-MYC
translocações, mas outras anormalidades genéticas que levam a desregulamentado
MYC
expressão. Embora a alta expressão é restrita a BLS, expressão de destino MYC varia em um nível mais baixo em toda linfomas não-BL e intermediárias e constitui um marcador de prognóstico negativo nesses linfomas.
dimeriza MYC com MAX para ligar a sua sequência alvo (E -box) e regulam a expressão do gene. MYC não só ativa a transcrição, mas também reprime a expressão do gene alvo, quer através de licitação directa (com fator de transcrição Miz-1) ou através da regulação da micro-RNAs (miRs) [7]. No entanto, a função de MYC é complicado como dois estudos recentes mostram que MYC não tiver uma assinatura de transcrição específico, mas serve para amplificar a saída dos programas de transcrição existentes numa dada célula, em vez de executar o seu próprio programa transcricional [8], [9] .
MYC
pertence a uma classe de genes chamados genes de resposta primária (PRGs) muitos dos quais porto parou Pol II na área promotor proximal que após a ativação pode mudar rapidamente para um alongamento Pol II e transcrição funcional [10]. dependente de sinal resultados de estimulação de acetilação aumentada em histona 3 lisina 14 (H3K14Ac) e qualquer um dos dois pares de lisina H4, H4K5 /12 ou H4K8 /16, um evento que parece crucial para a ligação de bromodomain (BRD) proteínas que recrutam factores de transcrição necessários para a transcrição [11], [12]. Recrutamento de positiva a transcrição factor de alongamento b (P-TEFb) e, possivelmente, o início cofator Mediador geral, desempenha um papel importante na transcrição Brd4-regulada de muitos genes, incluindo
MYC
. De fato, após o recrutamento por Brd4, P-TEFb fosforila o alongamento fatores DSIF (Spt4 e Spt5), o factor de alongamento negativo (NELF) e Pol II resultando na liberação de uma pausa Pol II e subsequente alongamento da transcrição [10], [13] e recentemente revisto em [14]. Colectivamente, estes e outros resultados sugerem que o alongamento da transcrição é um ponto crítico de regulamentação na orquestração
MYC
regulação [10].
Como são necessários muitos processos orientados-Myc para a homeostase e crescimento, terapêutica estratégias voltadas para a modulação da
MYC
expressão em vez de supressão pura e simples parecer atraente. O Mitsubishi Tanabe Pharma Corporação primeiro descrito thienodiazepine análogos que inibem potentemente a ligação da bromodomains relacionados com a família de BET [15] cromatina. Subsequentemente, um intimamente relacionado inibidor de molécula pequena, JQ1, foi encontrada para ser terapeuticamente eficaz, em modelos animais pré-clínicos [16], [17], [18]. Estes e afins pequenas moléculas ocupar competitivamente as bolsas de ligação de acetilo de bromodomains BET, resultando na libertação de proteínas BET (em particular Brd4) a partir de cromatina [19]. Apesar destas manifestações promissor, JQ1 não inibe
MYC
expressão a uma medida semelhante em todas as células tumorais [19]. Assim, é importante entender por que JQ1 é eficaz apenas em certas
MYC
dependentes de cânceres, o que pode vir a determinar a eficácia clínica deste composto em pacientes.
Observa-se que embora o tratamento JQ1 diminuiu Brd4 de ocupação para um grau semelhante nos tipos celulares testados, a capacidade de reduzir a JQ1
MYC
transcrição entre células diferiam. Em células sensíveis a JQ1, inibição ocorreu ao nível da transcrição nascente afectar pol II, “pausa” Pol II-Ser5-P, “extensão” ocupação de pol II-Ser2-P, e P-TEFb. Além disso, existe uma diferença na ocupação de membros da super Alongamento Complexo (SEC), e factores associados com a ARN polimerase II, a
MYC
regiões promotoras nos dois tipos de células. Colectivamente, os nossos dados indicam níveis elevados de
MYC
são mantidos em diferentes células cancerosas através de mecanismos distintos para o nível de transcrição de alongamento com diferentes cumprimentos de factores de transcrio e, por conseguinte, são submetidos a diferente sensibilidade JQ1.
