Abstract

Houve estudos que investigam os efeitos da radiação infravermelha de banda larga (IR) na célula cancerosa, enquanto que as influências do meio radiação -infrared (MIR) ainda são desconhecidos. Neste estudo, um emissor de MIR banda com comprimento de onda de emissão na região de 3-5 uM foi desenvolvido para irradiar células de adenocarcinoma do pulmão A549. Verificou-se que a exposição MIR inibiu a proliferação de células e alterações morfológicas induzidas pela alteração da distribuição celular de componentes do citoesqueleto. Usando PCR quantitativa, descobrimos que MIR promoveu os níveis de ATM expressão (ataxia telangiectasia mutado), ATR (ataxia-telangiectasia e Rad3-relacionados e Rad3 relacionadas com a), TP53 (proteína p53 tumor), p21 (CDKN1A, quinase dependente da ciclina inibidor 1A) e GADD45 (paragem do crescimento e dano do ADN-indutível), mas diminuiu os níveis de expressão de genes que codificam a ciclina B, CCNB1 e CCNB2, bem como CDK1 (cinase 1 dependente de ciclina). A redução dos níveis de cdc25C, ciclina B1 e a fosforilação de CDK1 na Thr-161 de expressão de proteína G em conjunto sugerem

2 /H prisão ocorreu em células A549 por MIR. reparo do DNA formação de focos de DNA quebras de cadeia dupla (DSB) marcador γ-H2AX e sensor de 53BP1 foi induzida pelo tratamento MIR, implica o MIR induzida G

2 /M parada do ciclo celular resultou de DSB. Este estudo ilustra um papel potencial para o uso de MIR em terapia de câncer de pulmão, iniciando DSB e bloquear a progressão do ciclo celular

Citation:. Chang HY, Shih MH, Huang HC, Tsai SR, Juan HF, Lee SC ( 2013) Middle radiação infravermelha Induz G parada do ciclo

2 /M celular no A549 As células do cancro do pulmão. PLoS ONE 8 (1): e54117. doi: 10.1371 /journal.pone.0054117

editor: Jasti Rao, da Universidade de Illinois College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 9 de setembro de 2012; Aceito: 06 de dezembro de 2012; Publicação: 15 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC 100-2120-M-002-014, NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3) e Taiwan Nacional Universidade Projeto Direcção investigação de ponta (10R70602C3 e 101R4000). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Neoplasia é a principal causa de morte no mundo, e cancro do pulmão é a principal causa de morte por câncer [1]. Como o hábito de fumar diminui, a incidência de câncer de pulmão se deteriorou em muitos países em conformidade [2]. Exceto de fumar, outros fatores, como o amianto, radônio ou metais pesados ​​exposições também contribuem para o câncer de pulmão [3]. Estatísticas dados de uma Agência Internacional de 2008 para a Investigação do Cancro (IARC) taxa de risco indicar que o câncer de pulmão mata cerca de 1,4 milhões de pessoas por ano em todo o mundo [4]. Devido à alta ocorrência e letalidade do câncer de pulmão, a terapia relacionada está a progredir para resolver estes problemas.

raio-x A radiação eletromagnética da radiação solar pode ser dividida em várias regiões, incluindo γ-ray,, ultravioleta (UV), luz visível, infravermelha (IR), radiação, micro-ondas e ondas de rádio. Entre a radiação solar, luz IV com comprimentos de onda que variam 0,76-1000 iM pode ser dividido em três regiões, do infravermelho próximo (NIR, 0,76-1,5 uM), média dos infravermelhos (MIR, 1,5-5,6 uM) e infravermelho distante ( FIR, 5,6-1000 | iM). Aplicações de IR têm sido amplamente estabelecida em usos diários e propósitos clínicos, incluindo microcirculação cutânea, cicatrização de feridas, sensores de gás, e medição de temperatura remoto [5].

Estudos anteriores indicaram que NIR desencadeada uma resposta de sinalização mitocondrial retrógrada resultando ROS matriz mediada metaloproteinase-1 (MMP-1) a produção via proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) via [6]. Também mostrou que o NIR protegido de fibroblasto dérmico humano a partir citotoxicidade induzida por UV através da indução de Hsp27 que impede apoptossomo montagem, um evento inicial de apoptose [7], [8].

