Abstract
população Side células (SP) foram relatados ter propriedades de células-tronco cancerosas-like (CSCs) no carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC), mas as suas características moleculares não foram completamente elucidados. Aqui nós mostramos que, as células NSCLC-SP foram enriquecidos em L
0 /G
1 fase do ciclo celular, apresentaram maior atividade de aldeído desidrogenase, bem como maior capacidade clonogênica e auto-renovação em comparação com a população geral (MP) células. Interessantemente, as células SP também foram capazes de trans-diferenciar-se em túbulos angiogénicos
in vitro
e foram altamente tumorigénicas quando comparadas com células MP. tumores derivados de SP demonstrou a heterogeneidade intratumoral compreendendo tanto de células MP SP e, sugerindo a auto-renovação e capacidade de diferenciação de células SP são manifestados
in vivo
também. βArrestin-1 (βArr1) está envolvida na progressão de vários cancros, incluindo CPNPC e descobrimos que a depleção de βArr1 bloqueou significativamente o fenótipo SP; Considerando que o esgotamento dos parr2 teve efeitos relativamente menores. A expressão ectópica de βArr1 resultou em aumento da expressão frequência SP e ABCG2 enquanto revogação de expressão βArr1 suprimiu o crescimento auto-renovação e expansão de células A549. proteína anti-apoptótica de Mcl-1 é conhecido como sendo um dos principais reguladores de auto-renovação das células estaminais de tecidos e pensa-se contribuir para a sobrevivência de células NSCLC. As nossas experiências demonstram que os níveis mais elevados de Mcl-1 foram expressos em células de SP em comparação com células MP em ambos os níveis de transcrição e tradução. Além disso, Obatoclax, um inibidor farmacológico de Mcl-1, pode efectivamente impedir a auto-renovação de células NSCLC ambas sensíveis e resistentes EGFR-inibidor. Em conclusão, nossos resultados sugerem que βArr1 e Mcl-1 estão envolvidos na auto-renovação e expansão do NSCLC-CSCs e são potenciais alvos para a terapia anti-câncer
Citation:. Singh S, Bora-Singhal N , Kroeger J, Laklai H, Chellappan SP (2013) βArrestin-1 e Mcl-1 Modular auto-renovação crescimento do câncer de células estaminais-Like Side populacional em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (2): e55982. doi: 10.1371 /journal.pone.0055982
editor: Ming Tan, University of South Alabama, Estados Unidos da América
Recebido: 10 Setembro, 2012; Aceito: 04 de janeiro de 2013; Publicação: 13 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Singh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo CA127725 subsídio do Instituto Nacional do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. Srikumar P. Chellappan é um editor Acadêmico de PLOS ONE; isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Apesar dos avanços terapêuticos significativos, o cancro do pulmão faz com que o número máximo de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo [1 ], [2]. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o câncer de pulmão fará com que cerca de 2,5 milhões de mortes por ano até o ano de 2030 [3]. Nos Estados Unidos, aproximadamente 85% dos pacientes com diagnóstico de CPNPC, morrem desta doença nos cinco anos seguintes [4], [5]. Estes fatos destacar a necessidade de uma melhor compreensão dos eventos celulares e moleculares subjacentes à génese desta doença para o desenvolvimento de terapias mais eficazes. modelo de células-tronco do câncer surgiu como uma explicação viável para a iniciação e progressão dos cancros agressivos como CPNPC e são potenciais alvos terapêuticos [6], [7], [8], [9], [10].