Materiais e Métodos
Cultura de células
O BAL17 madura rato B linfoma de células [20], as linhas BL humanos Akata [21], Raji [22], e Ramos [23], e humano a linha epitelial HeLa-S3 [24] foram cultivadas em meio RPMI com HEPES (Invitrogen) suplementado com 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 1 mM piruvato de sódio, 0,5 solução mM de 2-mercaptoetanol (Invitrogen) e 10% fetal Calf Sera (Atlanta Biologicals). ensaios baseados em RNA usado 1-2 × 10
6 células e 2 × 10
7 células foram utilizadas para imunoprecipitação da cromatina (ChIP). JQ1, solubilizadas em DMSO, foi diluída em meios a 1 uM e incubaram-se com as células durante 2 horas a 37 ° C. Não foram observados efeitos sobre a transcrição com controlos DMSO (dados não mostrados). As experiências mostradas na Figura S1 (S1 Ficheiro) que envolve a estimulação de BCR consistiu de uma 2 horas de pré-tratamento com 1 uM JQ1 seguido de 30 minutos de exposição a fragmentos de anticorpo específicos para qualquer BCR humana ou de ratinho (Jackson Immunoresearch).
Análise de RNA-real Time PCR
realizados conforme descrito anteriormente [25]. Os valores Ct foram calculados e o sinal reportado como a razão de ARNm alvo ao longo de ACTB através de equações lineares específicos para cada par de iniciadores. primers Myc estão listados na S3 (File S1) a menos que indicado abaixo.
mRNA Primers-rato
Myc Primers não listados na Figura S3 (S1 Arquivo)
In1 /Ex1 5′-AGAGCTCCTCGAGCTGTTTG
5′-CGTCTACATTCAAGACGCAGA
ACTB 5′-AGGCATGGAGTCCTGTGGTATC
5′-AGCCACAGGTCCTAAGGCCAG.
Fos 5′-GGATTTGACTGGAGGTCTG
5’TGGGCTCAGGGTCGTTGA
mRNA Primers Humano
Myc Primers não listados na Figura S3 (S1 Arquivo)
In1 /Ex2 5′-GCACCAAGACCCCTTTAACTC
5′-TCCTGTTGGTGAAGCTAACGEx2 /IN2 5′-AGCGACTCTGGTAAGCGAAG
5′-GTGGCCCGTTAAATAAGCTG
ACTB 5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT
5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG
Fos 5′-CTCCGGTGGTCACCTGTACT
5′-GTCAGAGGAAGGCTCATTGC
Western Blot
Nuclear extratos de 2 × 10
6 células foram submetidas a 10% (Myc) ou 6% (Brd4) SDS-PAGE seguido por Western blotting. Os anticorpos primários (anticorpo de coelho anti-terminal C Brd4-C de IgG e de coelho anti-Brd4-S484 /488-Phos) [26], [27], de coelho anti CREB-IgG (de sinalização celular) e secundário (de rábano anti-coelho de cabra peroxidase ligada a anticorpos IgG, Invitrogen) em 1:1500. As manchas foram visualizadas com o kit ECL Novex quimio-luminescente Substrato Regent (Invitrogen) e densitometria realizada com o MP Imaging System ChemiDoc (Biorad).
Detecção Strand-específica
380 ng de ARN com 1 uM de concentração final de iniciadores foram utilizados para cada reacção de RT utilizando o kit de síntese Cloned AMV First Strand da Invitrogen. iniciadores específicos de cadeia simples; para (+) strand os iniciadores reversos correspondentes à área do TSS (+17 para +11 para rato e humana) e para o (-) Strand iniciadores directos correspondente à extremidade do gene (para o rato e +3948 +4791 para humano, sequências na Figura S3, S1 em arquivo). Em tempo real a amplificação de PCR do padrão foi empregue com os iniciadores indicados e seus acompanhantes, mostrado na Figura S2 (S1 Ficheiro), e os valores de Ct resultantes foram convertidos para ng relativa e normalizados para a concentração de partida de ARN cromossómico.
Cromatina imunoprecipitação (CHIP)
Um ensaio ChIP padrão foi feita e tem sido descrito anteriormente [25]. primers e esquema de PCR são mostrados na Figura S3, S1 no Arquivo. Os valores Ct foram calculados e o sinal representado como% do DNA entrada através de equações lineares específicas para cada par de primer.