In vivo

estudos demonstraram que NIR aumentada do factor de crescimento angiogénico indutor endotelial vascular e diminuiu o inibidor angiogénico trombospondina-2, iniciando a angiogénese cutânea na pele humana [9]. Além disso, a exposição de FIR promoveu a angiogénese em células endoteliais microvasculares humanas juntamente com a activação de p38 e extracelular sinal quinase regulada sinalização [10], circulação reforçada do sangue na pele [11], [12] e exerceu uma actividade anti-inflamatória no endotélio vascular [13]. Ele também relatou que FIR inibiu a proliferação celular através do aumento da expressão do fator AMP cíclico dependente de transcrição (ATF) 3 em células cancerosas cujo basal expressão nível de proteína de choque térmico (HSP) 70A eram baixos [14], [15].

Os efeitos do MIR em células cancerosas, no entanto, permanecem desconhecidos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do MIR com banda de comprimento de onda no 3-5 mm regimes sobre as células cancerosas altamente proliferaram. Para este fim, desenvolveu-se um emissor de MIR e o comprimento de onda limitado MIR de 3 a 5 um. Uma vez que o molecular C-H, ligações N-H e O-H pode ser animado para gerar vibrações de alongamento por 3-5 uM de infravermelhos, espera-se que a reacção bioquímica importante será afectada por irradiação de infravermelhos, com comprimentos de onda neste intervalo [16]. Nós revelou que MIR reduziu a viabilidade celular, causou mudanças significativas na organização do citoesqueleto, e induziu G

2 /M parada do ciclo celular que pode ser contribuído por indução de quebras de dupla vertentes (DSB) no DNA ao longo do /ATR-p53 ATM -p21 eixo.

resultados

o comprimento de onda da MIR foi constrangido a 3-5 mm ea temperatura do meio de cultura foi consistente a 37 ° C

a grande corpo negro banda fonte foi fabricado para fornecer banda larga MIR e definir em uma câmara de metal para evitar a perturbação do ambiente (Figura 1). Com o aumento da temperatura de aquecimento, a potência de emissão do substrato de silício foi elevada de modo correspondente. A intensidade da radiação foi definido para 3 mW /cm

2, ajustando a temperatura de aquecimento e medir a magnitude de medidor de energia THORLAB PM100D. Para eliminar os efeitos de calor de MIR, definimos o aparelho de reciclagem mais frio a 28 ° C, para arrefecer o ar na câmara onde fornecida a fonte MIR, assim, manter a temperatura do meio de cultura a 37 ° C. A disposição do aparelho é mostrado na Figura 1B.

(A) A vista lateral do corpo negro vasta fonte banda. (B) Diagrama esquemático mostrando a configuração para o experimento irradiação MIR. As células foram plaqueadas em placas de 12 poços e cultivadas num incubador com 100% de humidade, a 37 ° C e com 5% de CO

2.

A proliferação celular de células A549 permaneceram inalterados no MIR Exposed

médio

para distinguir se os efeitos de MIR ocorreu directamente em células cultivadas ou indirectamente através da alteração da forma da célula, o meio de cultura foi exposta à MIR durante 48 horas antes da sua adição à cultura de células. Após células A549 (2 × 10

4 culas por po) foram semeadas numa placa de 12 poços, substituímos o meio de cultura com meio de MIR-expostos e não expostos durante mais 48 horas e, em seguida, determinada a viabilidade das células pelo ensaio MTT. Observou-se que a proliferação celular de células A549 não foi significativamente alterada sob médio MIR-exposta em comparação com meio não exposta (Figura S1). A partir daqui, foi aplicado um período de 48 horas de exposição para as células para todos os experimentos, a menos que especificado em contrário.