modelo de células-tronco do câncer sugere que um subconjunto de células denominadas como câncer de células estaminais-like (CSCs) dentro do tumor têm as propriedades desregulamentados de células-tronco normais com sustentado auto-renovação, e pode gerar tumores secundários que recapitulam a heterogeneidade e diversidade do tumor original [9], [11], [12], [13], [14], [15]. Hoechst 33342 corante excluindo células, denominada lado-população de células (SP), têm sido descritos como tendo a CSC como propriedades de uma variedade de tumores, incluindo CPNPC [16], em que eles mostraram aumento da tumorigenicidade quando transplantadas em ratinhos imunocomprometidos [17], [ ,,,0],18], em comparação com a população principal (MP). SP fenótipo é dependente da capacidade diferencial das células ef luxar o corante Hoechst 33342 por meio da cassete de ligação a ATP (ABC) da família de proteínas de transporte, principalmente ABCG2 (também conhecida como proteína de resistência do cancro da mama, BRCP1), que é expresso especificamente na membrana celular de populações de células progenitoras [19]. Estudos anteriores demonstraram a existência de células de SP em certas linhas celulares estabelecidas NSCLC humanos [16] no entanto, a sua caracterização molecular detalhada bem como a capacidade funcional para gerar tumores heterogéneos continua por ser elucidado. Neste estudo, nós forneça dados completos que as células SP isoladas de linhagens celulares estabelecidas humanos NSCLC e tumores são altamente enriquecido com NSCLC-CSCs. Além disso, descobrimos que ALDH1, que foi identificado como um marcador para a CSC a partir de outros tipos de tumores, são enriquecidos em células de SP de NSCLC. Nossa molecular análises mostram que células-tronco como propriedades das células SP é regido pelo menos em parte pela proteína andaimes, β-arrestina-1; Além disso, a proteína de sobrevivência de Mcl-1 desempenha um papel na auto-renovação destas células. Assim, parece que a segmentação β-arrestina-1 ou MCL1 pode ser um meio viável para inibir as propriedades semelhantes a células estaminais de células de SP de NSCLC.
Materiais e Métodos
Linhas de Células e Reagentes
O não-pequenas linhas de células de adenocarcinoma de pulmão de células, A549, H1650, H1975 H460 e foram obtidas de ATCC e mantidas em meio RPMI ou DMEM containing10 soro fetal bovino% (FBS; Mediatech) em 5% de CO
2 a 37 ° C. Embora estas linhas de células foram adquiridos a partir de ATCC, que não revalidate-los. Fumitremorgin C (FTC) foi adquirido de Sigma Inc e Obatoclax foi comprado de Selleck Chemicals LLC.
RNA Preparação e análise em tempo real qPCR
extração de RNA e preparação de cDNA foi seguido como descrito anteriormente [20 ], [21], [22]. PCR em tempo real foi feito com 1 uL do ADNc em um tempo real do sistema de detecção de PCR MyiQ (Bio-Rad), utilizando iQ SYBR Green PCR Supermix (Bio-Rad) de acordo com as orientações do fabricante. Dobram induções foram calculados utilizando a fórmula 2
– (ΔΔCt) utilizando GAPDH como gene controle interno. Os pares de iniciadores específicos para o gene foram como se segue. CD31 (F) 5′-CCTGACAGTGTCTTGAGTGGGTG -3 ‘, CD31 (R) 5′-AGTGATTTTGGCTAGGCGTGGT -3′; βArr1 (F) 5’-AGAGTCTATGTGACGCTGACCTGC -3 ‘, βArr1 (R) 5′-GTTCCTGCAGCCGCGTCAG -3′, Mcl-1 (F) 5’-ATGCTTCGGAAACTGGACAT -3 ‘, Mcl-1 (R) -3 5’TCCTGATGCCACCTTCTAGG ‘, GAPDH (F) 5′-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA AC-3′, GAPDH (R) 5’-GTT GCT GTA CCG AAA GTT TTC GT-3 ‘.
Western Blot Análise
lisados de células SP ordenada e MP foram preparados por lise NP40 como descrito anteriormente [20]. Em resumo, células separadas foram lavadas duas vezes com PBS gelado. As células foram centrifugadas a 800
g
e lisadas utilizando tamp de lise M2 (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,5% de NP-40, NaCl 250 mM, EGTA 3 mM e EDTA 3 mM) contendo protease inibidores. Quantidades iguais de proteínas (50? G) foram separadas em SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad), bloqueado por leite seco magro a 5% em PBS contendo 0,1% de Tween-20 e incubadas com os anticorpos primários apropriados. Os anticorpos monoclonais contra ABCG2 βArr1 e foram adquiridos a Millipore e o anticorpo policlonal contra E2F1 e MCL1 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc.