Chip Anticorpos
policlonal de coelho anti-rato RNA Pol II (N-20, sc -899, Santa Cruz), RNA Pol II-Ser5P monoclonal (SC-47701, Santa Cruz), RNA Pol II-Ser2P H5 ascite de rato (Covance), H3K36me3 coelho policlonal (ab9050, Abcam), anti ciclina-T policlonal de coelho (H-245, SC-10750, Santa Cruz), de coelho anti-C-terminal BRD4 IgG [27], MED26 rato anti-MED26 /CRSP7 (Ab50619, Abcam), Gdown1 ovelha anti-IgG Gdown1 [28], anti- AFF4 anticorpo [29] e ELL2 anticorpo anti-[29].
Análise Sequencing
Figura S2 (S1 Arquivo) mostra os dados de sequenciamento derivados da Universidade da Califórnia em Santa Cruz Genome navegador (UCSC GB) dados faixas “wgEncodeUtaChIPseqBaseOverlapSignalHelas3Pol2” (HeLa S3) e Geo definir GSM920942 (Raji), mapeado para hg18 genoma construção humana. A Universidade da Califórnia em Santa Cruz Genoma Web Browser definição normalizada para o pico mais alto no TSS.
Resultados
Diferencial JQ1 Sensibilidade
Realizamos dose e dependente de tempo de teste de inibição Brd4 com JQ1 e observado o efeito sobre a
MYC
transcrição numa variedade de células incluindo células HeLa-S3, cuja expressão MYC foi reportada [19] para ser resistente ao tratamento JQ1. Mostrado na Fig. 1A, linhas celulares testadas expressar
MYC
em níveis altos, comparáveis aos níveis detectados no pico de indução de células B em repouso naïve primário (dados não apresentados). níveis de estado estacionário de mRNA de
MYC
em uma linha de linfoma de células B não-BL murino (BAL17) que mais expressa
MYC
em níveis semelhantes às células BL e células HeLa não mostrou sensibilidade significativa para JQ1 (Fig. 1A). Ambos HeLa e células continuaram BAL17 esta resistência em concentrações até 5 uM (dados não apresentados), enquanto
MYC
ARN em células BL foi uniformemente diminuiu ~ 90% quando tratado com 1 uM de JQ1 por um período de duas horas (Fig. 1A). células BL são relatados para expressar de 2 a 5 vezes mais
MYC
ARN espec�ico do que as linhas de células B sem um translocação [30]. Embora Western blotting d indicar a linha Raji BL expressa mais proteína MYC, consistente com os dados de mRNA (Fig. 1A), tratamento JQ1 diminuição da expressão da proteína Myc de Raji mas não HeLa e BAL17 (dados não mostrados). Juntos, estes resultados demonstraram que a resistência JQ1 ocorreu em ambos os não-Hodgkins e linfoma linhas celulares representando tanto espécies de murídeo e humanos.
BAL17 (celular murina B), HeLa humanas, e BL humano de Raji e células não tratadas ou tratadas com 1 pM de JQ1 durante 2 horas. análise (A) de ARNm foi efectuada em triplicado, relataram a expressão de ARNm relativa ACTB e é mostrada como o desvio médio e padrão de três experiências. (B) Detecção de transcrição primária através de amplificação por PCR, utilizando iniciadores em todo o exão interno /fronteiras intrão
MYC
foi realizado três vezes e apresentada de acordo com a expressão de ARNm de ACTB. (C) de transcrição específico Strand-se detectou amplificação por transcrição reversa específica Strand como detalhado em Material e Métodos, seguido por métodos convencionais de PCR. Estas experiências foram realizadas duas vezes.
Porque a produção de ARNm pode não se correlaciona necessariamente com a produção de transcrito primário [25], [31], testou-se o efeito de JQ1 na transcrição primário. Análise do transcrito primário, realizada com os iniciadores contra as fronteiras exão /intrão do
MYC
(representado esquematicamente na Fig suplementar. 3 e /ou listados em Materiais e Métodos) mostrou que a sensibilidade de transcrição primária para JQ1 foi paralelo ao o de ARNm (Fig. 1B). Assim, por muito tempo, e, presumivelmente, full-length, transcritos primários ou eram resistentes (BAL17 ou HeLa) ou sensível (Raji) para JQ1. Portanto, a diferença nas respostas JQ1 correlacionado com a transcrição primária e não ocorreu a nível de modificação pós-transcrição, tais como o splicing e de ARNm ou a estabilidade da proteína.