MIR inibiu a proliferação celular e alterou a morfologia das células A549

Para investigar o efeito de MIR em células de cancro, células de adenocarcinoma do pulmão A549, foram utilizadas para avaliar a citotoxicidade de MIR e os fibroblastos pulmonares normais MRC-5 foram testados para comparação. As células (2 x 10

4) foram plaqueadas em placas de cultura de 12 poços durante a noite antes da exposição MIR. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT e contagem celular com azul de tripano com base após a exposição MIR. Os resultados indicaram que a proliferação de células A549 foi suprimida de forma significativa pela exposição MIR durante 48 horas (Figura 2A), enquanto que o crescimento e morfologia de células MRC-5 não foram afectados pelo tratamento MIR (Figura S2A, S2B). Curiosamente, que revelou alterações morfológicas das células A549 por exposição MIR. Observou-se que as células A549 foram expostas MIR-mais arredondada em forma, aumentada em tamanho, e formado um avental sob radial de contraste de fase de exame microscópico (Figura 2B). Os resultados implicam que o miR pode regular a dinâmica do citoesqueleto, que determina a morfologia das células.

(A) Os números de células foram medidos aos 0, 24 e 48 horas após a exposição MIR usando azul de tripano e um hemocitómetro. Os números de células médios de controle (não exposto) e tratamentos de exposição MIR foram expressos como médias ± DP de três experiências independentes. **

P Art 0,01. (B) imagens de células foram observadas por microscopia de contraste de fase após 48 horas de exposição MIR. As setas indicam os aventais radiais de células aumentadas. barra de escala representa 50 um.

MIR Exposição Activated da Recuperação de filamentos de actina, Vinculina e microtúbulos

O citoesqueleto desempenha um papel importante na regulação da forma da célula [17], [18] , e ambos os filamentos de actina e microtúbulos são conhecidos por afectarem a formação e distribuição de adesões focais de células [17], que determinam a morfologia celular e a motilidade. Para distinguir os efeitos da MIR no citoesqueleto, foi realizada a coloração de imunofluorescência para examinar se as duas componentes importantes do citoesqueleto, os filamentos de actina e microtúbulos, bem como a molécula de adesão focal vinculina envolvidos nesta mudança morfológica. Os resultados mostraram que o miR induziu um decréscimo significativo em F-actina contendo fibras de stress, tal como determinado por coloração com faloidina marcada com rodamina (Figura 3). Além disso, os filamentos de actina exibiu uma malha densa de acordo não polarizada e a vinculina foi agregado à volta da periferia de células em células MIR-expostas (Figura 3), o que implica que o miR podem inibir a migração de células através da regulação da reorganização dos filamentos de actina e de distribuição de vinculina [ ,,,0],19]. Por outro lado, os microtúbulos estavam distribuídos nas regiões citoplasmáticas perinucleares MIR após o tratamento (Figura 4). Esta distribuição específica de fragmentos de microtúbulos irregulares sugere que o miR poderia causar L

2 /H paragem do ciclo celular, como demonstrado anteriormente [20], [21].

As células foram semeadas em lamelas de vidro em placas de 12 poços , exposto a MIR durante 48 horas, fixado para a coloração e visualizadas por microscopia de fluorescência. filamentos de actina foram marcados com faloidina marcada com rodamina (vermelho), vinculin foi marcada com anticorpo anti-vinculin mouse eo correspondente FITC anticorpo secundário conjugado IgG anti-rato (verde), e os núcleos foram coradas com DAPI (azul). A barra de escala representa 10 um. As setas indicam a posição de vinculina.

As células foram semeadas em lamelas de vidro em placas de 12 poços, expostas a MIR durante 48 horas, fixado para a coloração e visualizadas por microscopia de fluorescência. Os microtúbulos foram marcadas com anticorpo α-tubulina e o correspondente conjugado com FITC anticorpo secundário (verde), e os núcleos foram marcadas com DAPI (azul). barra de escala representa 10 mm.