Corante Hoechst 33342 efluxo Ensaio de Análise SP e separação de células
As células aderentes foram colhidas utilizando Accutase reagente (Sigma Inc). Para explantes de tumores, tecido de tumor primárias humanas cultivadas em ratinhos nus atímicos foi picada, enzimaticamente digerido com 0,2% de colagenase IV (Worthington Biochemical Corporation) preparado em 10% de FBS contendo meio durante 60 minutos a 37 ° C. O condensado foi adicionalmente desagregadas por passagem através de uma pipeta de 10 ml várias vezes e filtrado através de filtro de células 100/70 mícrons para obter uma suspensão de célula única. As células foram lavadas e ressuspensas em DMEM /F12K com 2% de FBS a 1 × 10
6 células /ml de densidade e incubadas com 4 ug /ml de Hoechst 33342 corante (Invitrogen) durante 90 minutos a 37 ° C na presença ou ausência de 1 uM FTC, tal como descrito por Goodell et ai. [23]. As células foram incubadas com 2 ug /ml de iodeto de propídio (PI; Sigma Inc) antes da análise para visualizar e excluir as células não viáveis. O corante Hoechst 33342 foi excitado a 350 nm usando laser UV e sua fluorescência foi analisada utilizando 400-500 nm filtro BP para a emissão de azul e 640-680 nm filtro BP em combinação com 655 nm LP-filtro para emissão vermelha. citómetros de fluxo de BD Biosciences foram utilizados para a aquisição de dados. Os dados foram adquiridos utilizando LSRII ou FACS Vantage (DiVa) e classificados usando FACS Vantage (DIVA), classificador de células. análise dos dados foi feito utilizando software FlowJo (Árvore Star).
Aldefluor Ensaio
O kit Aldefluor foi usado para traçar o perfil e as células separadas com alta atividade ALDH de acordo com as instruções do fabricante (Stem Cell Technologies). Resumidamente, a Hoechst 33342 células coradas foram incubadas com substrato de ALDH da proteína BODIPY-aminoacetaldeído (BAAA) em tampão de ensaio Aldefluor suplementado com 1 fiM FTC para prevenir o efluxo de corante Hoechst. Após 45 minutos de incubação a 37 ° C, as células que poderiam converter BAAA ao seu produto fluorescente BODIPY-aminoacetato (BAA) foram considerados ALDH-Oi. As portas para análise de citometria de fluxo foram tiradas em relação à linha de base de fluorescência, a qual foi determinada pela adição de dietilaminobenzaldeído inibidor da ALDH-específico (DEAB). Amostras tratadas com DEAB sozinho serviu como controle negativo.
Células
Ordenado SP ou MP
Formação Sphere ou auto-renovação Ensaio
foram semeadas em ultra-baixa adesão placas de 96 poços (Corning) na densidade de 10.000 células /ml (1000 células /poço em 100 ul de meio) em soro livre DMEM /F12K (1:1) (Invitrogen), suplementado com suplemento N2-1X (Invitrogen), 10 ng /ml de EGF e 10 ng /mL bFGF (Sigma) e deixou-se crescer durante 10 dias. Imagens das esferas foram feitas usando o microscópio de contraste de fase (Nikon) e o número total de esferas mais que 60 mm foram contados. Para estudar o efeito de drogas sobre a auto-renovação das células SP, as drogas foram adicionadas aos respectivos poços no dia 1 e 5 e o tamanho ( 60 mm) e o número de esferas foram analisadas no dia 10.
SCID-bege femininos
In vivo
ensaio de formação de tumor.
5 semanas de idade foram utilizados para estas experiências no âmbito de um protocolo que foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados Institucional animal da a University of South Florida (animal Welfare Assurance Número A4100-01). SP classificados ou células MP partir da linha celular H1650 foram lavadas com DMEM isento de soro-F12K e suspenso numa mistura 01:01 de factor de crescimento reduzida Matrigel (BD) e HBSS a números indicados e implantado por via subcutânea. Os volumes dos tumores foram determinados uma vez por semana por medida de distâncias (
L
) e largura (
W
), eo volume calculado utilizando a fórmula
V =
1/2 ×
L
×
W
2as descrito anteriormente [21], [22], [24], [25]. O estado de saúde dos ratos foi monitorada diariamente para sinais de desconforto, incluindo inatividade, hipoatividade, hiperatividade, agitação, auto-trauma, agressividade, isolamento de companheiros de gaiola, ataxia, rasa, respiração rápida e /ou trabalharam, mucosas pálidas, cianose , a falta de noivo, caquexia, suja área anogenital, falta de resposta a estímulos, a falta de curiosidade, vocalização, ascite e /ou postura curvada. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. No final da experiência, os animais serão sacrificados por exposição a concentrações crescentes de CO
2 numa co
2 câmara dedicado; gás comprimido foi usada uma fonte de CO
2.