transcrição divergente é comum a muitos promotores em organismos e execuções um papel importante na regulação de genes [32]. Com efeito, anti-sentido de transcrição a partir do
MYC
lócus tem sido observado em várias linhas de células [33]. Porque apenas medido de RNA total de estado estacionário (Fig. 1A), quer sensibilidade diferencial JQ1 reflecte diferenças na transcrição possível originários a partir da extremidade 3 ‘foi testado. Embora a transcrição anti-sentido em ambas as células HeLa e BAL17 foi pequeno em comparação com o sentido da transcrição, que foi em grande parte inalteradas por JQ1 (Fig. 1C, para a esquerda e painéis de meio). A ampla diferença nos níveis de sentido e anti-transcrições observadas entre as diferentes linhas de células é actualmente inexplicável, mas pode refletir uma combinação de efeitos de transcrição e pós-transcricional. Independentemente disso, como a transcrição sentido, a transcrição antisense proveniente do MYC
lócus em células Raji foi inibida por JQ1 (Fig. 1C, painel da direita). Portanto, apesar de mais de transcrição antisense foi observado em células Raji, a diferença de sensibilidade JQ1 não era provavelmente devido a diferenças de transcritos antisenso.
JQ1 leva à diminuição da Brd4 Ocupação em células resistentes e sensíveis
observou-se que o recrutamento Brd4 foi reduzida por JQ1 em ambos os tipos celulares, por conseguinte,-, a diferença de sensibilidade entre JQ1 células diferentes não foi devido à permeabilidade. Observamos também que Brd4 de recrutamento para o local de início da transcrição (TSS) foi cerca de 2,5 vezes mais em Raji (+11) células em comparação com BAL17 (17) (Fig. 2A). HeLa exibiu Brd4 recrutamento e sensibilidade JQ1 semelhante ao BAL17 (dados não mostrados). Além disso, uma quantidade significativa de Brd4 ocupação foi observada em todo o corpo de
MYC
em todas as células testadas, apesar de haver um maior nível de ocupação de codificação região em células BAL17. Embora comumente associada com intensificadores da extremidade 5 ‘e dos promotores, Brd4 foi mostrado para ocupar a região de codificação de PRGs tais como C-
fos
e
MYC
[26].
p> As células foram ou não tratados ou tratados com 1 uM de JQ1 durante 2 horas. (A) Cromatina imunoprecipitação (CHIP) em
MYC
com anticorpo Brd4 anti-C-terminal. Cada experiência foi realizada duas vezes, analisadas em triplicado por meio de PCR em tempo real e relatados como a média e o desvio padrão das duas experiências. Uma representação da área do promotor de
MYC
é fornecido para orientação. (B) Western Blot para detectar (extrema esquerda) Brd4 (~180 KD) e (meio) Brd4-S484 /488-fos (P-Brd4, ~220 KD) foi realizado três vezes. Uma banda não específica detectada com anticorpo phopsho-Brd4 é denotado com um asterisco. Os resultados típicos são mostrados com análise de densitometria em relação à expressão CREB, que é usado como um controle de normalização (extrema direita).
recrutamento Promotor de Brd4 requer fosforilação em S484 e S488 e exclusão desta região resulta em diminuiu CycT e de pol II de ocupação e de transcrição [26]. Consistente com o ensaio de chip, Western blotting mostrou um nível mais elevado do total Brd4 em extractos nucleares de Raji em comparação com células HeLa e BAL17, embora Brd4-S484P /S488P em células Raji foi ligeiramente menor em comparação com BAL17 e HeLa (Fig. 2B). Curiosamente, a banda P-BRD4 em células HeLa migraram mais rápido do que, quer a banda de Raji ou BAL17 P-Brd4, reflectindo talvez uma ligeira diferença no ponto ou local de fosforilação. No entanto, a diferença de Brd4 fosforilada (a forma activa) entre as células diferentes não pode explicar as diferenças na sensibilidade JQ1.
Brd4 interage com factores que recruta tanto Pol II do local da transcrição ou dirigem o complexo de transcrição parando para o modo de alongamento (revisto em [10]). Para além disso, foi mostrada uma redução de Brd4 funcional resultando em muito reduzida ocupação de pol II para envolver uma perda de P-TEFb [26]. Embora o nível eo padrão do P-TEFb ocupação em ambos os tipos de células sensíveis e resistentes JQ1 não tratada foram semelhantes, o tratamento JQ1 /inibição Brd4 diminuiu P-TEFb ocupação somente em células Raji (Fig. 3). Estes resultados indicaram níveis de dependência BRD4 para manter ocupação P-TEFb variar em diferentes linhas celulares (Fig. 3).