MIR Exposição regulamentado o Nível de mRNA expressão de G

2 /M genes regulados em células A549

Uma vez que a distribuição de citoesqueleto implicam um possível papel de MIR na regulação da progressão do ciclo celular, é crítico para examinar a expressão de genes envolvidos em G

transição 2-H foram ainda seleccionados para ser validado. O ponto de controlo do ciclo L

2 /H célula responde a danos no ADN e envolve a activação de ataxia-telangiectasia mutada (ATM) e ataxia-telangiectasia e proteínas relacionadas com Rad3 (ATR) [22]. Ambos ATM e ATR activar p53 por fosforilação de Ser15 em resposta a danos no ADN, aumentando, assim, a transcrição de paragem do crescimento e o gene induzível danos no ADN (GADD45) e p21, que são necessárias para inibir a expressão dos principais reguladores do G

2 /H transição, quinase dependente de ciclina uma (CDK1) e da ciclina B [23], [24], [25], [26]. A expressão de genes envolvidos na indução de G

2 /H detenção foram aumentados em células A549 tratadas com MIR, incluindo ATM, ATR, p53, GADD45A, GADD45B, e p21 (Figura 5A). Em contraste, os níveis de CDK1, CCNB1 e CCNB2 expressão de ARNm foram diminuiu após a exposição MIR (Figura 5A). Os resultados demonstram que a exposição MIR activa as expressões de ATM, ATR, p53, p21 e os genes em resposta a danos no ADN e regula os genes para controlar L

2 /H progressão do ciclo celular.

As células foram expostas para MIR por 48 h, e colhidas para RNA e extração de proteínas. (A) A expressão génica de genes envolvidos na regulação de G

2 /H transição (eixo x). O eixo dos y indica as quantidades relativas de transcritos calculados usando o método ΔΔCt com GAPDH como gene de referência amplificado a partir de cada amostra. Os dados são apresentados como a média ± S.D. (

n

= 3). *

P Art 0,05, **

P Art 0,001. (B) os níveis de expressão das proteínas foram analisados ​​por Western blot com a actina como controlo interno. Todas as experiências foram repetidas três vezes. (C) citometria de fluxo e conteúdo de DNA. As células foram expostas a MIR durante 48 h. As células de seis experiências independentes foram recolhidos para análise da distribuição do ciclo celular. (D) A porcentagem de células em cada fase foi obtida por análise multicycle.

MIR Exposição aboliu a expressão de Cdc25C e ciclina B1, e diminuiu a fosforilação de CDK1

A célula a progressão do ciclo da L

2 a fase M é regulado por activação da CDK1, cuja actividade depende da coordenação com ciclina B [27], [28]. A activação do complexo de CDK1 /ciclina B é mantida através da fosforilação em Thr161 e desfosforilação em Thr14 e Tyr15 da CDK1 [27], [28]. A desfosforilação dos resíduos Thr14 e Tyr15 em CDK1 é catalisada por fosfatase Cdc25C. Ele é considerado como um passo limitante da velocidade para G

2, a entrada em mitose [27], [29]. Considerando o papel do complexo B CDK1 /ciclina e Cdc25C na regulação L

2 a transição de fase M, avaliou-se a exposição MIR alterado a expressão da proteína de CDK1, ciclina B1, e Cdc25C, bem como a fosforilação de CDK1. Os resultados mostraram que a fosforilação da proteína CDK1 em Thr161 e os níveis de ciclina B1 e Cdc25C foram todos reduzidos em células tratadas com MIR (Figura 5B). Ele indica que a exposição MIR induziu uma típica G

2 /M do ciclo celular prisão em células A549, regulando ciclina B1 e expressão Cdc25C, e fosforilação CDK1.

MIR Exposição Resultou em paragem do ciclo celular em G

2 /M Fase

a seguir, analisou se a distribuição do ciclo celular de A549 foram afetados pela irradiação MIR. Para obter o teor de ADN, foi realizada por citometria de fluxo para analisar células marcadas com PI. Os resultados mostraram que as células em G

2 população /M foram aumentadas sob exposição MIR. Coordenadamente, o G

2 /M reguladores ambos foram ativados em seus níveis de transcrição, translação e pós-traducionais, levando ao acúmulo de células em G

2 /M fase.