Métodos Estatísticos
Os dados foram apresentados como a média ± desvio padrão (SD). Para avaliar a significância estatística das diferenças, foi realizada
t
teste do aluno. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Microsoft Excel. Foram considerados estatisticamente significativos os dados quando o
p
valor foi menor que 0,05.
Resultados
Células SP de NSCLC Demonstrar Stem Cell Properties-like
foram feitas tentativas para avaliar a percentagem de células SP em quatro linhas de células NSCLC humanas diferentes, escolhidos na base de K-Ras ou estado de mutação do EGFR. A549 (mutante K-Ras; tipo selvagem amplificação de EGFR) e H460 (K-Ras mutante), bem como H1650 (mutantes de EGFR; Exão 20 deleção: delE746-A750) e H1975 (mutantes de EGFR; L858R e mutações T790M) células contidas SP -cells com diferentes frequências que vão desde cerca de 8% (H1975) a 40% (H460). Um inibidor específico de ABCG2 [26], Fumitremorgin C (FTC) poderia bloquear o aparecimento de células SP (Figura 1A), sugerindo que este transportador particular, desempenha um papel específico na manutenção do fenótipo SP. Estes resultados sugerem que as células SP estão presentes em linhas de NSCLC, e a sua prevalência é independente de K-Ras ou estado de mutação do EGFR.
(A) análise de FACS na suspensão de células isoladas de linhas de células NSCLC humanas coradas com Hoechst 33342 tingir mostrando células SP. células SP são colocados dentro da área demarcada em rosa. Fumitremorgin C inibiu o efluxo de corante e provocou o desaparecimento de células de SP. A frequência de células SP é representado. (B, C) análise do ciclo celular utilizando parâmetro zona de histograma para a emissão azul de Hoechst 33342, como descrito no texto. O perfil mostrado na B é o representante para todas as quatro linhas celulares. (D) Ensaio Aldefluor em Hoechst 33342 manchado H1975 e H1650 células. A fluorescência de linha de base foi estabelecida por inibição da actividade de ALDH com DEAB (esquerda) para gerar a porta para identificar células ALDH-Hi no total, bem como a SP e MP células que não foram incubadas com DEAB (três painéis da direita). Todas as células ALDH-Hi são colocados dentro da área demarcada em rosa. A diferença vezes na frequência de células ALDH-Hi entre SP e células MP é traçado.
Foi proposto que as células-tronco do tecido normais e células tumorais iniciando-tronco como têm diferentes perfis do ciclo celular em comparação com células diferenciadas, e que progridem ao longo do ciclo celular mais lenta [27], [28]. Perante este cenário, fizemos tentativas de examinar se o perfil do ciclo celular de células SP difere do que as células MP diferenciadas. Para examinar a distribuição do ciclo celular, o perfil histograma gerado a partir da área de parâmetro para a emissão de azul de Hoechst 33342 foi utilizada para examinar a distribuição de fases do ciclo celular em células de SP e MP. Como o tratamento FTC permite tanto células MP SP e para reter o corante Hoechst 33342, esta amostra foi usada para marcar os limites de G
1 e S-G
2 /M fases, com base em seu conteúdo de DNA. portões semelhantes foram aplicadas para as amostras em que FTC não foi adicionado e assim as células SP apareceu como um sub-L
0 /L
1 população (Figura 1B). Após a comparação da distribuição de células tratadas e não tratadas FTC, verificou-se que 80-100% das células eram SP no G
0 /L
uma fase do ciclo celular, dependente da linha celular (Figura 1C). Em todos os casos, as células SP teve mais G
0 /L
1 células do que as células MP da mesma linha de células, o que sugere que eles tenham atenuado progressão do ciclo celular característico de células-tronco-like.