BAL17 e células Raji foram ou não tratados ou tratados com 1 uM de JQ1 durante 2 horas. Recrutamento de P-TEFb foi detectada por ensaios de chip. Cada experimento foi analisado em triplicado através de PCR em tempo real, realizado duas vezes, e é relatado como a média eo desvio padrão dos dois experimentos.
RNA Pol II Recrutamento
A seguir, determinado, se a diferença de selectividade JQ1 era devido a uma diferença no recrutamento geral aparelho de transcrição, representado pela ARN polimerase II (pol II). Enquanto o total Pol II foi grandemente diminuído em todo o corpo de
MYC
em células Raji após tratamento JQ1, não foi alterada na linha resistente BAL17 JQ1 (Fig. 4A). Ambos os tipos de células mostrou ocupação Pol II no
0 promotor P, que tem sido demonstrado que se correlacionam com um nível muito elevado de transcrição [34]. Muitos genes ativos (incluindo
MYC
) exibem uma pausa Pol II em seus promotores proximais [35]. Consistente com esta noção, observou-se um elevado nível de Pol associada-promotor II em ambos os tipos celulares, embora duas vezes mais pol II foi observada no promotor proximal (que corresponde aproximadamente a P
0 região promotora) na BAL17 ( -354) em comparação com Raji (-279). Curiosamente, como observado com Brd4 e P-TEFb (Figs. 3 e 4), o total de pol II foi reduzida a um local imediatamente a jusante (0,6 kb) do TSS e aumentaram acentuadamente depois (Fig. 4A).
As células foram ou não tratados ou tratados com 1 uM de JQ1 durante 2 horas. (A) Pol II foi detectada por um anticorpo contra o terminal N de II (B) de pol II Serina 5-P (C) de pol II Serina 2-P Pol. ensaios ChIP cromatina foram realizadas em duplicata. Cada experiência foi analisada em triplicado por meio de PCR em tempo real, realizadas duas vezes, e é relatado como a média e o desvio padrão das duas experiências.
Como a fosforilação do domínio carboxi-terminal (CTD) de ARN Pol II está associada com a regulação da iniciação da transcrição e alongamento de muitos promotores de [36], [37], analisou-se estes eventos nos dois tipos de células na ausência e na presença de JQ1. Enquanto ARN Pol II fosfo-Ser5 (pol II) S5P níveis em células BAL17 permaneceu estável após o tratamento JQ1, níveis de pol II S5P em células Raji foram sensíveis a JQ1 (Fig. 4B). No entanto, surpreendentemente, os níveis de Pol II S5P eram refractários em P
0 e locais de SST (Fig. 4B, painel direito), mas sensível na segunda metade do gene com uma pequena mudança começando a jusante do
MYC
promotor P3 (2244) e a tornar-se cada vez mais sensíveis na parte inferior do corpo do gene. Se a quantidade substancial de Pol II-Ser5P 3 ‘ocupação mostrado aqui é directamente devido a 3’ ocupação Brd4 ou uma superabundância de complexos de transcrição “fazer backup”, resultando em redução de alongamento e pausa subseqüente no terminal 3 ‘é desconhecido.
Enquanto Ser5 fosforilação está associada com um competente, mas parou de pol II, Ser2 fosforilação da Pol II CTD (pol II S2P) representa alongando pol II [37]. Na ausência de JQ1, pol II S2P ocupação em ambos os tipos de células ocorreu em todo o corpo do gene com picos com as regiões promotoras e extremidade 3 ‘. Surpreendentemente, enquanto promoter- e SST-associados pol II S2P níveis em células Raji foram sensíveis a JQ1, regiões a jusante últimos P
3 não exibiram sensibilidade JQ1 passado até a UTR 3 ‘(5472) (Fig. 4C), sugerindo que a maioria dos alongando totalmente ARN polimerase II nestas células sensíveis JQ1 foi refractário a JQ1. Observou-se também um aumento dependente da JQ1 em Pol II-Ser2P na linha BAL17 e enquanto esse aumento foi ligeiro na regiões TSS promotor e, foi muito claro no terminal 3 ‘.