MIR Exposição Provocado co-localização de 53BP1 e γ-H2AX Nuclear Focos em resposta a espécies reativas de oxigênio (ROS) danos de DNA mediada

Desde MIR activado o eixo /ATR-p53-p21 ATM que é a via de danos no DNA checkpoint, é fundamental para investigar se o MIR causados ​​danos no ADN em células A549. Estudos anteriores mostraram que a proteína de ligação supressora de tumor p53 (53BP1) e γ-H2AX participar no DNA da via de sinalização de danos ATM-dependente e formam focos nuclear em resposta à radiação ionizante causados ​​danos no ADN [30], [31]. Para examinar esta, células A549 foram fixadas com acetona e coradas para 53BP1 e γ-H2AX após exposição MIR. Exibimos que 53BP1 (Figura S3A) e γ-H2AX (Figura S3B) foram dispersa localizada no núcleo das células não expostas, mas formou numerosos distinto focos subnuclear em resposta a MIR. Também demonstramos que os focos 53BP1 e γ-H2AX foram co-localizada em nucei de MIR células expostas. A formação e a co-localização de focos 53BP1 /γ-H2AX foi diminuída após o pré-tratamento ou co-tratamento de 10 mM de ROS eliminador de NAC (Figura 6). Nós podemos postular que o miR induzida L

2 /H paragem do ciclo celular pode resultar de danos no ADN mediada por ROS de que os marcadores de dano 53BP1 e y-H2AX focos foram observados neste estudo.

As células foram semeadas sobre a lamela de vidro na placa de 12 poços, a exposição por MIR durante 48 horas na presença ou ausência de 10 mM de N-acetil-cisteína (NAC). As células foram tratadas com NAC durante 1 h antes da exposição MIR (NAC 1 h) ou cotreated toda a exposição durante 48 h (NAC). As células foram fixadas para a coloração e visualizadas por microscopia de fluorescência. 53BP1 foi marcada com anticorpo de coelho anti-53BP1 e correspondeu com FITC-conjugado de anticorpo anti-IgG de coelho (verde), γ-H2AX foi marcada com anticorpo anti-γ-H2AX rato seguinte correspondido anticorpo IgG anti-ratinho conjugado com PE (vermelho), e os núcleos foram marcadas com DAPI (azul). barra de escala representa 10 mm.

Discussão

Uma vez que as alterações moleculares envolvidas na regulação da progressão do ciclo celular são acompanhados por um fracasso para prender a proliferação em células cancerosas, a inibição da proliferação celular, interferindo com o ciclo celular é uma abordagem promissora para a terapia anti-cancro. Neste estudo, observou-se que a exposição MIR pode inibir a proliferação de células A549 (Figura 2A), e também levar a um avental alargada, radial e a morfologia das células forma arredondada (Figura 2B), afectando a disposição e a distribuição dos filamentos de actina (Figura 3), de adesão focal (Figura 3), e os microtúbulos (Figura 4). A distribuição fragmentada perinuclear dos microtúbulos é consistente com a morfologia celular observadas durante L

2 /H paragem do ciclo celular, o qual foi ainda validado por análise da distribuição do ciclo celular, a expressão do gene e proteína de regulação de reguladores do G

2 /ponto de verificação M (Figura 5). Em avançado, também demonstrou que o miR poderia induzir a formação de e co-localização 53BP1 e focos nuclear γ-H2AX (Figura 6), em resposta a danos no ADN que normalmente activa via ATM /ATR-p53-p21, resultando L

2 /células M a paragem do ciclo.

MIR é a parte da luz da radiação solar, que pode causar danos no ADN por excitação directa do ADN ou indirecta mecanismo que envolve excitação de outros cromóforos celulares [32]. O processo de excitação directa é causada pela radiação de comprimento de onda curto, como UVB (280-315 nm) e UVC (100-280 nm) e leva na sua maioria para gerar dímeros de pirimidina ciclobutano e fotoprodutos, que são produzidos por absorção de radiação por ADN [32 ]. Por outro lado, o mecanismo indirecto é contribuído por espécies de oxigénio reactivas (ROS) que é gerado pelo fotossensibilizador endógenos. O dano do ADN é indirecta causada pela radiação de comprimento de onda mais longo acima de 320 nm, tal como radiação UVA (315-400 nm) e luz próximo do visível, no qual o ADN absorve apenas fracamente [33], [34]. A radiação com comprimento de onda mais longo, assim, é absorvido por fotossensibilizadores para gerar ROS. Após a absorção de luz UVA, fotossensibilizador endógeno passar para um estado triplete e transferir a energia para gerar oxigênio singlete [35]. Estes UVA irradiadas fotossensibilizadores incluem flavinas [36], NADH /NADPH [37], ácido urocânico [38] e alguns esteróis [39]. Devido à semi curto espaço de tempo em células, o oxigénio atómico só está presente após a radiação [40]. No entanto, ROS pode ser apresentada por um período prolongado após exposição à radiação uma vez que a ROS adicional pode ser produzido pela espécie inicial [41]. O radical ânion superóxido (