As experiências foram realizadas para analisar se outros marcadores de células estaminais do cancro são expressos em células de SP. Para este propósito, a citometria de fluxo foi realizada para a actividade da aldeído desidrogenase (ALDH-Hi), que foi recentemente utilizada como um marcador potencial para identificar CSCs no CPNPC [29], [30]. Análise utilizando o kit de ensaio de Aldefluor em linhas de células H1650 e H1975 mostrou 8 e 6 vezes maior frequência de células ALDH-HI nas células SP, em comparação com células MP, sugerindo que as células SP isoladas a partir de linhas celulares de NSCLC são enriquecidos na haste como células (Figura 1D), como pode ser visto pela expressão de um marcador diferente. No geral, cerca de 1,3% de células H1650-SP e 2% de células H1975-SP eram células ALDH-Hi.
Células SP Mostrar Stem características celulares do tipo
in vitro
In vitro
experimentos foram realizados para caracterizar melhor a SP e células MP. Após a separação de células, as células foram plaqueadas a uma densidade elevada (10.000 células /poço em placa de 96 poços) em meio completo e monitorizados durante 6 dias por ensaio MTT. células MP H1650-SP e tinha capacidade de proliferação comparáveis quando crescido em meio completo, em condições aderentes (Figura 2A), sugerindo que ambas as fracções de células classificadas são igualmente saudável e Hoechst 33342 corante coloração para análise SP e protocolo de separação de células não teve nenhum efeito prejudicial sobre estas células. Um traço característico das células estaminais é a sua capacidade de auto-renovação e também para dar origem a células mais diferenciadas, através da divisão assimétrica [15]. Auto-renovação normal ou o cancro-tronco como células podem crescer esferas como não aderentes quando cultivadas em baixa densidade no soro livre, caule meio seletivo celular; células diferenciadas não crescem ou formar as esferas neste meio [13], [31], [32]. A propriedade de auto-renovação das células SP foi examinado através da realização de ensaio de formação de esfera usando células SP e MP isolado a partir de células H1650. Enquanto as células SP foram capazes de crescer como esferas, células MP teve marcadamente menor capacidade de crescer sob condições semelhantes (Figura 2B), sugerindo que a auto-renovação capacidade característica de células estaminais é exibida apenas por células SP. Em seguida, examinou o potencial clonogénico das células tanto MP SP e por plaqueamento das células e cultura, a densidade clonal (1000 células em 60 milímetros placa) durante 21 dias em meio contendo FBS. Neste painel, as células são colocadas em placas a uma densidade muito baixa, e sua proliferação a longo prazo e de formação de colónias capacidade foi verificada. Tal como mostrado na Figura 2C, a formação de grandes colónias era substancialmente maior do que entre as células SP era entre células MP. A viabilidade das células formadoras de colónias foi determinado pelo ensaio de MTT (Figura 2D), proporcionando evidência colectivamente que as células SP exibem aumento clonogenicidade.
(A) Curva de crescimento de 10.000 H1650-SP ou MP células foram gerados utilizando MTT ensaio de proliferação de células em meio de crescimento normal [22]. (B) As células MP SP ou a partir de linha de células H1650 foram plaqueadas em meio isento de soro suplementado com EGF e bFGF durante 10 dias. O número médio (± SD) de esferas a partir de 1000 células é representada graficamente. células (C) H1650-SP resultou em mais colónias e maiores em comparação com as células MP quando plaqueadas a uma densidade de 1000 células por placa de 60 mm. viabilidade (D) celular foi ensaiado após 21 dias de plaqueamento, através do ensaio de MTT. (E) SP ou MP células foram plaqueadas em Matrigel e cultivadas em meio de crescimento endotelial (Lonza) durante a noite. células SP deu origem a angiogénicos como túbulos de forma eficaz. (F) a análise qPCR em tempo real em SP e células MP realizados para
CD31
mRNA expressão. (L) a expressão de CD31 em túbulos angiogénicos tal como visualizado por imunofluorescência.