As diferenças de H3K36me3
uma forma possível para delinear os efeitos a montante e a jusante sobre pol II-Ser2 ocupação é para determinar o padrão de tri-metilação da histona 3 lisina resíduo 36, H3K36me3, o que é indicativo de um complexo de transcrição alongando recentemente passando [37]. Em células BAL17, o tratamento melhorado JQ1 os sinais H3K36me3 em todo o gene (Fig. 5). Mas em células Raji, o tratamento JQ1 diminuiu H3K36me3 de P
0 a TSS até
3 a região de P. No entanto, para além P3, o H3K36me3 tornou-se refractário ao JQ1 (Fig. 5) tal como observado com pol II S2P (Fig. 4C), sugerindo que uma vez que o ARN Pol II estava no modo de alongamento, que era insensível à JQ1. Em conjunto, os nossos dados mostraram que
MYC
complexos de transcrição abrigavam com dependência Brd4 variável em diferentes tipos de células e que a inibição Brd4 resultou numa resposta diferencial ao nível de transição de parando ao alongamento.
Células foram ou não tratados ou tratados com 1 uM de JQ1 durante 2 horas. ensaios ChIP foram realizadas em duplicata. Cada experimento foi analisado em triplicado através de PCR em tempo real, realizado duas vezes, e é relatado como a média eo desvio padrão dos dois experimentos.
Acessório Transcrição Alongamento Fatores
P- TEFb frequentemente funciona como uma subunidade de Super Alongamento Complexos (SEC), consistindo de P-TEFb e uma mistura de um de três membros da família de ELL, um de dois membros da família de EAF, um de dois membros da família AF4 (AFF1 e AFF4), e quer ENL ou AF9 [29], [38]. Como a família SEC de Pol II factores de alongamento são relatados para conter as versões mais cataliticamente activos de P-TEFb activas na transcrição de alto nível e para regular um estágio checkpoint da transcrição associado com alongamento [29], [39], [40] , olhamos para o recrutamento SEC em
MYC
em diferentes tipos de células. AFF4 é relatado para servir como uma plataforma de ligação central para factores de alongamento em muitas formações da SEC e para direcionar
MYC
e regular sua expressão em células de câncer [39]. O nível de ocupação em AFF4 BAL17 células foi baixa e refractário para JQ1 (Fig. 6A, painel superior), mas aumentou na presença de JQ1. Em contraste, AFF4 recrutamento em células Raji foi muito maior e sensível ao JQ1. Embora o promotor de ocupação AFF4 em células Raji, em particular em torno de 2244 sítio, foi variável na ausência de JQ1, foi significativamente diminuída na presença de JQ1. Além disso, consistente com os resultados S2P e H3K36me3 pol II, a sensibilidade perdida JQ1 foi passado a região P
3 promotor (2244), mais uma vez, sugerindo que o complexo de transcrição alongando foi refractário a JQ1 (Fig. 6A, painel inferior) .
As células foram ou não tratados ou tratados com 1 uM de JQ1 durante 2 horas. (A) AFF4 foi detectado pelo chip em todo o comprimento da
MYC
gene em ambas as células BAL17 e Raji. (B) Detecção de AFF4, ELL2 e MED26 nas regiões promotoras de células HeLa não tratadas e Raji humanas. ensaios ChIP foram realizadas em duplicata. Cada experimento foi analisado em triplicado através de PCR em tempo real, realizado duas vezes, e é relatado como a média eo desvio padrão dos dois experimentos.
Nós posteriormente olhou para ocupação de outro componente SEC, ELL2, que tem sido relatado para desempenhar um papel na transição a partir de uma pausa Pol II ao alongamento [40]. Também testámos ocupação do componente mediador (MED26), bem como Gdown1. Embora inicialmente ligado à iniciação, um papel para Mediator em Pol II factores de alongamento da transcrição de recrutamento e fosforilação da Pol II CTD regulação Pol pausa II e alongamento surgiu [41]. O complexo mediador mais fortemente associado com Pol II inclui MED26, que foi demonstrado que o aumento de activação de transcrição in vitro para um grau maior do que outras formas do complexo Mediador e desempenham um papel fundamental no recrutamento SEC e MYC transcrição [41]. Gdown1 é uma proteína de ligação de pol II demonstrado ser necessário para uma resposta dependente de mediador para a activação da transcrição [42]. Mais apropriado para este estudo, Gdown1 foi recentemente mostrado para aumentar a estabilidade da pausa Pol II e regular a actividade P-TEFb [28].