• O

2

-), peróxido de hidrogênio (H

2O

2), e radical hidroxila (

• OH) são pertencia ao grupo ROS, todos os quais podem ser gerados pelo mecanismo endógeno como subprodutos da actividade mitocondrial normal ou o stress exógeno [42].

Uma vez que a tensão induzida exógeno nível ROS são dramaticamente mais elevada do que a célula pode eliminar, o stress oxidativo e ocorre resulta em dano oxidativo ao DNA por ligações cruzadas DNA proteínas, base e açúcar modificação, depurinação ou deprimidination [43], [44], [45], [46], [47]. O dano oxidativo ao DNA induzido por ROS podem desencadear respostas checkpoint do ciclo celular, incluindo o recrutamento de 53BP1 e γ-H2AX seguido por degradação do Cdc25C de G

2 /M detenção como observamos, portanto, fornece um tempo adicional para a reparação do ADN [48], [49]. Além disso, NIR, foram encontrados para gerar derivados de ROS mitocondrial, e citocromo

C

oxidase ter sido sugerido como um possível fotorreceptores [6], [50]. As evidências sugerem que o IR poderia acelerar a reação de fosforilação oxidativa na mitocôndria por irradiação fotorreceptores, tais como citocromo c oxidatse e NADH. A taxa aumentada na fosforilação oxidativa gera maior ROS contribui para danos indiretos em DNA.

Neste estudo, verificou-se que a exposição MIR suprimiu o nível de proteínas de Cdc25C e ciclina B1, e inibiu a fosforilação de CDK1. Regulação negativa de cdc25C iria bloquear a activação de CDK1, resultando na dissociação de ciclina B1 e prevenção da progressão do ciclo celular a partir de G

2 a fase M. Além disso, exibiu que 53BP1 andγ-H2AX formar inúmeros focos subnuclear em resposta ao tratamento MIR. 53BP1 participa na ADN via de sinalização de danos ATM-dependente e forma focos nuclear em resposta à radiação ionizante causados ​​danos no ADN [30], [31], enquanto γ-H2AX facilita o recrutamento de uma série de proteínas de resposta de dano, tal como BRCA1, MDC1 e RAD51 para reparação do DNA [51], [52]. É possível que a exposição MIR induzida L

2 /H detenção é causada por danos no ADN, embora o comprimento de onda de MIR está perto de NIR que é difícil de causar danos directos no ADN. Aqui, postulamos que a exposição MIR pode ser absorvido pelo fotossensibilizador endógeno elevando ROS e causando dano oxidativo ao DNA.

Estudos anteriores mostraram que o peróxido de hidrogênio induzida G

2 /M do ciclo celular prisão e influenciou a organização de microtúbulos e filamentos de actina sobre a capacidade de retransmitir para reduzir as proteínas do citoesqueleto oxidado ou equilíbrio de interrupção tiol [51], [52], [53]. O peróxido de hidrogênio aumentou tubulina monomérico, mas diminuiu a tubulina polimerizada sugerindo peróxido de hidrogênio causou despolimerização dos microtúbulos. Neste estudo, a exposição MIR causou a distribuição perinuclear e densamente agregação de microtúbulos diminuindo assim a redes de microtúbulos. Esta observação é semelhante ao microtúbulo específica de drogas, tais como alcalóides da vinca [54]. A distribuição perinuclear dos microtúbulos implica que a exposição MIR pode induzir estresse oxidativo, assim, redes microtúbulos perturbadoras.