certos tipos de tumores têm sido relatados para demonstrar mimetismo vascular, devido à capacidade das células tumorais para adquirir as propriedades de células endoteliais e outras celular componentes da vasculatura [33], [34], [35]. O papel das células-tronco cancerosas, neste contexto, foi examinado e, evidências recentes sugerem que CSCs de gliomas poderia trans-diferenciação em linhagem endotelial [33], [34], [35]. Perante este cenário, foi examinada a capacidade das células H1650 SP para formar túbulos angiogénicos
in vitro
. células H1650-SP semeadas em matrigel formou uma rede de túbulos angiogénicos após tratamento com VEGF, enquanto que as células MP foram significativamente prejudicados nesta habilidade (Figura 2E). Verificou-se que as células permaneceram relativamente MP desorganizada, em comparação com o túbulo organizada como estruturas formadas pelas células SP. As experiências foram realizadas para avaliar se o túbulo como estruturas formadas por células SP exibir características bioquímicas dos vasos angiogénicos. Tendo em vista esta finalidade, um em tempo real A análise de PCR foi conduzida em primeiro lugar, que mostraram uma expressão maior de específico endotelial
CD31
ARNm em células SP, em comparação com células MP (Figura 2F). Além disso, a coloração de imunofluorescência dos túbulos mostrou que estes túbulos formados por células SP foram fortemente positivos para expressão de CD31 (Figura 2G), sugerindo que as células SP podem atingir uma linhagem endotelial. Estas experiências revelaram que as células SP isoladas a partir de uma linha de células NSCLC podem transdiferenciar em células endoteliais semelhantes e pode ser capaz de dar origem a túbulos angiogénicos nos tumores.
Células SP são enriquecidas com células tumorigénicas e demonstrou Auto- renovação e diferenciação de células SP
in vivo
Dada a capacidade das células SP para a auto renovar e diferenciar em túbulos angiogénicos, assim como células MP, o próximo examinaram a capacidade de SP ou células MP para formar tumores em ratinhos SCID. SP e MP células de linhagem de células H1650 foram implantados subcutaneamente nos flancos dorsais de SCID e crescimento do tumor semanalmente avaliado por medições de calibre. Como mostrado na Figura 3A, quatro ratinhos (n = 5) injectados com 10.000 células SP produzidos tumores grandes (volume ~1400 mm
3) no prazo de 11 semanas de implantação. No entanto, um número semelhante de células MP foram significativamente prejudicados na sua capacidade de formar tumores dentro do mesmo período de tempo; os tumores eram relativamente menores e manteve-se próximo ao tamanho implantado (volume~100 mm
3) (Figura 3B). Além disso, as células SP formado tumores mesmo com 1.000 células (volume ~471 ± 141 milímetros
3) após 19 semanas de implantação, ao passo que o número semelhante de células foram MP não conseguiu gerar quaisquer tumores (Figura 3A).
(a), ordenadas e células SP MP partir da linha celular H1650 foram implantados nos flancos de ratinhos SCID. incidência de tumor e o volume médio (± desvio padrão) dos tumores formados dentro do tempo indicado, foram tabulados. cinética (B) crescimento de tumores de células SP e MP, medido semanalmente. Os pontos representam a média (± erro padrão). (C) tumores subcutâneos derivados de células de 10.000 H1650-SP ou 100.000 células H1650-MP foram ressecados e analisadas quanto ao fenótipo sp na presença ou ausência de FTC. Tumores de SP e células MP continha células MP predominantemente diferenciadas.
Para elucidar se os tumores gerados a partir de células SP teve SP heterogêneos e células MP, Hoechst 33342 análise de coloração e SP foi realizada após dissociação enzimática de tumor subcutâneo xenotransplantes. Os tumores gerados a partir de 10000 células H1650-SP foram compostas principalmente de células enquanto que as células SP MP foram mantidas a frequência de cerca de 3% dentro do tumor (Figura 3C, painel superior). Estes resultados indicam que as células SP são altamente enriquecido com CSCs que são suscitam capaz de tumores, bem como auto-renovar e diferenciar-se
in vivo
. No entanto, os tumores gerados em um rato (de três) após a implantação de 100.000 células H1650-MP demonstrou a desdiferenciação de células MP para gerar células SP
in vivo
(Figura 3C, painel inferior), após 9 semanas em estes ratinhos (Figura 3B). Na verdade, tem sido relatado que células cancerosas diferenciadas pode ser capaz de des-diferenciar-se e obter-se propriedades de haste semelhante em certos casos, [36], provavelmente facilitando o atraso no crescimento de tumores.