Uma vez que os anticorpos disponíveis contra ELL2, Med26 e Gdown1 eram espécies (humana) específico, foram empregados células HeLa e Raji para estas experiências. Dadas as diferenças centradas em torno da região do P3, enfocamos a região geral promotor (P
0, TSS, e P
3) para testar as diferenças entre estas linhas celulares. Tal como observado para as células BAL17, células HeLa exibiu baixa recrutamento AFF4 nesta região, em comparação com células Raji (Fig. 6B). Consistente com os resultados de recrutamento AFF4, aumentou ELL2 ocupação perto P
3 foi observada em células Raji em comparação com células HeLa. MED26 ocupação mostrou um padrão semelhante ao de outros componentes s com um aumento, embora mais modesto, perto da P
3 promotor em células Raji (Fig. 6B). Finalmente, observamos que Gdown1 seguiu um padrão semelhante ao da SEC e Mediador com um aumento em torno do P
3 promotor em células Raji (Fig. 6B).
Discussão
Devido para a importância de
MYC
na gênese de doenças malignas hematopoiéticas, intensos esforços têm sido direcionados para as duas últimas décadas para a compreensão de sua regulação. No entanto, dado que
MYC
superexpressão é causada por uma variedade de lesões genéticas, um conjunto uniforme de regras que regem a sua regulação da transcrição ainda está faltando. Avanços recentes nesta área incluem a descoberta de um inibidor de molécula pequena, que diminui JQ1
MYC
expressão e é terapeuticamente eficaz em modelos animais pré-clínicos de carcinoma da linha média e em células BL. No entanto, JQ1 não inibe
MYC
expressão a uma medida semelhante em todas as células cancerosas, ainda ressaltando que
MYC
transcrição é, talvez, sob diferentes controles em vários tipos de células cancerígenas. Consistente com esta noção, descobrimos que inibe JQ1
MYC
expressão em todos BL-derivados de células testadas, mas não inibe
expressão MYC
em algumas outras linhas de células de cancro, como observado anteriormente (19) . Porque
MYC
desregulamentação pode ocorrer através de modos diferentes, temos a hipótese de que, em fenótipos linfoma distintas, de alto nível
MYC
expressão pode vir sob os controles de diferentes transcrição e mecanismos de regulação epigenética, que pode ser sensível ou resistente a JQ1 inibição /Brd4. Neste estudo, nós exploramos esses mecanismos para estabelecer
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transcrição e assinaturas epigenéticas associadas a determinados tipos de células com a esperança de que estas assinaturas será melhor definir subtipos de linfoma e fornecer novos caminhos terapêuticos para explorar para os linfomas de células B clinicamente agressivo .
Embora as células BL são muito heterogêneo, com diferenças no comprimento do Ig /MYC translocação que alegadamente traduzem em níveis variáveis de
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superexpressão [43], as células BL em nossas mãos (Fig . 1 e Figura S1, S1 no ficheiro), e outros [19], são uniformemente sensíveis à inibição de
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expressão através da inibição Brd4 por JQ1. Esta inibição parece ser independentemente se estes são EBV linhas BL positivos ou negativos (nosso estudo e ref 19). Brd4 está principalmente associada com promotores 5′-end e potenciadores [44], [45], [46], e enquanto nós vemos um nível mais proeminente da Brd4 no TSS em células Raji (Fig. 2), observamos também ocupação Brd4 em todo o corpo do
gene MYC em células resistentes JQ1 (Fig. 2). Uma das funções do Brd4 é P-TEFb recrutamento e ocupação P-TEFb faz paralelo Brd4-inibidor sensível
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transcrição, apesar do fato de que há pouca diferença em ocupação P-TEFb em células não tratadas de resistente ou sensível células. Portanto, parece que em células resistentes a JQ1, um mecanismo Brd4 independente opera para recrutar ou reter P-TEFb e produzir altos níveis de
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transcrição.
Como os componentes da SEC AFF4 e ELL2 desempenhar um papel no
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regulação e alongamento da transcrição, a hipótese de que um aumento desses co-fatores pode relaxar os requisitos Brd4. Surpreendentemente, a sua crescente presença na verdade correlacionada com o aumento das exigências para Brd4 (Fig. 6). A posição dos componentes de aumento de SEC em conjunto com MED26 e Gdown1 em torno do promotor P3 sugere elevada actividade de transcrição ou um posto de controle regulador nesta região que não está presente nas células que são resistentes a JQ1 (resumidos na Figura 7).