Neste estudo, verificou-se que a exposição MIR induzida DNA danos resposta. Estudos anteriores mostraram que focos nuclear γ-H2AX foi encontrado para ser co-localizada com proteínas de reparo envolvidas na recombinação homologia e-juntando nonhomologousend (NHEJ) [55]. Outras proteínas de reparação, incluindo MCD1 /NFBD1 e 53BP1, também foram documentadas para interagir com γ-H2AX para formar focos nuclear [56]. Relatórios anteriores demonstraram que as mudanças conformacionais na 53BP1 é causada por fosforilação de 53BP1 pelo ATM expondo, assim, o domínio de ligação da cromatina que participa directamente na reparação de DSB de ADN pela activação de ADN-ligase IV /XRCC4 complexo na via NHEJ [57]. Neste estudo, verificou-se que a exposição MIR formado focos nuclear de 53BP1 e γ-H2AX (Figura 6) implica que a exposição MIR induzem a reparação do ADN em resposta ao dano DAN.

Em resumo, este estudo mostra MIR do comprimento de onda de 3-5 uM pode alterar a organização do filamento de actina, microtúbulos e vinculina, e causar inibição sobre a progressão do ciclo celular através da activação do eixo ATM /ATR-p53-p21 em resposta a danos no ADN, também a via de Cdc25C regulação em paralelo resultando assim na regulação negativa da desfosforilação na CDK1 e ciclina B. em particular, o nosso estudo mostra a primeira evidência sobre o efeito inibitório do MIR em células de câncer de pulmão e fornece informações úteis para a terapia do cancro.

Materiais e Métodos

Médio de radiação infravermelha (MIR) Emissor

o comprimento de onda de MIR gerada a partir da fonte de largura de banda de corpo negro foi limitado no intervalo entre 3 e 5 um através da utilização de um 3-5 ^ M de passagem de banda de safira bolacha (SingHuang Tecnologia Co., Ltd., Taipei, Taiwan) (Figura 1A). O filtro passa banda larga foi concebido para isolar 3-5 uM janelas atmosféricas com um diâmetro de 25,4 mm ± 0,1%. A redução de 50% em /pontos de corte de transmissão foram fixadas em 3,0 uM ± 4% e 5,0 uM ± 4%, respectivamente. O filtro exibiu transmissão médio na banda de passagem maior do que 60% e menos do que 0,1% de transmissão de níveis de fora da banda de passagem. Um filme de 300 nm de espessura de molibdénio foi depositada por deposição de plasma no lado traseiro de um substrato de silício do tipo n, como uma fonte de aquecimento (Figura 1A). A intensidade da radiação foi medido pelo medidor de energia THORLAB PM100D ser 3 mW /cm

2. Para manter a temperatura da cultura de células, reciclar máquina de refrigerador foi regulado para manter a temperatura do meio de cultura a 37 ° C como mostrado na Figura 1B. As células cultivadas em 12 placas de cultura de tecido de poços (Corning Costar, Corning, NY, EUA) antes de 24 horas de exposição de IV foram colocados sobre o filtro, como indicado na figura 1B.

Cultura celular

Humana células epiteliais de pulmão A549 (ATCC, CCL-185) e células de fibroblastos de pulmão fetal humano MRC5 (ATCC, CCL-171) foram obtidos de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As células A549 foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). As células MRC5 foram cultivadas em Meio Mínimo Essencial (Gibco) suplementado com piruvato de sódio 1 mM (Gibco), 0,1 mM de ácido não-amino essencial (Gibco), e 10% de soro fetal bovino (Gibco). Ambas as linhas celulares estavam isentos de micoplasma, como detectado por um método baseado em PCR e cultivadas a 37 ° C com 5% de CO

2.

A coloração de imunofluorescência

As células A549 foram semeadas sobre o vidro lamela em 12 poços da placa de cultura, em cultura durante um dia, e exposta por MIR ou cultivadas no escuro durante mais 48 h. As células foram fixadas e permeabilizadas com o pré-arref ecimento de acetona durante 5 min a -20 ° C e, em seguida, incubadas com BSA a 1% (Bioshop, Burlington, ON, Canadá) em PBS como tampão de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente. Subsequentemente, as células foram marcadas com anticorpo monoclonal de rato anti-tubulina (Millipore, Billerica, MA, EUA; 1:1000), anticorpo monoclonal de ratinho anti-vinculina (Millipore; 1:200), anticorpo anti-53BP1 policlonal de coelho (GeneTex, San Antonio, TX, EUA; 1:500), ou mouse anticorpo anti-γ-H2AX (Abcam, Cambridge, MA, EUA; 1:500) a 4