βArr1 Regula a auto-renovação crescimento de células SP
βarrestin-1 (βArr1) é uma proteína de andaimes que desempenha um papel importante na dessensibilização de receptores acoplados à proteína G [20], [37], [38], [39], [40]. Estudos recentes têm mostrado que βArr1 desempenha um papel na activação de quinases Src por vários receptores e pode facilitar a proliferação de células de cancro do pulmão [38], [41]. Além disso, os níveis de βArr1 foram encontrados como sendo elevados em metastático e de outros cancros em comparação com o tecido normal ou tumores primários [20], [39], [40], [41]. Dada a correlação de βArr1 com progressão tumoral e metástases, nós examinamos se a esta proteína desempenha um papel nas propriedades semelhantes a células estaminais de células SP. No primeiro conjunto de experiências, os siRNAs para βArr1 ou os genes relacionados parr2 foram transfectados para células H1650, H1975 e A549; um siRNA alvejando não foi utilizado como controlo. Verificou-se que a transfecção transiente de βArr1 siARN específica diminuiu a frequência de células SP por aproximadamente 40 a 70%; a redução foi apenas de 10 a 20% quando parr2 siARN foi transfectado (Figura 4A); sugerindo um papel importante de βArr1 na regulação da frequência SP. Para melhor elucidar o papel de βArr1 nas funções estaminais do tipo de células SP, foram geradas células A549 que sobre-expressos de forma estável rato βArr1, ou aquelas que foram transfectadas estavelmente com um shRNA para βArr1. Verificou-se que as células que sobre-expressam de forma estável βArr1 tinha aproximadamente três células SP mais vezes, em comparação com células de controlo A549 que expressam de forma estável a GFP (GFP-A549). Por outro lado, a depleção estável de βArr1 usando um shRNA específicos (A549-shβArr1) resultou numa diminuição significativa na frequência de SP, em comparação com uma linha de células de controlo que foi estavelmente transfectada com um shRNA não segmentação (A549-Control) (Figura 4B). Real-time PCR experimentos foram conduzidos para avaliar se as mudanças na freqüência SP correlacionada com diferentes níveis de ABCG2. Verificou-se que sobre-expressam de forma estável A549 βArr1 teve duas vezes mais mensagem ABCG2 em comparação com células transfectadas com GFP. Por outro lado, as células desprovidas de βArr1 tinham significativamente inferior mensagem ABCG2 comparação com células de controlo que expressam shRNA (Figura 4C). Estes resultados foram confirmados por transferência de Western (Figura 4D); verificou-se que células nulas βArr1 tinha valores mais baixos de ABCG2 bem como βArr1, mas quantidades comparáveis de β-actina e E2F1, que foram utilizados como controlos.
(A), H1650, H1975 e as células A549 foram transfectadas com siRNA contra βArr1 e parr2. Frequência de células SP foi comparado com células não-alvo de controle siRNA transfectadas. células SP são colocados dentro da área demarcada em rosa. diagramas de barras representam a diferença vezes na frequência de células transfectadas ARNsi nas respectivas linhas celulares. (B) a frequência SP foi analisado e representado por células A549 ectopicamente expressar rat-βArr1 ou GFP e shRNA contra βArr1 ou o controlo não-alvo shRNA. (C) PCR em tempo real e (D) análise de Western-blot para expressão ABCG2 foi realizada para estas linhas de células estáveis. As células A549 (E, F, G) expressando estavelmente shRNA contra βArr1 e não-alvo shRNA foram semeadas para o ensaio de auto-renovação. (E) Fase imagens de microscopia de contraste de esferas na presença ou ausência de drogas são apresentados. (F, G) Número médio e tamanho das esferas geradas por poço a partir de 1000 células é plotado (média ± SD).