oC durante a noite. Depois de lavada com PBST (PBS contendo 0,05% de Tween-20, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA), três vezes, as células foram marcadas com os correspondentes secundário anti-IgG de ratinho-Alexa 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA; 1:1000 ), anti-IgG de ratinho-PE (Abcam; 1:1000), ou anti-coelho secundário FITC-IgG (Millipore; 1:200) durante 1 hora no escuro à temperatura ambiente. As células marcadas com anticorpo anti-vinculina foram contra-coradas com TRITC-faloidina conjugada (Millipore; 1:1000) durante 15 min no escuro à temperatura ambiente. As células foram então lavadas com PBST três vezes e montado com o reagente ProLong® ouro com DAPI (Invitrogen). As imagens foram adquiridas por microscópio de fluorescência com o plano Leica HCX FL 100 × /1,25 objectivo óleo usando uma câmera SPOT (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, EUA) e software avançado SPOT (Diagnostic Instruments).

A viabilidade celular Assay

2 × 10

4 células foram semeadas em placas de 12 poços por cavidade e deixadas a ligar durante a noite antes da exposição MIR. O pó de MTT (brometo de 3 [4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio, Sigma-Aldrich) foram preparadas como estoque em PBS a uma concentração de 5 mg /mL e é filtrada. Depois de exposta por MIR durante 48 h, 150 ul de solução de MTT foram adicionados a cada poço. As células foram incubadas a 37 ° C durante 3 horas até que o cristal formado violar. cristais de formazan foram dissolvidos com 500 ul de dimetilsulfóxido (DMSO, Scharlau Chemie, Barcelona, ​​Espanha) e agitou-se evitado a partir de luz durante 15 min para solubilizar completamente os cristais. A absorvância foi medida a 570 nm num leitor de ELISA (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). Todas as experiências foram repetidas três vezes.

Extração de RNA e Transcrição Reversa

O ARN total foi isolado utilizando o reagente TRIzol (Invotrogen) após 48 h de exposição. Em resumo, 400 mL de TRIzol reagente (Invitrogen) foi adicionado a cada poço da placa de 12 poços TC uma vez que o meio foi removido. Foram coletadas amostras de três experiências independentes e armazenadas a -80

oC. A extracção de ARN foi realizada de acordo com o manual, e a concentração de ARN e qualidade foram determinados por NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Montchanin, DE, EUA). mRNA foram reverstranscripted por RevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA). 1 ug de ARN total foi misturado oligo (dT)

18 iniciador e desnaturado. Subsequentemente, a amostra de ARN foi misturada com tampão de reacção 5X, dNTP, RNase RiboLock ™ inibidor e RevertAid ™ H Minus transcriptase reversa. A reacção de transcrição reversa foi realizada em 42

oC durante 60 min e terminadas a 70

oC durante 5 min. O produto de transcrição reversa foi directamente utilizado na amplificação de PCR ou armazenado a -20

oC.

PCR em tempo real

Os iniciadores específicos para o gene para a PCR em tempo real foram concebidos por Beacon Designer 7 programa (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, EUA) e as sequências estão listadas na Tabela 1. em tempo real quantitativa de PCR foi realizada utilizando SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) durante 40 ciclos de amplificação em um IQ5 iCycler ™ real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). quantidades de transcritos relativos foram calculados usando o método ΔΔCt (ciclo limite) com GAPDH como gene de referência amplificado a partir das amostras. Todas as reacções foram corridas em triplicado.

Extracção de proteínas e Western Blotting

Após a exposição MIR durante 48 h, a proteína total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante. A proteína foi solubilizado em tampão de lise (ureia 7 M (Boehringer, Mannheim, Alemanha), 2 M tioureia, 4% CHAPS (JT Baker, Phillipsburg, NJ, EUA) e 0,002% de azul de bromofenol (Amersco, Solon, OH, EUA)) e a concentração de proteína foi determinada pelo método BCA (Pierce Biotech Inc., Rockford, IL, EUA).