Dado o papel de βArr1 na geração de células SP, o próximo examinou se esta proteína facilita a auto-renovação também. Para este propósito, as células SP foram isolados a partir de células A549 que expressam de forma estável um shRNA contra βArr1 ou um controlo não segmentação shRNA e propriedades de auto-renovação avaliada por ensaios de formação de esfera. Verificou-se que as células com falta βArr1 teve marcadamente menor número de esferas (Figura 4E); Além disso, o tamanho das esferas formadas por células nulas βArr1 foi marcadamente mais baixos do que aqueles formados por células de SP de células de controlo (Figura 4F, L). Estas experiências mostram claramente que a proteína andaime βArr1 desempenha um papel na criação de células SP através da regulação da expressão ABCG2 e também facilita a propriedade auto-renovação destas células estaminais-como NSCLC.
Inibidor de Mcl- 1 Objectivos do crescimento auto-renovação das células SP
célula de sobrevivência melhorada e resistência às drogas é uma característica de células-tronco do câncer [10], [42]. A proteína anti-apoptótica de Mcl-1, encontra-se entre os genes amplificados mais frequentemente no cancro humano, incluindo CPNPC [22], [43], [44],. Recentemente, estudos também têm associado a função de Mcl-1 com regulação da auto-renovação das células estaminais hematopoiéticas [48], [49]. Dado o papel potencial de Mcl-1 em células estaminais hematopoiéticas, o próximo exploraram se Mcl-1 função contribui para o estabelecimento de auto-renovação das células NSCLC-SP. Como um primeiro passo, qRT-PCR foi realizada em RNA isolado a partir de células de SP e MP isolado a partir de H1650, A549 e células H1975 linhas. Mcl-1 mensagem foi expresso em níveis mais elevados em células de SP de todas as três linhas celulares (Figura 5A). O nível de proteína de Mcl-1 também foi elevada nas células SP, em comparação com células MP em todas as três linhas de células, como pode ser visto por Western blot (Figura 5B).
(A, B) A expressão relativa de Mcl-1 foi examinada em ARNm e os níveis de proteína para as linhas de células indicadas por RT-PCR e análise de western blot. (C) Estrutura de Obataoclax e seu esquema de tratamento é representado. células (D) H1650-SP foram classificados e plaqueadas para o ensaio de auto-renovação na presença ou ausência de Obatoclax na concentração indicada. Número médio de esferas geradas por poço a partir de 1000 células é plotado (média ± SD). Fase imagens de microscopia de contraste de esferas na presença ou ausência de drogas são apresentados. células SP (E) foram classificados da linha de células H1975 resistente erlotinib e plaqueadas para o ensaio de auto-renovação na presença ou ausência de fármacos indicados. Número médio de esferas por poço gerados a partir de células 1000 é traçada (média ± SD) e microscopia de contraste de fase (M) das esferas de imagens em presença ou ausência de drogas são apresentados. (G) análise de Western-blot de βArr1 e parr2 em células tratadas Obatoclax. Inibição de Mcl-1 não afectou a expressão de parr2 βArr1 e em qualquer uma das linhas celulares testadas.
Obatoclax é uma molécula hidrófoba (Figura 5C), que foi desenvolvido como um antagonista da família Bcl-2 incluindo Mcl-1 [50]. Obatoclax foi mostrado para vencer a resistência à apoptose mediada especificamente por Mcl-1 [51]. Portanto, utilizou-se aqui Obatoclax para explorar o papel de Mcl-1 em auto-renovação das células SP, através da realização de ensaios de formação de esferas, na presença ou ausência de Obatoclax. Como mostrado na Figura 5C, as células foram semeadas no dia 1 para ensaio de formação de esfera e Obatoclax foi adicionado no dia cinco e dia1 na dose indicada. Após 10 dias de plaqueamento o número de esferas foram contadas e analisadas. Tal como mostrado na Figura 5D, a inibição da actividade de Mcl-1 de 200 nM de Obatoclax demonstraram um decréscimo de 4-5 vezes no número de esferas; ainda mais o tamanho das esferas também foi significativamente reduzida como mostra a imagem de cima da barra (Figura 5D). 500 nM de concentração Obatoclax suprimiu completamente a formação de esfera (Figura 5D).
O erlotinib e gefitinib são inibidores de EGFR que mostram uma eficácia significativa no tratamento de doentes com NSCLC ancorando mutações de EGFR [52], [53]. Ao mesmo tempo, um ponto de mutação secundária do exão 20 do EGFR (T790M) está associado com resistência adquirida a inibidores de EGFR, incluindo erlotinib [52].